A three-dimensional lung cell model to leptospira virulence investigations

Leptospirosis is a worldwide zoonosis and a serious public health threat in tropical and subtropical areas. The etiologic agents of leptospirosis are pathogenic spirochetes from the genus Leptospira. In severe cases, patients develop a pulmonary hemorrhage that is associated with high fatality rates. Several animal models were established for leptospirosis studies, such as rodents, dogs, and monkeys. Although useful to study the relationship among Leptospira and its hosts, the animal models still exhibit economic and ethical limitation reasons and do not fully represent the human infection. As an attempt to bridge the gap between animal studies and clinical information from patients, we established a three-dimensional (3-D) human lung cell culture for Leptospira infection. We show that Leptospira is able to efficiently infect the cell lung spheroids and also to infiltrate in deeper areas of the cell aggregates. The ability to infect the 3-D lung cell aggregates was time-dependent. The 3-D spheroids infection occurred up to 120 h in studies with two serovars, Canicola and Copenhageni. We standardized the number of bacteria in the initial inoculum for infection of the spheroids and we also propose two alternative culture media conditions. This new approach was validated by assessing the expression of three genes of Leptospira related to virulence and motility. The transcripts of these genes increased in both culture conditions, however, in higher rates and earlier times in the 3-D culture. We also assessed the production of chemokines by the 3-D spheroids before and after Leptospira infection, confirming induction of two of them, mainly in the 3-D spheroids. Chemokine CCL2 was expressed only in the 3-D cell culture. Increasing of this chemokine was observed previously in infected animal models. This new approach provides an opportunity to study the interaction of Leptospira with the human lung epithelium in vitro.

MicroRNA-10 modulates Hox genes expression during Nile tilapia embryonic development.

Hox gene clusters encode a family of transcription factors that govern anterior-posterior axis patterning during embryogenesis in all bilaterian animals. The time and place of Hox gene expression are largely determined by the relative position of each gene within its cluster. Furthermore, Hox genes were shown to have their expression fine-tuned by regulatory microRNAs (miRNAs). However, the mechanisms of miRNA-mediated regulation of these transcription factors during fish early development remain largely unknown. Here we have profiled three highly expressed miR-10 family members of Nile tilapia at early embryonic development, determined their genomic organization as well as performed functional experiments for validation of target genes. Quantitative analysis during developmental stages showed miR-10 family expression negatively correlates with the expression of HoxA3a, HoxB3a and HoxD10a genes, as expected for bona fide miRNA-mRNA interactions. Moreover, luciferase assays demonstrated that HoxB3a and HoxD10a are targeted by miR-10b-5p. Overall, our data indicate that the miR-10 family directly regulates members of the Hox gene family during Nile tilapia embryogenesis.

Estudos alternativos: redução do uso de animais para manutenção e análises da virulência de Leptospira usando cultura celular tridimensional (3D)

A leptospirose é uma doença causada por bactérias do gênero Leptospira e ocorre principalmente em países da zona tropical, afetando todos os mamíferos além de aves, anfíbios e répteis. A contaminação ocorre através do contato direto da pele ou mucosas com água ou solos infectados com urina de animais portadores. Quando patogênicas, essas bactérias podem afetar diversos órgãos, causando doença crônica e aguda. Aproximadamente um milhão de casos, e sessenta mil mortes são registrados no mundo. No Brasil, os casos registrados em 2018 ultrapassaram três mil com letalidade próxima a 10%. Para se compreender melhor a patogenicidade e manutenção da virulência, diversos modelos animais, susceptíveis são utilizados, entre eles, hamsters, porquinhos da índia e gerbils. O uso desses animais continua sendo fundamental nos estudos de leptospirose, porem, são testes dispendiosos e de difícil manutenção. Com o intuito de diminuir a utilização de animais, estabelecemos um novo modelo que contribua na manutenção e nos estudos de virulência de Leptospira. Para isso, foi proposto o modelo celular tridimensional por se aproximar do padrão in vivo e auxiliar nos estudos de interação patógeno – hospedeiro. O modelo foi estabelecido com células epiteliais de pulmão humano, linhagem A549, cultivadas em meio DMEM, Matrigel® e Ágar e infectadas com dois tipos de sorovares: L. interrogans sv. Canicola e sv. Copenhageni. As células foram infectadas em diferentes concentrações (102, 104 e 106). As culturas foram analisadas após 2, 24, 48, 72 horas e 5 dias. As células foram fixadas em paraformoldeído 4% e em seguida efetuadas as imunohistoquímicas, utilizando IgG conjugado a FITC, DAPI e azul de Evans, seguida de analises em microscopia confocal. Nossos resultados mostraram que a concentração inicial de bactérias é um parâmetro crucial para a infecção. Além disso, os dois sorovores apresentaram comportamento de invasão de maneira oposta nos períodos iniciais. Observamos Copenhageni dentro das células em poucas horas, diferentemente do sorovar Canícola, onde foi visualizado um maior número de bactérias dentro das células nos períodos mais tardios. Os testes utilizando Agar e matrigel mostraram-se promissores e podem ser um modelo alternativo e econômico para estudos da virulência de Leptospira. Estudos mais detalhados são necessários a fim de tornar a técnica um modelo padrão nos estudos de virulência desse patógeno em cultura tridimensional.