Addition of synthetic amino acids in sheep semen improves its quality after cryopreservation / Adição de aminoácidos sintéticos no sêmen ovino melhora a qualidade espermática após a criopreservação do sêmen

Some amino acids can protect mammalian sperm cells against oxidation during thermal stress caused by freezing/thawing. Thus, the objective was to evaluate the protective action of the association of the amino acids L-proline (Pro) and L-glutamine (Glu) against the cryoinjury caused to sheep sperm after cryopreservation. Eight ejaculates were collected from four sheep (n=32) and diluted in Tris-Egg Yolk-Glycerol until the final concentration of 200 x106 sptz/mL and kept in a water bath at 32 °C. The amino acids were added as follows: control (without adding amino acids), Pro+Glu 1 (100 µM Pro + 500 µM Glu), Pro+Glu 2 (300 µMPro + 1000 µM Glu), Pro+Glu 3 (500 µM Pro + 1500 µM Glu) and Pro+Glu 4 (700 µM Pro + 2000 µM Glu). Afterwards, the semen was cooled to 5 °C for 2 h, after that period, filled in 0.5 mL straws and then placed under liquid nitrogen vapor (N2L), 8 cm from the liquid sheet for 15min, and then immersed on the N2L. The samples were analyzed for sperm motility, plasma membrane and acrosomal membrane integrity, mitochondrial activity and binding test. The variables were subjected to the normality tests (Lilliefors test) and homoscedasticity tests (Cochran and Bartlett test), afterwards the variables of normal distribution were subjected to analysis of variance and the means compared by the Tukey test with a significance level of 5%. The Pro+Glu 3 group exhibited sperm with a greater (P<0.05) motility after thawing. In addition, the highest percentage of plasma and acrosomal membrane integrity were obtained using Pro+Glu 1, Pro+Glu 2 and Pro+Glu 3; and Pro+Glu 2 and Pro+Glu 3, respectively. Amino acids also kept mitochondrial activity high compared to the control, with Pro+Glu 3 resulting in greater activity (P<0.05). Sperm viability was higher (P<0.05) with the use of Pro+Glu 2 and Pro+Glu 3 than in the control. The number of sperm that showed the ability to bind to the egg yolk perivitelline membrane was higher (P<0.05) in semen treated with amino acids. It is concluded that the addition of synthetic amino acids in the semen of sheep before cryopreservation improves sperm quality and fertilization potential and can thus be added in cryopreservation protocols.

Alguns aminoácidos podem proteger as células espermáticas de mamíferos contra a oxidação durante o estresse térmico causado na congelação/descongelação. Dessa forma, objetivou-se avaliar a ação protetora da associação dos aminoácidos L-prolina (Pro) e L-glutamina (Glu) contra as crioinjúrias causadas aos espermatozoides de ovino após a criopreservação. Foram coletados oito ejaculados de quatro carneiros (n=32) e diluídos em Tris-Gema de ovo-Glicerol até a concentração final de 200 x106 sptz/mL e, mantidos em banho maria a 32 °C. Os aminoácidos foram adicionados da seguinte forma: controle (sem adição de aminoácidos), Pro+Glu 1 (100 µM Pro + 500 µM Glu), Pro+Glu 2 (300 µM Pro + 1000 µM Glu), Pro+Glu 3 (500 µM Pro + 1500 µM Glu) e Pro+Glu 4 (700 µM Pro + 2000 µM Glu). Depois, o sêmen foi resfriado a 5 °C por 2 h, após esse período, envasado em palhetas de 0,5 mL e então acondicionado sob vapor de nitrogênio líquido (N2L), a 8 cm da lâmina líquida por 15 min, e depois imersos no N2L. As amostras foram analisadas quanto à motilidade espermática, integridade da membrana plasmática e da membrana acrossomal, atividade mitocondrial e teste de ligação. As variáveis foram submetidas aos testes de normalidade (Teste de Lilliefors) e homocedacidade (Teste de Cochran e Bartlett), posteriormente as variáveis de distribuição normal foram submetidas à análise de variância e as médias comparadas pelo teste de Tukey com nível de significância de 5%. O grupo Pro+Glu 3 exibiu espermatozoides com uma maior (P<0,05) motilidade após o descongelamento. Além disso o maior percentual de integridade da membrana plasmatica e acrossomal foram obtidos utilizando Pro+Glu 1, Pro+Glu 2 e Pro+Glu 3; e Pro+Glu 2 e Pro+Glu 3, respectivamente. Os aminoácidos também mantiveram alta a atividade mitocondrial em comparação com o controle, com Pro+Glu 3 resultando numa maior atividade (P<0,05). A viabilidade dos espermatozoides foi maior (P<0,05) com o uso de Pro+Glu 2 e Pro+Glu 3 do que no controle. O número de espermatozoides que apresentaram à capacidade de ligação a membrana perivitelina da gema de ovo foi maior (P<0,05) no sêmen tratado com aminoácidos. Conclui-se que, a adição dos aminoácidos sintéticos no sêmen de ovinos antes da criopreservação melhora a qualidade espermática e o potencial fecundante, podendo assim serem adicionados em protocolos de criopreservação.

Addition of sucrose on cryoprotectant solution of vitrification enhances the quality of Dorper sheep embryos produced in vivo / Adição de sacarose na solução crioprotetora de vitrificação melhora a qualidade de embriões ovinos Dorper produzidos in vivo

This study aimed to evaluate the efficacy of adding sucrose in vitrification solution of ovine embryos produced in vivo. Forty Dorper ewes were selected and superovulated. Immediately prior to the embryo collection by laparotomy, a laparoscopy was performed to verify the superovulatory response. The recovered flushing was followed by embryo evaluation and embryos were divided in two experimental groups where embryos from Control group were submitted to a traditional vitrification protocol and embryos from Sucrose group to a modified vitrification protocol with sucrose. After warming, embryos were again divided regarding cryoprotectant removal (Indirect) or not (Direct). The embryo quality was classified as embryos of degrees I (excellent or good), II (regular), III (poor) and IV (dead or degenerate). It was also verified the homogeneity of mass, occurrence of embryonic mass retraction and rupture of pellucid zone. The results were expressed as percentages and were subjected to Chi-square test with P 0.05. The embryos vitrified in the presence of sucrose had lower proportions of lower-quality embryos after warming (22.20 vs. 44.50%), higher percentages of homogeneous embryos after warming (63.89 vs. 38.89 %) while concerning other parameters there was no difference between these groups. It can be concluded that the addition of 0.4 M sucrose during vitrification improves the embryo quality.

Este estudo objetivou avaliar a eficácia da adição de sacarose na solução de vitrificação de embriões ovinos produzidos in vivo. Foram selecionadas 40 ovelhas da raça Dorper as quais foram superovuladas. Imediatamente antes da colheita de embriões por laparotomia, uma laparoscopia foi realizada para verificar a resposta superovulatória. O lavado recuperado foi submetido à procura e avaliação de embriões e estes foram divididos em dois grupos experimentais, onde os embriões do Grupo Controle foram submetidos ao protocolo tradicional de vitrificação e os embriões do Grupo Sacarose a um protocolo modificado de vitrificação com sacarose. Após a descongelação, os embriões foram novamente divididos considerando a remoção (Indireto) ou não (Direto) do crioprotetor. A qualidade embrionária foi classificada como embriões de graus I (excelente ou bom), II (regular), III (pobre) e IV (morto ou degenerado). Foi também verificada a homogeneidade da massa, ocorrência de retração da massa e ruptura de zona pelúcida. Os resultados foram expressos em porcentagem e foram submetidos ao teste do Qui-quadrado com P < 0.05. Os embriões vitrificados na presença de sacarose apresentaram menores proporções de embriões de menor qualidade após a descongelação (22,20 vs. 44,50%), e maiores percentuais de embriões homogêneos após a descongelação (63,89 vs. 38,89%) enquanto com relação aos demais parâmetros não existiram diferenças entre grupos. Pode-se concluir que a adição de 0,4 M de sacarose durante os procedimentos de vitrificação e descongelação beneficia a qualidade embrionária.

Addition of sucrose on cryoprotectant solution of vitrification enhances the quality of Dorper sheep embryos produced in vivo / Adição de sacarose na solução crioprotetora de vitrificação melhora a qualidade de embriões ovinos Dorper produzidos in vivo

This study aimed to evaluate the efficacy of adding sucrose in vitrification solution of ovine embryos produced in vivo. Forty Dorper ewes were selected and superovulated. Immediately prior to the embryo collection by laparotomy, a laparoscopy was performed to verify the superovulatory response. The recovered flushing was followed by embryo evaluation and embryos were divided in two experimental groups where embryos from Control group were submitted to a traditional vitrification protocol and embryos from Sucrose group to a modified vitrification protocol with sucrose. After warming, embryos were again divided regarding cryoprotectant removal (Indirect) or not (Direct). The embryo quality was classified as embryos of degrees I (excellent or good), II (regular), III (poor) and IV (dead or degenerate). It was also verified the homogeneity of mass, occurrence of embryonic mass retraction and rupture of pellucid zone. The results were expressed as percentages and were subjected to Chi-square test with P 0.05. The embryos vitrified in the presence of sucrose had lower proportions of lower-quality embryos after warming (22.20 vs. 44.50%), higher percentages of homogeneous embryos after warming (63.89 vs. 38.89 %) while concerning other parameters there was no difference between these groups. It can be concluded that the addition of 0.4 M sucrose during vitrification improves the embryo quality.(AU)

Este estudo objetivou avaliar a eficácia da adição de sacarose na solução de vitrificação de embriões ovinos produzidos in vivo. Foram selecionadas 40 ovelhas da raça Dorper as quais foram superovuladas. Imediatamente antes da colheita de embriões por laparotomia, uma laparoscopia foi realizada para verificar a resposta superovulatória. O lavado recuperado foi submetido à procura e avaliação de embriões e estes foram divididos em dois grupos experimentais, onde os embriões do Grupo Controle foram submetidos ao protocolo tradicional de vitrificação e os embriões do Grupo Sacarose a um protocolo modificado de vitrificação com sacarose. Após a descongelação, os embriões foram novamente divididos considerando a remoção (Indireto) ou não (Direto) do crioprotetor. A qualidade embrionária foi classificada como embriões de graus I (excelente ou bom), II (regular), III (pobre) e IV (morto ou degenerado). Foi também verificada a homogeneidade da massa, ocorrência de retração da massa e ruptura de zona pelúcida. Os resultados foram expressos em porcentagem e foram submetidos ao teste do Qui-quadrado com P < 0.05. Os embriões vitrificados na presença de sacarose apresentaram menores proporções de embriões de menor qualidade após a descongelação (22,20 vs. 44,50%), e maiores percentuais de embriões homogêneos após a descongelação (63,89 vs. 38,89%) enquanto com relação aos demais parâmetros não existiram diferenças entre grupos. Pode-se concluir que a adição de 0,4 M de sacarose durante os procedimentos de vitrificação e descongelação beneficia a qualidade embrionária.(AU)