El ácido retinoico todo-trans induce apoptosis en células mesangiales humanas: implicación de la quinasa activada por estrés p38 / All-trans retinoic acid induces apoptosis in human mesangial cells: involvement of stress activated p38 kinase

RESUMEN

El ácido retinoico todo-trans (AR-t) se utiliza en clínica en el tratamiento de la leucemiapromielocítica aguda y el cáncer renal. También presenta efecto terapéutico endiversas formas de enfermedad renal experimental. Las células mesangiales son una delas dianas farmacológicas de AR-t mejor estudiadas presentan receptores de ácido retinoico(RAR) y receptores X de retinoides (RXR) y el AR-t, a concentraciones entre 1 y 10µM, inhibe su crecimiento. Este efecto se ha relacionado con la acción antiproliferativadel AR-t, aunque no se ha estudiado la participación de mecanismos apoptóticos cuandose utilizan mayores concentraciones de AR-t. El presente trabajo demuestra que AR-t25 µM induce apoptosis de células mesangiales humanas en cultivo, caracterizada porestudios de microscopía óptica y de fluorescencia (tinciones de Giemsa y naranja deacridina, respectivamente), electroforesis del ADN fragmentado, citometría de flujo(anexina-V/ioduro de propidio) e inmunocitoquímica (TUNEL). Ni HX531 (pan-antagonistaRXR), ni AGN193109 (pan-antagonista RAR) redujeron el grado de muerte celularinducido por el AR-t, lo que sugiere un mecanismo independiente de receptores. Resultadosprevios de nuestro grupo indican que dos de los tres miembros de las quinasasactivadas por mitógenos (MAP), ERK (quinasa regulada por estímulos extracelulares) yJNK (quinasa de c-Jun), están implicados en efectos no apoptóticos del AR-t en célulasmesangiales. Nos centramos, pues, en el potencial pro-apoptótico del tercer miembro,la quinasa activada por estrés p38. Confirmamos su implicación en la apoptosis inducidapor el AR-t porque 1) su inhibidor farmacológico, SB203580, previno dicha apoptosis2) El AR-t indujo en pocos minutos la fosforilación de p38, manteniéndose fosforiladadurante las 8 horas posteriores; y 3) dicha fosforilación se inhibió por preincubación conSB203580. Estos datos sugieren una posible toxicidad renal del AR-t, pero también suutilidad para controlar la proliferación patológica de células mesangiales

ABSTRACT

All-trans retinoic acid (AR-t) is used for treating acute promyelocytic leukemia andrenal cell carcinoma and it also has therapeutic value in several animal models of renaldisease. Among its renal targets, mesangial cells have been widely studied they haveboth retinoic acid receptors (RAR) and retinoid X receptors (RXR) and the cell growthis inhibited when human mesangial cells are incubated with 1-10 µM AR-t. Althoughhis effect has been related with the antiproliferative action of AR-t, there are no studieson the involvement of apoptosis in AR-t induced cell growth when higher concentrationsof retinoid are used. Our studies show that 25 µM AR-t triggers mesangial cellapoptosis assessed by light and fluorescence microscopy (Giemsa stain and acridineorange stain, respectively), DNA electrophoresis, flow cytometry (annexin-V) andimmunocytochemistry (TUNEL). AR-t induced apoptosis was not inhibited by preincubationwith the RXR pan-antagonist HX531 nor with the RAR pan-antagonist AGN193109, this suggesting RAR and RXIR are not involved in AR-t induced cell death.Previous results of our group showed that ERK (extracellular regulated kinase) andJNK (c-Jun kinase), two members of the MAP (mitogen activated protein) kinasefamily, are involved in non apoptotic effects of AR-t on mesangial cells. Therefore wefocussed on the stress activated p38 kinase, the third member of the MAPK family, toinvestigate its involvement in AR-t induced apoptosis. The results confirmed a role ofp38 since 1) preincubation with SB203589, a p38 inhibitor, inhibited ARA inducedapoptosis; 2) incubation with AR-t induced p38 phosphorilation after few minutesand p38 remained phosphorilated for at least 8 hours and 3) AR-t induced p38 phosphorilationwas inhibited by SB203589. These data suggest that AR-t migth have toxicside effects on the kidney but also suggest that AR-t could be an useful inhibitor of pathologicalmesangial cell expansion