CXCR4 and MIF are required for neutrophil extracellular trap release triggered by Plasmodium-infected erythrocytes.

Neutrophil extracellular traps (NETs) evolved as a unique effector mechanism contributing to resistance against infection that can also promote tissue damage in inflammatory conditions. Malaria infection can trigger NET release, but the mechanisms and consequences of NET formation in this context remain poorly characterized. Here we show that patients suffering from severe malaria had increased amounts of circulating DNA and increased neutrophil elastase (NE) levels in plasma. We used cultured erythrocytes and isolated human neutrophils to show that Plasmodium-infected red blood cells release macrophage migration inhibitory factor (MIF), which in turn caused NET formation by neutrophils in a mechanism dependent on the C-X-C chemokine receptor type 4 (CXCR4). NET production was dependent on histone citrullination by peptidyl arginine deiminase-4 (PAD4) and independent of reactive oxygen species (ROS), myeloperoxidase (MPO) or NE. In vitro, NETs functioned to restrain parasite dissemination in a mechanism dependent on MPO and NE activities. Finally, C57/B6 mice infected with P. berghei ANKA, a well-established model of cerebral malaria, presented high amounts of circulating DNA, while treatment with DNAse increased parasitemia and accelerated mortality, indicating a role for NETs in resistance against Plasmodium infection.

Interaction between bradykinin B2 and Ang-(1-7) Mas receptors regulates erythrocyte invasion by Plasmodium falciparum.

BACKGROUND: The molecular mechanisms involved in erythrocyte invasion by malaria parasite are well understood, but the contribution of host components is not. We recently reported that Ang-(1-7) impairs the erythrocytic cycle of P. falciparum through Mas receptor-mediated reduction of protein kinase A (PKA) activity. The effects of bradykinin (BK), a peptide of the kallikrein-kinin system (KKS), can be potentiated by Ang-(1-7), or angiotensin-converting enzyme (ACE) inhibitors, such as captopril. We investigated the coordinated action between renin-angiotensin system (RAS) and KKS peptides in the erythrocyte invasion by P. falciparum. METHODS: We used human erythrocytes infected with P. falciparum to assess the influence of RAS and KKS peptides in the invasion of new erythrocytes. RESULTS: The inhibitory effects of Ang-(1-7) were mimicked by captopril. 10(-8)M BK decreased new ring forms and this effect was sensitive to 10(-8)M HOE-140 and 10(-7)M A779, B2 and Mas receptor antagonists, respectively. However, DALBK, a B1 receptor blocker, had no effect. The inhibitory effect of Ang-(1-7) was reversed by HOE-140 and A779 at the same concentrations. Co-immunoprecipitation assay revealed an association between B2 and Mas receptors. BK also inhibited PKA activity, which was sensitive to both HOE-140 and A779. CONCLUSIONS: The results suggest that B2 and Mas receptors are mediators of Ang-(1-7) and BK inhibitory effects, through a cross-signaling pathway, possibly by the formation of a heterodimer. GENERAL SIGNIFICANCE: Our results describe new elements in host signaling that could be involved in parasite invasion during the erythrocyte cycle of P. falciparum.

New linear antiplasmodial peptides related to angiotensin II.

BACKGROUND: Antiplasmodial activities of angiotensin II and its analogues have been extensively investigated in Plasmodium gallinaceum and Plasmodium falciparum parasite species. Due to its vasoconstrictor property angiotensin II cannot be used as an anti-malarial drug. METHODS: This work presents the solid-phase syntheses and liquid chromatography and mass spectrometry characterization of ten linear peptides related to angiotensin II against mature P. gallinaceum sporozoites and erythrocyte invasion by P. falciparum. Conformational analyses were performed by circular dichroism. IC50 assays were performed to identify the ideal concentration used on the biological tests and haemolytical erythrocytic assays were made to verify the viability of the biological experiments. The contractile responses of the analogues were made to evaluate if they are promising candidates to be applied as antiplasmodial drugs. RESULTS: The results indicate two short-peptides constituted by hydrophobic residues (5 and 6) with antiplasmodial activity in these models, 89 and 94 % of biological activity against P. gallinaceum sporozoite, respectively, and around 50 % of activity against P. falciparum. Circular dichroism spectra suggested that all the peptides adopted ß-turn conformation in different solutions, except peptide 3. Besides the biological assays IC50, the haemolysis assays and contractile response activities were applied for peptides 5 and 6, which did not present expressive results. CONCLUSIONS: The hydrophobic portion and the arginine, tyrosine, proline, and phenylalanine, when present on peptide primary sequence, tend to increase the antiplasmodial activity. This class of peptides can be explored, as anti-malarial drugs, after in vivo model tests. Graphical abstract: The most active peptide presented 94 % activity on P. gallinaceum sporozoites and 53 % inhibited P. falciparum ring forms invasion.

Infection of retinal epithelial cells with L. amazonensis impacts in extracellular matrix proteins.

One of the manifestations of leishmaniases is eye injuries which main characteristics are the injury of the anterior chamber of the eye and the resistance to specific treatments. The retinal pigment epithelial (RPE) cells participate in pathogen-induced intraocular inflammatory processes. We investigated Leishmania amazonensis-RPE cells relationship and its impact in laminin and fibronectin production. Using RPE cell (ARPE-19), we demonstrated that L. amazonensis adhere to these cells in the first hour of infection, whereas parasite internalization was only observed after 6 h. Seventy-two hours after infection, vacuoles with parasites debris were observed intracellularly, and no parasite were observed intra- or extracellularly at the 96 h, suggesting that Leishmania can infect ARPE-19 cells although this cells are able to clear the infection. Fibronectin and laminin were associated with L. amazonensis-ARPE-19 interaction. Confocal analysis showed no substantial alterations in fibronectin presence in ARPE-19-infected or ARPE-19-noninfected cells, whereas laminin levels increased three times 10 h after L. amazonensis infection. After this time, laminin levels decreased in infected cells. These results suggest that L. amazonensis-ARPE-19 infection induces increased production of laminin in the beginning of infection which may facilitate parasite-host cell interactions.

Regulation of extracellular ATP in human erythrocytes infected with Plasmodium falciparum.

In human erythrocytes (h-RBCs) various stimuli induce increases in [cAMP] that trigger ATP release. The resulting pattern of extracellular ATP accumulation (ATPe kinetics) depends on both ATP release and ATPe degradation by ectoATPase activity. In this study we evaluated ATPe kinetics from primary cultures of h-RBCs infected with P. falciparum at various stages of infection (ring, trophozoite and schizont stages). A "3V" mixture containing isoproterenol (ß-adrenergic agonist), forskolin (adenylate kinase activator) and papaverine (phosphodiesterase inhibitor) was used to induce cAMP-dependent ATP release. ATPe kinetics of r-RBCs (ring-infected RBCs), t-RBCs (trophozoite-infected RBCs) and s-RBCs (schizont-infected RBCs) showed [ATPe] to peak acutely to a maximum value followed by a slower time dependent decrease. In all intraerythrocytic stages, values of ΔATP1 (difference between [ATPe] measured 1 min post-stimulus and basal [ATPe]) increased nonlinearly with parasitemia (from 2 to 12.5%). Under 3V exposure, t-RBCs at parasitemia 94% (t94-RBCs) showed 3.8-fold higher ΔATP1 values than in h-RBCs, indicative of upregulated ATP release. Pre-exposure to either 100 µM carbenoxolone, 100 nM mefloquine or 100 µM NPPB reduced ΔATP1 to 83-87% for h-RBCs and 63-74% for t94-RBCs. EctoATPase activity, assayed at both low nM concentrations (300-900 nM) and 500 µM exogenous ATPe concentrations increased approx. 400-fold in t94-RBCs, as compared to h-RBCs, while intracellular ATP concentrations of t94-RBCs were 65% that of h-RBCs. In t94-RBCs, production of nitric oxide (NO) was approx. 7-fold higher than in h-RBCs, and was partially inhibited by L-NAME pre-treatment. In media with L-NAME, ΔATP1 values were 2.7-times higher in h-RBCs and 4.2-times higher in t94-RBCs, than without L-NAME. Results suggest that P. falciparum infection of h-RBCs strongly activates ATP release via Pannexin 1 in these cells. Several processes partially counteracted ATPe accumulation: an upregulated ATPe degradation, an enhanced NO production, and a decreased intracellular ATP concentration.

Estudo da infecção ocular experimental por Leishmania (Leishmania) amazonensis in vivo no modelo murino e in vitro em células do epitélio pigmentado da retina humana - ARPE- 19 / Study of the experimental ocular infection for Leishmania (Leishmania) amazonensis in alive in the murino model and in vitro in cells from human retinal pigmented epithelium - ARPE- 19

Leishmanioses são doenças causadas por diferentes espécies de protozoários do gênero Leishmania. Segundo a Organização Mundial da Saúde estão presentes em 88 países e permanecem como um grave problema de saúde pública. A doença se manifesta em diversas formas clínicas: leishmaniose cutânea, cutânea difusa, muco-cutânea e visceral. Entre os sinais clínicos observados, as lesões oculares aparecem com uma freqüência de 0,4por cento nos casos de leishmaniose cutânea humana e em cães este índice é superior a 15por cento podendo chegar a 80por cento. O presente trabalho objetivou estudar a infecção ocuar experimental pela L. (L.) amazonensis in vivo, nos camundongos C57BL/10 e BALB/c, e in vitro em células do epitélio pigmentado da retina humana (ARPE-19). Os animais foram infectados por instilação ocular intravitrealmente com L. (L.) amazonensis e o curso da infecção foi acompanhado a cada 30 dias por três meses. A cada 30 dias, 3 animais de cada grupo foram eutanasiados para a retirada do soro, pálpebras e bulbo ocular. Os tecidos foram processados para histologia convencional e os soros armazenados para dosagem de anticorpos. Nos experimentos in vitro, as células ARPE-19 foram cultivadas e fixadas após 1, 6, 10, 24, 48, 72 e 96 horas após infecção por L. (L.) amazonensis, para a avaliação da relação parasito-célula hospedeira, por microscopia de luz e microscopia eletrônica de transmissão. A avaliação da participação das proteínas multifuncionais da matriz extracelular, fibronectina e laminina, na infecção das células ARPE-19 foi avaliada, por microscopia de varredura confocal. Ambas as linhagens de camundongos, independentemente da via de infecção utilizada, apresentaram baixos títulos de IgM e IgG anti-Leishmania. A análise histopatológica das pálpebras mostrou infiltrado inflamatório com a presença de mastócitos em ambas as linhagens de camundongos, porém o parasito não foi observado, levantando a hipótese de que estes teriam sido eliminados. Os...infecção.(AU)

Estudo da infecção ocular experimental por Leishmania (Leishmania) amazonensis in vivo no modelo murino e in vitro em células do epitélio pigmentado da retina humana - ARPE- 19 / Study of the experimental ocular infection for Leishmania (Leishmania) amazonensis in alive in the murino model and in vitro in cells from human retinal pigmented epithelium - ARPE- 19

Leishmanioses são doenças causadas por diferentes espécies de protozoários do gênero Leishmania. Segundo a Organização Mundial da Saúde estão presentes em 88 países e permanecem como um grave problema de saúde pública. A doença se manifesta em diversas formas clínicas: leishmaniose cutânea, cutânea difusa, muco-cutânea e visceral. Entre os sinais clínicos observados, as lesões oculares aparecem com uma freqüência de 0,4por cento nos casos de leishmaniose cutânea humana e em cães este índice é superior a 15por cento podendo chegar a 80por cento. O presente trabalho objetivou estudar a infecção ocuar experimental pela L. (L.) amazonensis in vivo, nos camundongos C57BL/10 e BALB/c, e in vitro em células do epitélio pigmentado da retina humana (ARPE-19). Os animais foram infectados por instilação ocular intravitrealmente com L. (L.) amazonensis e o curso da infecção foi acompanhado a cada 30 dias por três meses. A cada 30 dias, 3 animais de cada grupo foram eutanasiados para a retirada do soro, pálpebras e bulbo ocular. Os tecidos foram processados para histologia convencional e os soros armazenados para dosagem de anticorpos. Nos experimentos in vitro, as células ARPE-19 foram cultivadas e fixadas após 1, 6, 10, 24, 48, 72 e 96 horas após infecção por L. (L.) amazonensis, para a avaliação da relação parasito-célula hospedeira, por microscopia de luz e microscopia eletrônica de transmissão. A avaliação da participação das proteínas multifuncionais da matriz extracelular, fibronectina e laminina, na infecção das células ARPE-19 foi avaliada, por microscopia de varredura confocal. Ambas as linhagens de camundongos, independentemente da via de infecção utilizada, apresentaram baixos títulos de IgM e IgG anti-Leishmania. A análise histopatológica das pálpebras mostrou infiltrado inflamatório com a presença de mastócitos em ambas as linhagens de camundongos, porém o parasito não foi observado, levantando a hipótese de que estes teriam sido eliminados. Os...infecção.(AU)

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Leishmanioses são doenças causadas por diferentes espécies de protozoários do gênero Leishmania. Segundo a Organização Mundial da Saúde estão presentes em 88 países e permanecem como um grave problema de saúde pública. A doença se manifesta em diversas formas clínicas: leishmaniose cutânea, cutânea difusa, muco-cutânea e visceral. Entre os sinais clínicos observados, as lesões oculares aparecem com uma freqüência de 0,4por cento nos casos de leishmaniose cutânea humana e em cães este índice é superior a 15por cento podendo chegar a 80por cento. O presente trabalho objetivou estudar a infecção ocuar experimental pela L. (L.) amazonensis in vivo, nos camundongos C57BL/10 e BALB/c, e in vitro em células do epitélio pigmentado da retina humana (ARPE-19). Os animais foram infectados por instilação ocular intravitrealmente com L. (L.) amazonensis e o curso da infecção foi acompanhado a cada 30 dias por três meses. A cada 30 dias, 3 animais de cada grupo foram eutanasiados para a retirada do soro, pálpebras e bulbo ocular. Os tecidos foram processados para histologia convencional e os soros armazenados para dosagem de anticorpos. Nos experimentos in vitro, as células ARPE-19 foram cultivadas e fixadas após 1, 6, 10, 24, 48, 72 e 96 horas após infecção por L. (L.) amazonensis, para a avaliação da relação parasito-célula hospedeira, por microscopia de luz e microscopia eletrônica de transmissão. A avaliação da participação das proteínas multifuncionais da matriz extracelular, fibronectina e laminina, na infecção das células ARPE-19 foi avaliada, por microscopia de varredura confocal. Ambas as linhagens de camundongos, independentemente da via de infecção utilizada, apresentaram baixos títulos de IgM e IgG anti-Leishmania. A análise histopatológica das pálpebras mostrou infiltrado inflamatório com a presença de mastócitos em ambas as linhagens de camundongos, porém o parasito não foi observado, levantando a hipótese de que estes teriam sido eliminados. Os...infecção.(AU)

Estudo da infecção ocular experimental por Leishmania (Leishmania) amazonensis in vivo no modelo murino e in vitro em células do epitélio pigmentado da retina humana - ARPE- 19 / Study of the experimental ocular infection for Leishmania (Leishmania) amazonensis in alive in the murino model and in vitro in cells from human retinal pigmented epithelium - ARPE- 19

Leishmanioses são doenças causadas por diferentes espécies de protozoários do gênero Leishmania. Segundo a Organização Mundial da Saúde estão presentes em 88 países e permanecem como um grave problema de saúde pública. A doença se manifesta em diversas formas clínicas: leishmaniose cutânea, cutânea difusa, muco-cutânea e visceral. Entre os sinais clínicos observados, as lesões oculares aparecem com uma freqüência de 0,4por cento nos casos de leishmaniose cutânea humana e em cães este índice é superior a 15por cento podendo chegar a 80por cento. O presente trabalho objetivou estudar a infecção ocuar experimental pela L. (L.) amazonensis in vivo, nos camundongos C57BL/10 e BALB/c, e in vitro em células do epitélio pigmentado da retina humana (ARPE-19). Os animais foram infectados por instilação ocular intravitrealmente com L. (L.) amazonensis e o curso da infecção foi acompanhado a cada 30 dias por três meses. A cada 30 dias, 3 animais de cada grupo foram eutanasiados para a retirada do soro, pálpebras e bulbo ocular. Os tecidos foram processados para histologia convencional e os soros armazenados para dosagem de anticorpos. Nos experimentos in vitro, as células ARPE-19 foram cultivadas e fixadas após 1, 6, 10, 24, 48, 72 e 96 horas após infecção por L. (L.) amazonensis, para a avaliação da relação parasito-célula hospedeira, por microscopia de luz e microscopia eletrônica de transmissão. A avaliação da participação das proteínas multifuncionais da matriz extracelular, fibronectina e laminina, na infecção das células ARPE-19 foi avaliada, por microscopia de varredura confocal. Ambas as linhagens de camundongos, independentemente da via de infecção utilizada, apresentaram baixos títulos de IgM e IgG anti-Leishmania. A análise histopatológica das pálpebras mostrou infiltrado inflamatório com a presença de mastócitos em ambas as linhagens de camundongos, porém o parasito não foi observado, levantando a hipótese de que estes teriam sido eliminados. Os...infecção.