RESUMO
The ATP-binding cassette (ABC) transporter BtuCD mediates the uptake of vitamin B(12) across the inner membrane of Escherichia coli. Previous structures have shown the conformations of apo states, but the transport mechanism has remained unclear. Here we report the 3.5 Å crystal structure of the transporter-binding protein complex BtuCD-BtuF (BtuCD-F) trapped in an ß-γ-imidoadenosine 5'-phosphate (AMP-PNP)-bound intermediate state. Although the ABC domains (BtuD subunits) form the expected closed sandwich dimer, the membrane-spanning BtuC subunits adopt a new conformation, with the central translocation pathway sealed by a previously unrecognized cytoplasmic gate. A fully enclosed cavity is thus formed approximately halfway across the membrane. It is large enough to accommodate a vitamin B(12) molecule, and radioligand trapping showed that liposome-reconstituted BtuCD-F indeed contains bound B(12) in the presence of AMP-PNP. In combination with engineered disulphide crosslinking and functional assays, our data suggest an unexpected peristaltic transport mechanism that is distinct from those observed in other ABC transporters.
Assuntos
Transportadores de Cassetes de Ligação de ATP/química , Adenilil Imidodifosfato/metabolismo , Proteínas de Escherichia coli/química , Escherichia coli/química , Proteínas Periplásmicas de Ligação/química , Vitamina B 12/metabolismo , Transportadores de Cassetes de Ligação de ATP/genética , Transportadores de Cassetes de Ligação de ATP/metabolismo , Adenosina Trifosfatases/química , Adenosina Trifosfatases/metabolismo , Trifosfato de Adenosina/metabolismo , Adenilil Imidodifosfato/química , Sequência de Aminoácidos , Cristalografia por Raios X , Citoplasma/metabolismo , Dissulfetos/química , Dissulfetos/metabolismo , Escherichia coli/genética , Proteínas de Escherichia coli/genética , Proteínas de Escherichia coli/metabolismo , Magnésio/metabolismo , Modelos Biológicos , Modelos Moleculares , Proteínas Mutantes/química , Proteínas Mutantes/genética , Proteínas Mutantes/metabolismo , Mutação , Proteínas Periplásmicas de Ligação/genética , Proteínas Periplásmicas de Ligação/metabolismo , Ligação Proteica , Conformação Proteica , Subunidades Proteicas/química , Subunidades Proteicas/genética , Subunidades Proteicas/metabolismo , Relação Estrutura-Atividade , Vitamina B 12/químicaRESUMO
The reaction mechanism of BtuCD-F-catalyzed vitamin B12 transport into Escherichia coli is currently unclear. Here we present the structure of the last missing state in the form of AMP-PNP-bound BtuCD, trapped by a disulfide cross-link. Our structural and biochemical data allow a consistent mechanism to be formulated, thus rationalizing the roles of substrate, ATP and substrate-binding protein.
Assuntos
Transportadores de Cassetes de Ligação de ATP/metabolismo , Trifosfato de Adenosina/metabolismo , Adenilil Imidodifosfato/metabolismo , Proteínas de Escherichia coli/metabolismo , Escherichia coli/metabolismo , Proteínas Periplásmicas de Ligação/metabolismo , Vitamina B 12/metabolismo , Transportadores de Cassetes de Ligação de ATP/química , Adenilil Imidodifosfato/química , Transporte Biológico , Cristalografia por Raios X , Escherichia coli/química , Proteínas de Escherichia coli/química , Simulação de Acoplamento Molecular , Proteínas Periplásmicas de Ligação/química , Ligação Proteica , Conformação ProteicaRESUMO
BtuCD is an ABC transporter catalyzing the uptake of vitamin B12 across the Escherichia coli inner membrane. A previously reported X-ray structure of BtuCD in complex with the periplasmic vitamin B12-binding protein BtuF revealed asymmetry of the transmembrane BtuC subunits. The functional relevance of this asymmetry has remained uncertain. Here we report the X-ray structure of a catalytically impaired BtuCD mutant in complex with BtuF, where the BtuC subunits adopt a distinct asymmetric conformation. The structure suggests that BtuF does not discriminate between, or impose, asymmetric conformations of BtuCD. It also explains the conformational disorder observed in BtuCDF crystals.