The Development of a One-Step RT-qPCR for the Detection and Quantification of Viable Forms of Trypanosoma cruzi in Açai Samples from Areas at Risk of Chagas Disease through Oral Transmission.

Currently, approximately 70% of new cases of Chagas disease (CD) in Brazil are attributed to oral transmission, particularly through foods such as açaí, bacaba, and sugarcane juice, primarily in the northern and northeastern regions of the country. This underscores the imperative need to control the spread of the disease. The methods utilized to conduct quality control for food associated with outbreaks and to assess the potential for the oral transmission of CD through consuming açaí primarily rely on isolating the parasite or inoculating food into experimental animals, restricting the analyses to major research centers. While there are existing studies in the literature on the detection and quantification of T. cruzi DNA in açaí, the evaluation of parasites' viability using molecular methods in this type of sample and differentiating between live and dead parasites in açaí pulp remain challenging. Consequently, we developed a molecular methodology based on RT-qPCR for detecting and quantifying viable T. cruzi in açaí pulp samples. This protocol enables the stabilization and preservation of nucleic acids in açaí, along with incorporating an exogenous internal amplification control. The standardization of the RNA extraction method involved a simple and reproducible approach, coupled with a one-step RT-qPCR assay. The assay underwent validation with various T. cruzi DTUs and demonstrated sensitivity in detecting up to 0.1 viable parasite equivalents/mL in açaí samples. Furthermore, we investigated the effectiveness of a bleaching method in eliminating viable parasites in açaí samples contaminated with T. cruzi by comparing the detection of DNA versus RNA. Finally, we validated this methodology using açaí pulp samples positive for T. cruzi DNA, which were collected in a municipality with a history of oral CD outbreaks (Coari-AM). This validation involved comparing the detection and quantification of total versus viable T. cruzi. Collectively, our findings demonstrate the feasibility of this methodology in detecting viable forms of T. cruzi in açaí pulp samples, emerging as a crucial tool for monitoring oral outbreaks of Chagas disease resulting from açaí consumption.

Sugar feeding in triatomines: a new perspective for controlling the transmission of Chagas disease.

Introduction: Triatomines are vectors of Trypanosoma cruzi, the etiological agent of Chagas disease. Currently, there is no vaccine against this disease. Thus, control of the insect vector population is the main strategy available to reduce the number of cases. Triatomines are considered obligate hematophagous, but different alternative feeding behaviors were described, such as haemolymphagy or plant feeding. Methods: To determine the preference for sugar feeding in nymphs and adults of Rhodnius prolixus, the insects were exposed a piece of cotton containing bromophenol blue plus sucrose. In addition, we offered several sugars for different species of triatomines, and tested sugar meals as a route of delivery of insecticides in first-instar nymphs of R. prolixus. The effect of sugar feeding on the physiology of these different species of triatomines was recorded. Results: First instar nymphs ingested sucrose more strongly than other stages, and showed high mortality rates. In different species of triatomines, sucrose induced an ingestion, but engorgement varied according to the species. R. prolixus nymphs showed an indiscriminate intake of various sugars, with very different physiological effects. Furthermore, ingesting different combinations of insecticides + sugar significantly reduced insect survival. Discussion: In summary, we described for the first-time sugar feeding as a widespread behavior in several species of triatomines, and the possibility of the use of toxic sugar baits for the control of these vectors. The knowledge of feeding behavior in these insects can be fundamental for the development of new strategies to control Chagas disease.

Fatores que interferem no desenvolvimento de tripanossomatideos em Rhodnius prolixus: I-Efeito de fisalinas sobre o sistema imune; II-Serratia marcescens isolada da microbiota intestinal / Factors influencing the development of trypanosomes in Rhodnius prolixus: I-physalins effect on the immune system; II-Serratia marcescens isolated from the intestinal microbiota

Nesta tese, foram investigados fatores que interferem no desenvolvimento dos parasitas, Trypanosoma cruzi e T. rangeli, no inseto-vetor, Rhodnius prolixus, com a administração de substâncias extraídas de Physalis angulata, fisalinas, bem como fatores relacionados a microbiota bacteriana intestinal do inseto, como Serratia marcescens. As fisalinas B, D, F e G administradas junto ao sangue alimentar não alteraram a fisiologia de ninfas de 5º estádio de R. prolixus, entretanto quando inoculados com T. rangeli ou Enterobacter cloacae b12 causaram alta mortalidade. Nos insetos tratados com fisalina B e infectados com parasita observou-se diminuição na formação de microagregados de hemócitos e produção de óxido nítrico. As fisalinas B e F reduziram a atividade de lisozima e a fisalina D reduziu a atividade antibacteriana, ambas de insetos inoculados com bactéria. Insetos tratados com as fisalinas B, D, F e G exibiram reduções significativas na atividade fagocitária. O tratamento dos insetos com as fisalinas B, F e G e inoculação de bactéria ocasionou menor contagem na formação de microagregados de hemócitos e o tratamento com as fisalinas B e F menor número de hemócitos circulantes na hemolinfa. As atividades de fagocitose e microagregação de hemócitos inibidas pelo tratamento oral com fisalina B foram revertidas pela inoculação de ácido araquidônico (10 µg/inseto) e fator de agregação plaquetária (PAF) (1 µg/inseto) na hemocele dos insetos tratados. O tratamento dos insetos com fisalina B não alterou a atividade da PLA2, porém aumentou a atividade de PAF-AH. Noutro enfoque da interação inseto-parasita, foram estudados os efeitos citotóxicos da S. marcescens. Ensaios in vitro, de incubação da bactéria com T. cruzi ou T. rangeli juntamente com o carboidrato D-manose (0,2M) resultaram na proteção dos parasitas da adesão e da lise de S. marcescens (variantes SM365 e RPH) numa relação dose dependente. Entretanto, a D-manose não interferiu na atividade hemolítica das variantes SM365 e RPH de S. marcescens. Enquanto com estas variantes a adesão das bactérias ao parasita ocorria em apenas alguns segundos, a variante DB11 não aderiu e não lisou o parasita. A adesão bacteriana é densa e compacta e ocorre por finos filamentos que com o tempo se desenvolve formando biofilme em volta da superfície do parasita lisado. Portanto, concluímos que dentre os fatores que interferem na interação entre inseto e T. cruzi e T. rangeli estudados, podemos citar as fisalinas e S. marcescens por suas atividades imunosupressoras e lítica contra os parasitas, respectivamente. Enquanto a fisalina B atua diminuindo os níveis de análogo de PAF (iPAF) na hemolinfa e elevando os níveis de PAF-AH, com ação inibitória sobre o sistema imune de R. prolixus, a bactéria S. marcescens lisa parasitas resultando em formação de biofilme, os quais regulam, direta ou indiretamente, o desenvolvimento do parasita no insetos vetor.