RESUMEN
Mycobacterium bovis BCG is the only vaccine against tuberculosis. The variable forms of cultivation throughout the years, before seed-lots were developed, allowed in vitro evolution of the original strain, generating a family of vaccines with different phenotypic and genotypic characteristics. Molecular studies revealed regions of difference (RDs) in the genomes of the various BCG strains. This work aims to characterize the gene pair rv3407-rv3408 (vapB47-vapC47), coding for a toxin-antitoxin system of the VapBC family, and to evaluate possible transcriptional effects due to the adjacent BCG Moreau-specific genomic deletion RD16. We show that these genes are co-transcribed in BCG strains Moreau and Pasteur, and that the inactivation of an upstream transcriptional repressor (Rv3405c) due to RD16 has a polar effect, leading to increased vapBC47 expression. Furthermore, we detect VapB47 DNA binding in vitro, dependent on a 5' vapB47 sequence that contributes to a palindrome, spanning the promoter and coding region. Our data shed light on the regulation of VapBC systems and on the impact of the BCG Moreau RD16 deletion in the expression of adjacent genes, contributing to a better understanding of BCG Moreau physiology.
RESUMEN
The small-DNA human adenovirus encodes one of the most versatile molecular hubs, the E1A protein. This protein is essential for productive viral infection in human cells and a vast amount of biologically relevant data are available on its interactions with host proteins. Up to now, however, no high-resolution structural and dynamic information on E1A is available despite its important biological role. Among the different spliced variants of E1A, two are expressed at high level in the early stage of infection. These are 243 and 289 residues isoforms. Herein, we present their NMR characterization, showing that they are both highly disordered, but also demonstrate a certain heterogeneous behavior in terms of structural and dynamic properties. Furthermore, we present the characterization of the isolated domain of the longer variant, known as CR3. This study opens the way to understanding at the molecular level how E1A functions.
Asunto(s)
Proteínas E1A de Adenovirus/química , Adenovirus Humanos/química , Humanos , Agregado de Proteínas , Dominios Proteicos , Isoformas de Proteínas/químicaRESUMEN
Surface-associated proteins from Mycobacterium bovis BCG Moreau RDJ are important components of the live Brazilian vaccine against tuberculosis. They are important targets during initial BCG vaccine stimulation and modulation of the host's immune response, especially in the bacterial-host interaction. These proteins might also be involved in cellular communication, chemical response to the environment, pathogenesis processes through mobility, colonization, and adherence to the host cell, therefore performing multiple functions. In this study, the proteomic profile of the surface-associated proteins from M. bovis BCG Moreau was compared to the BCG Pasteur reference strain. The methodology used was 2DE gel electrophoresis combined with mass spectrometry techniques (MALDI-TOF/TOF), leading to the identification of 115 proteins. Of these, 24 proteins showed differential expression between the two BCG strains. Furthermore, 27 proteins previously described as displaying moonlighting function were identified, 8 of these proteins showed variation in abundance comparing BCG Moreau to Pasteur and 2 of them presented two different domain hits. Moonlighting proteins are multifunctional proteins in which two or more biological functions are fulfilled by a single polypeptide chain. Therefore, the identification of such proteins with moonlighting predicted functions can contribute to a better understanding of the molecular mechanisms unleashed by live BCG Moreau RDJ vaccine components.
Asunto(s)
Vacuna BCG/inmunología , Proteínas de la Membrana/inmunología , Mycobacterium bovis/inmunología , Transcriptoma/inmunología , Brasil , Perfilación de la Expresión Génica , Humanos , Proteómica , Espectrometría de Masa por Láser de Matriz Asistida de Ionización Desorción , Transcriptoma/genética , Tuberculosis/inmunología , Tuberculosis/prevención & controlRESUMEN
The Brazilian anti-tuberculosis vaccine strain Mycobacterium bovis bacillus Calmette-Guérin (BCG) BCG Moreau is unique in having a deletion of 7608 bp (RD16) that results in the truncation of a putative TetR transcriptional regulator, the ortholog of Mycobacterium tuberculosis rv3405c, BCG_M3439c. We investigated the effect of this truncation on the expression of the rv3406 ortholog (BCG_M3440), lying 81 bp downstream in the opposite orientation. RT-PCR and western blot experiments show that rv3406 mRNA and Rv3406 accumulate in BCG Moreau but not in BCG Pasteur (strain that bears an intact rv3405c), suggesting this to be a result of rv3405c truncation. Recombinant Rv3405c forms a complex with the rv3405c-rv3406 intergenic region, which contains a characteristic transcription factor binding site, showing it to have DNA binding activity. Complementation of M. bovis BCG Moreau with an intact copy of rv3405c abolishes Rv3406 accumulation. These results show that Rv3405c is a DNA binding protein that acts as a transcriptional repressor of rv3406.
Asunto(s)
Vacuna BCG/farmacología , Proteínas Bacterianas/efectos de los fármacos , Mycobacterium bovis/genética , Reacción en Cadena de la Polimerasa de Transcriptasa Inversa , Eliminación de Secuencia , Transcripción Genética/efectos de los fármacos , Proteínas Bacterianas/genética , Western Blotting , ADN Bacteriano/efectos de los fármacos , Proteínas de Unión al ADN/inmunología , Electroforesis en Gel de Campo Pulsado , Electroforesis en Gel de Poliacrilamida , Humanos , Mutación/efectos de los fármacos , Tuberculosis/tratamiento farmacológicoRESUMEN
A tuberculose, causada pelo Mycobacterium tuberculosis, constitui um fator de risco para cerca de um terço da população mundial. Das 54 milhões de pessoas que se infectam anualmente 8,9 milhões desenvolvem a doença e 1,7 milhões morrem. Apesar do uso da vacina BCG como único método profilático disponível contra a tuberculose, sua eficiência é muito variável, havendo-se, então a necessidade de se estudar melhor a referida vacina. O estudo do genoma completo de vários organismos, somado ao estudo dos projetos genoma em andamento, permite o desenho de abordagens globais para a compreensão funcional da biologia destes organismos. Entretanto, a melhor representação do estado real celular é através do estudo de proteínas expressas em um dado momento sob condições definidas, tornando-se o passo lógico seguinte e complementar aos estudos genômicos, visando entender os processos vitais ao nível molecular. Neste contexto, as proteínas associadas à superfície micobacteriana desempenham um papel importante na modulação da resposta imune do hospedeiro, principalmente na interface bactéria-hospedeiro, e devem ser melhor estudadas. Este trabalho visa o melhor conhecimento da cepa vacinal brasileira, M. bovis BCG Moreau, através da definição do seu perfil proteômico de superfície. Descrevemos os perfis proteômicos da fração de proteínas de superfície das cepas de BCG Moreau e Pasteur (cepa referência), cultivadas em dois diferentes meios de produção da vacina, identificando 123 proteínas por espectrometria de massas. Estes mapas proteômicos estão sendo disponibilizados através de interface web. A análise comparativa permitiu a identificação de proteínas diferencialmente expressas entre as cepas Moreau e Pasteur, evidenciando exemplos de possíveis ganhos funcionais através de perda de informação genômica. As proteínas diferenciais identificadas poderão ser exploradas como marcadores para melhor controle de qualidade de produção da vacina BCG Moreau, e abrem novas perspectivas para a compreensão dos mecanismos moleculares envolvidos na indução da resposta imune protetora pela vacina brasileira.
Asunto(s)
Proteínas de la Membrana , Mycobacterium bovis , Proteoma , TuberculosisRESUMEN
A tuberculose, causada pelo Mycobacterium tuberculosis, constitui um fator de risco para cerca de um terço da população mundial. Das 54 milhões de pessoas que se infectam anualmente 8,9 milhões desenvolvem a doença e 1,7 milhões morrem. Apesar do uso da vacina BCG como único método profilático disponível contra a tuberculose, sua eficiência é muito variável, havendo-se, então a necessidade de se estudar melhor a referida vacina. O estudo do genoma completo de vários organismos, somado ao estudo dos projetos genoma em andamento, permite o desenho de abordagens globais para a compreensão funcional da biologia destes organismos. Entretanto, a melhor representação do estado real celular é através do estudo de proteínas expressas em um dado momento sob condições definidas, tornando-se o passo lógico seguinte e complementar aos estudos genômicos, visando entender os processos vitais ao nível molecular. Neste contexto, as proteínas associadas à superfície micobacteriana desempenham um papel importante na modulação da resposta imune do hospedeiro, principalmente na interface bactéria-hospedeiro, e devem ser melhor estudadas. Este trabalho visa o melhor conhecimento da cepa vacinal brasileira, M. bovis BCG Moreau, através da definição do seu perfil proteômico de superfície. Descrevemos os perfis proteômicos da fração de proteínas de superfície das cepas de BCG Moreau e Pasteur (cepa referência), cultivadas em dois diferentes meios de produção da vacina, identificando 135 proteínas por espectrometria de massas. Estes mapas proteômicos estão sendo disponibilizados através de interface web. A análse comparativa permitiu a identificação de proteínas diferencialmente expressas entre as cepas Moreau e Pasteur, evidenciando exemplos de possíveis ganhos funcionais através de perda de informação genômica. As proteínas diferenciais identificadas poderão ser exploradas como marcadores para melhor controle de qualidade de produção da vacina BCG Moreau, e...