Efeitos da obesidade induzida por dieta hipercalórica e de seu tratamento com exenatida sobre a neurotransmissão colinérgica muscarínica em hipocampo de ratos / Effects of obesity induced by hypercaloric diet and its treatment with exenatide on the muscarinic cholinergic neurotransmitter in rat hippocampus

ABSTRACT

Introduction: Molecular cloning studies have revealed the existence of five distinct muscarinic acethylcholine receptor (mAChRs) subtypes (M1 to M5), which interact, via a G protein-regulated process, with multiple effector systems. The M1, M3 and M5 subtypes couple primarily to PLC-mediated phosphoinositide hydrolysis, while the M2 and M4 subtypes couple primarily to adenylyl cyclase inhibition. In the Hippocampus, the modulation of excitatory transmission by mAChRs seems particularly relevant to learning and memory processing in the hippocampal formation, where the diversity and differential localization of the receptors are likely to account for the complex cholinergic modulation in this structure. Experimental studies has been shown that obesity-associated with hypercaloric diet impair learning and memory in rodents, suggesting a strong association between obesity and cognitive dysfunction. However, the mechanisms of how the obesity induced by hypercaloric diet affect memory are not understood fully. Objective: The aim of this study was to investigate the possible effects of obesity induced by hypercaloric diet and its treatment with exenatide, an antidiabetogenic and potential antiobesogenic drug derived from the venom of the Gila monster Heloderma suspectum, on the affinity, density, subtypes and intracellular signaling pathways linked to activation of mAChRs in rat hippocampus. Methodology: Male Wistar rats were divided into three groups control (CT), obese induced by hypercaloric diet (DIO) and DIO treated with exenatide (DIO+E). The experimental procedures were approved by the Research Ethics Committee of the Butantan Institute (# 22381003/17). In the hippocampus obtained from CT, DIO and DIO+E were performed I- [ 3H]QNB binding to determine the affinity (KD) and density (Bmax) of mAChRs; II- Expression of each mAChR subtype (M1 to M5) by immunoprecipitation assays and III- Determination of [3H]inositol phosphates accumulation. Results: Specific binding analysis showed that the affinity did not differ among CT, DIO and DIO+E. In contrast, the density of mAChRs obtained in DIO animals was lower than that obtained from CT rats. Moreover, the density of mAChRs from DIO+E was similar when compared with CT rats. Immunoprecipitation assays induced a decrease in the expression of M1 and M3 subtypes of DIO animals when compared with CT. Treatment with exenatide (DIO+E) recovered the expression of the two subtypes similar to CT. On the other hand, the M2, M4 and M5 subtypes did not differ among CT, DIO and DIO+E. Carbacol caused a concentration-dependent increase in the accumulation of [3 H]inositol phosphates in the 3 experimental groups. However, the magnitude of the maximal response to carbachol was lower in the DIO group compared to CT and DIO+E animals, which did not differ from each other. Conclusion: Our results indicate that obesity induced by hypercaloric diet strongly influences the expression and intracellular signaling coupled to M1-M3 subtypes. The exenatide reversed these effects, suggesting an important role on hippocampal muscarinic cholinergic system. This action of obesity might be a key step mediating cellular events important for learning and memory.

RESUMO

Introdução: Estudos de clonagem molecular revelaram a existência de cinco diferentes subtipos de receptores muscarínicos de acetilcolina (mAChRs) (M1-M5) que interagem com múltiplos sistemas efetores através de um processo regulado pela proteína G. Os subtipos M1, M3 e M5 acoplam-se principalmente à hidrólise do fosfoinositídeos mediada pela fosfolipase C. Por outro lado, os subtipos M2 e M4 acoplam-se principalmente à inibição da adenililciclase. No hipocampo, a modulação da transmissão excitatória pelos mAChRs é relevante para o aprendizado e o processamento da memória aonde a diversidade e a localização diferencial dos mAChRs são responsáveis pela complexa modulação colinérgica nessa estrutura. Estudos experimentais demonstraram que a obesidade induzida por dieta hipercalórica prejudica o aprendizado e a memória em roedores, sugerindo uma associação entre obesidade e disfunção cognitiva. No entanto, os mecanismos pelos quais a obesidade afeta os processos cognitivos não são totalmente compreendidos. Objetivo: O objetivo deste estudo foi investigar os possíveis efeitos da obesidade induzida por dieta hipercalórica e seu tratamento com exenatida, uma droga anti- diabetogênica e anti-obesogênica, derivada do veneno do Monstro-de-Gila (Heloderma suspectum), sobre a afinidade, densidade, subtipos e sinalização intracelular acoplada à ativação de mAChRs no hipocampo de ratos. Metodologia: Ratos machos Wistar foram divididos em três grupos controle (CT), obeso induzido por dieta hipercalórica (DIO) e DIO tratado com exenatida (DIO+E). Os procedimentos experimentais foram aprovados pelo Comitê de Ética em Pesquisa do Instituto Butantan (no 22381003/17). No hipocampo obtido de animais CT, DIO e DIO+E foram realizados I- Ensaios de saturação da ligação do [3H]QNB para determinar os parâmetros farmacológicos KD (afinidade) e Bmax (densidade); II- A expressão de cada subtipo de receptor muscarínico (M1 a M5) por ensaios de imunoprecipitação com anticorpo que reconhece cada um dos subtipos de mAChRs e III- Determinação do conteúdo intracelular de [3H]fosfatos de inositol. Resultados: A análise da ligação específica mostrou que a afinidade não diferiu entre os grupos CT, DIO e DIO-E. Contrariamente, a densidade de mAChRs obtida nos animais DIO foi menor que a observada em ratos CT. A densidade dos animais DIO+E foi similar ao CT. Animais DIO induziram uma diminuição na expressão dos subtipos M1 e M3 quando comparada com o CT. O tratamento com exenatida (DIO+E) recuperou a expressão dos dois subtipos similar ao CT. Por outro lado, os subtipos M2, M4 e M5 não diferiram entre os grupos CT, DIO e DIO+E. O carbacol causou um aumento, dependente da concentração, sobre o acumulo de [3H]fosfatos de inositol nos 3 grupos experimentais. Entretanto, a magnitude da resposta máxima ao carbacol foi menor no grupo DIO comparativamente aos animais CT e DIO+E que não diferiram entre si. Conclusão: Nossos resultados indicam que a obesidade induzida por dieta hipercalórica, influência de maneira contundente, por meio da diminuição da expressão e sinalização intracelular acoplada aos subtipos M1 e M3. A exenatida reverteu esses efeitos, sugerindo ter um papel importante na neurotransmissão colinérgica muscarínica hipocampal. O presente estudo é também o primeiro passo para outras abordagens como a avaliação da importância funcional dessa modulação sobre os mAChRs no hipocampo.