RESUMO
The need to find more stable catalysts has encouraged the study of naturally resilient enzymes, such as those found in extremophile organisms. In the present work, the influence of rare codons on the expression in Escherichia coli of the lipase Pf2001Δ60 from Pyrococcus furiosus was evaluated. Expression was carried out in two E. coli strains, BL21(DE3)pLysS and the rare tRNA supplemented Rosetta(DE3)pLysS. 3(2) factorial design was used to appraise the influence of temperature and inducer concentration on enzyme expression every hour for the 4-h expression period. Four response surfaces were constructed for each time, and the statistical parameters were evaluated. Lipase production was twice as high for Rosetta(DE3)pLysS than for BL21(DE3)pLysS. The factorial design indicated that optimal expression occurred at 30 °C after 4h, with lipase production of 240 U/L. The analysis of statistical parameters during the expression time showed that the velocity at which the enzyme was produced affected cell growth and maximum activity, with a higher speed leading to lower expression and cell growth. The presence of rare tRNAs prevented bottlenecks in lipase expression, and the experimental design was shown to be important for maximizing the production strategies and minimizing the metabolic load to which the host is subjected.
Assuntos
Estabilidade Enzimática/genética , Lipase/genética , Pyrococcus furiosus/enzimologia , Proteínas Recombinantes de Fusão/biossíntese , Clonagem Molecular , Códon , Escherichia coli , Regulação Bacteriana da Expressão Gênica , Lipase/biossíntese , RNA de Transferência/genética , Proteínas Recombinantes de Fusão/genética , Propriedades de Superfície , TemperaturaRESUMO
This work aimed the application of a new biocatalyst for biodiesel production from residual agro-industrial fatty acids. A recombinant Pichia pastoris displaying lipase from Rhizomucor miehei (RML) on the cell surface, using the PIR-1 anchor system, were prepared using glycerol as the carbon source. The biocatalyst, named RML-PIR1 showed optimum temperature of 45 °C (74.0 U/L). The stability tests resulted in t1/2 of 3.49 and 2.15 h at 40 and 45 °C, respectively. RML-PIR1 was applied in esterification reactions using industrial co-products as substrates, palm fatty acid distillate (PFAD) and soybean fatty acid distillate (SFAD). The highest productivity was observed for SFAD after 48 h presenting 79.1% of conversion using only 10% of biocatalyst and free-solvent system. This is about ca. eight times higher than commercial free RML in the same conditions. The stabilizing agents study revealed that the treatment using glutaraldehyde (GA) and poly(ethylene glycol) (PEG) enabled increased stability and reuse of biocatalyst. It was observed by SEM analysis that the treatment modified the cell morphology. RML-PIR1-GA presented 87.9% of the initial activity after 6 reuses, whilst the activity of unmodified RML-PIR decreased by 40% after the first use. These results were superior to those obtained in the literature, making this new biocatalyst promising for biotechnological applications, such as the production of biofuels on a large scale.
Assuntos
Agricultura , Biocombustíveis/microbiologia , Resíduos Industriais , Lipase/metabolismo , Rhizomucor/enzimologia , Saccharomycetales/metabolismo , Biocatálise , Esterificação , Especificidade por Substrato , TemperaturaRESUMO
Yeast Surface Display (YSD) is a strategy to anchor proteins on the yeast cell wall which has been employed to increase enzyme stability thus decreasing production costs. Lipase B from Candida antarctica (LipB) is one of the most studied enzymes in the context of industrial biotechnology. This study aimed to assess the biochemical features of this important biocatalyst when immobilized on the cell surface of the methylotrophic yeast Pichia pastoris using the YSD approach. For that purpose, two anchors were tested. The first (Flo9) was identified after a prospection of the P. pastoris genome being related to the family of flocculins similar to Flo1 but significantly smaller. The second is the Protein with Internal Repeats (Pir1) from P. pastoris. An immunolocalization assay showed that both anchor proteins were able to display the reporter protein EGFP in the yeast outer cell wall. LipB was expressed in P. pastoris fused either to Flo9 (FLOLIPB) or Pir1 (PIRLIPB). Both constructions showed hydrolytic activity towards tributyrin (>100 U/mgdcw and >80 U/mgdcw, respectively), optimal hydrolytic activity around 45°C and pH 7.0, higher thermostability at 45°C and stability in organic solvents when compared to a free lipase.
Assuntos
Candida/genética , Técnicas de Visualização da Superfície Celular , Lipase/genética , Pichia/genética , Técnicas do Sistema de Duplo-Híbrido , Candida/enzimologia , Catálise , Biologia Computacional/métodos , Estabilidade Enzimática , Expressão Gênica , Genes Reporter , Concentração de Íons de Hidrogênio , Lipase/metabolismo , Pichia/metabolismo , TemperaturaRESUMO
A partir do estudo da epistemologia de Bachelard na disciplina Lógica e Filosofia da Ciência da Pós-Graduação em Bioquímica do Instituto de Química/Universidade Federal do Rio de Janeiro (IQ/UFRJ), buscou-se identificar obstáculos epistemológicos entre pós-graduandos em bioquímica e áreas correlatas. Um questionário com perguntas e excertos de artigos científicos de revistas de alto fator de impacto foi respondido, anonimamente, por pós-graduandos de diferentes cursos da UFRJ e de outras universidades, que nunca cursaram disciplina relacionada à epistemologia. Foi possível identificar concepções vitalistas (animismo) tanto nas respostas às perguntas como na aceitação ou não identificação deste obstáculo nos excertos. O obstáculo pragmático e unitário foi identificado através de uma concepção teleológica dos processos evolutivos, em afirmações como a existência de objetivos/finalidades na adaptação dos organismos. Verificou-se a presença de figuras de linguagem, metáforas e analogias (obstáculo verbal) na explicação da evolução e do sistema imune, também encontradas nos excertos dos artigos. Foram também identificados obstáculos associados à observação primeira e generalização prematura. A partir deste diagnóstico verificou-se a necessidade de enfatizar o caráter objetivo, material, não teleológico da bioquímica, em disciplinas oferecidas desde a graduação.
Assuntos
Humanos , Religião , Bioquímica , Comportamento VerbalRESUMO
A partir do estudo da epistemologia de Bachelard na disciplina Lógica e Filosofia da Ciência da Pós-Graduação em Bioquímica do Instituto de Química/Universidade Federal do Rio de Janeiro (IQ/UFRJ), buscou-se identificar obstáculos epistemológicos entre pós-graduandos em bioquímica e áreas correlatas. Um questionário com perguntas e excertos de artigos científicos de revistas de alto fator de impacto foi respondido, anonimamente, por pós-graduandos de diferentes cursos da UFRJ e de outras universidades, que nunca cursaram disciplina relacionada à epistemologia. Foi possível identificar concepções vitalistas (animismo) tanto nas respostas às perguntas como na aceitação ou não identificação deste obstáculo nos excertos. O obstáculo pragmático e unitário foi identificado através de uma concepção teleológica dos processos evolutivos, em afirmações como a existência de objetivos/finalidades na adaptação dos organismos. Verificou-se a presença de figuras de linguagem, metáforas e analogias (obstáculo verbal) na explicação da evolução e do sistema imune, também encontradas nos excertos dos artigos. Foram também identificados obstáculos associados à observação primeira e generalização prematura. A partir deste diagnóstico verificou-se a necessidade de enfatizar o caráter objetivo, material, não teleológico da bioquímica, em disciplinas oferecidas desde a graduação