Effects of propofol on inflammatory response and activation of p38 MAPK signaling pathway in rats with ventilator-induced lung injury

ABSTRACT Purpose: To investigate the effects of propofol on inflammatory response and activation of p38 mitogen-activated protein kinase (MAPK) signaling pathway in rats with ventilator-associated lung injury (VALI). Methods: Thirty-six Sprague Dawley (SD) rats were divided into control, VALI and VALI+propofol groups. The VALI group received the mechanical ventilation for 2 h. The VALI+propofol group received the mechanical ventilation for 2 h, which was accompanied by intravenous injection of propofol with dose of 8 mg·kg-1·h-1. At the end, the mean arterial pressure (MAP) and blood gas indexes were measured, and the lung wet/dry mass ratio (W/D) and biochemical indexes of lung tissue and bronchoalveolar lavage fluid (BALF) were determined. Results: Compared with VALI group, in VALI+propofol group the blood pH, partial pressure of oxygen, partial pressure of carbon dioxide and MAP were increased, the lung W/D, lung tissue myeloperoxidase activity and total protein concentration, white blood cell count, and tumor necrosis factor α, interleukin 1β and interleukin 6 levels in BALF were decreased, and the p-p38 MAPK protein expression level and phosphorylated p38 MAPK (p-p38 MAPK)/p38 MAPK ratio were decreased. Conclusions: Propofol treatment may alleviate the VALI in rats by reducing the inflammatory response and inhibiting the activation of p38 MAPK signaling pathway.

Produção de embriões partenogenéticos de cutias usando Cloreto de Estrôncio e Citocalasina B / Production of parthenogenetic embryos from agoutis using strontium chloride and cytochalasin B

The study aimed to evaluate the effect of strontium chloride (SrCl2) with cytochalasin B (CB) on the activation of agouti oocytes matured in vitro for embryo production. Thus, ovaries were used for oocyte recovery by slicing. Subsequently, viable oocytes were destined for in vitro maturation (IVM) and after 24 h evaluated for the expansion and viability of the cumulus cells and presence of the first polar body (1PB). After IVM, oocytes were activated with a combination of 10 mM SrCl2 and 5 μg/mL CB for 6 h and evaluated for embryo development kinetics. Hence, 93.3% of cumulus cell expansion was observed, with 91.2% viability and 37.3% of oocytes with the presence of 1PB. Regarding embryonic development, 43.2% (19/44) of cleaved structures and 6.8% (3/44) of morulae were observed in relation to the number of oocytes and 18.8% (3/16) morulae in relation to the number of cleaved structures. Thus, the combination of SrCl2 with CB promoted the activation of oocytes matured in vitro from agouti resulting in morulae. Finally, with this study, fundamental steps for in vitro conservation through reproductive biotechniques were developed in agoutis.

Produção de embriões partenogenéticos de cutias usando Cloreto de Estrôncio e Citocalasina B / Production of parthenogenetic embryos from agoutis using strontium chloride and cytochalasin B

The study aimed to evaluate the effect of strontium chloride (SrCl2) with cytochalasin B (CB) on the activation of agouti oocytes matured in vitro for embryo production. Thus, ovaries were used for oocyte recovery by slicing. Subsequently, viable oocytes were destined for in vitro maturation (IVM) and after 24 h evaluated for the expansion and viability of the cumulus cells and presence of the first polar body (1PB). After IVM, oocytes were activated with a combination of 10 mM SrCl2 and 5 μg/mL CB for 6 h and evaluated for embryo development kinetics. Hence, 93.3% of cumulus cell expansion was observed, with 91.2% viability and 37.3% of oocytes with the presence of 1PB. Regarding embryonic development, 43.2% (19/44) of cleaved structures and 6.8% (3/44) of morulae were observed in relation to the number of oocytes and 18.8% (3/16) morulae in relation to the number of cleaved structures. Thus, the combination of SrCl2 with CB promoted the activation of oocytes matured in vitro from agouti resulting in morulae. Finally, with this study, fundamental steps for in vitro conservation through reproductive biotechniques were developed in agoutis.(AU)

Hypercapnia attenuates ventilator-induced lung injury through vagus nerve activation

Purpose:To investigate the role of vagus nerve activation in the protective effects of hypercapnia in ventilator-induced lung injury (VILI) rats.Methods:Male Sprague-Dawley rats were randomized to either high-tidal volume or low-tidal volume ventilation (control) and monitored for 4h. The high-tidal volume group was further divided into either a vagotomy or sham-operated group and each surgery group was further divided into two subgroups: normocapnia and hypercapnia. Injuries were assessed hourly through hemodynamics, respiratory mechanics and gas exchange. Protein concentration, cell count and cytokines (TNF-α and IL-8) in bronchoalveolar lavage fluid (BALF), lung wet-to-dry weight and pathological changes were examined. Vagus nerve activity was recorded for 1h.Results:Compared to the control group, injurious ventilation resulted in a decrease in PaO2/FiO2 and greater lung static compliance, MPO activity, enhanced BALF cytokines, protein concentration, cell count, and histology injury score. Conversely, hypercapnia significantly improved VILI by decreasing the above injury parameters. However, vagotomy abolished the protective effect of hypercapnia on VILI. In addition, hypercapnia enhanced efferent vagus nerve activity compared to normocapnia.Conclusion:These results indicate that the vagus nerve plays an important role in mediating the anti-inflammatory effect of hypercapnia on VILI.(AU)

Compared activity of agonist molecules towards ecdysone receptor in insect cell-based screening system / Comparação da atividade de moléculas agonistas em relação ao receptor de ecdisona em um sistema de triagem baseado em linhagens celulares de insetos

The ecdysone receptor, naturally activated by steroidal hormones, is a key protein for molting and reproduction processes of insects. Artificial activation of such receptor by specific pesticides induces an anomalous process of ecdysis, causing death of insects by desiccation and starvation. In this paper, we established a protocol for screening agonistic molecules towards ecdysone receptor of insect cells line S2 (Diptera) and Sf9 (Lepidoptera), transfected with the reporter plasmid ere.b.act.luc. Therefore, we set dose-response curves with the ecdysteroid 20-hydroxyecdysone, the phytoecdysteroid ponasterone-A, and tebufenozide, a pesticide belonging to the class of diacylhydrazines. In both cell lines, the median effective concentration values on reporter gene induction (EC50) of ponasterone-A was the smallest, meaning the most active agonist molecule. In Sf9 cells, tebufenozide had as smaller EC50 than 20-hydroxyecdysone, indicating the high agonistic capability and lepidopteran specificity. The protocol established in this study can be useful for a quick screening and rational research of site-specific pesticides.(AU)

O receptor de ecdisona, naturalmente ativado por hormônios esteroidais, é uma proteína-chave nos processos de muda e reprodução de insetos. A ativação artificial desse receptor por meio de pesticidas específicos induz um processo de ecdise anômala, levando o inseto à morte por dessecação e inanição. Neste trabalho, foi estabelecido um protocolo para a triagem de moléculas agonistas em relação ao receptor de ecdisona nas linhagens celulares responsivas S2 (Diptera) e Sf9 (Lepidoptera), transfectadas com o plasmídeo repórter ere.b.act.luc. Para tanto, curvas de dose-resposta foram estabelecidas com o ecdisteroide 20-hidroxiecdisona, o fitoecdisteroide ponasterona-A e tebufenozida, um pesticida pertencente à classe das diacilhidrazinas. Em ambas linhagens celulares, os valores médios de concentração efetiva para indução gênica (EC50) ponasterona-A foram menores, significando que este é o agonista mais potente. Em células Sf9, a tebufenozida apresentou EC50 menor que a 20-hidroxiecdisona, indicando uma alta atividade agonista e especificidade deste inseticida a lepidópteros. O protocolo estabelecido neste trabalho pode ser utilizado para uma rápida triagem e busca racional de pesticidas de alvo bioquímico específico.(AU)

Compared activity of agonist molecules towards ecdysone receptor in insect cell-based screening system / Comparação da atividade de moléculas agonistas em relação ao receptor de ecdisona em um sistema de triagem baseado em linhagens celulares de insetos

The ecdysone receptor, naturally activated by steroidal hormones, is a key protein for molting and reproduction processes of insects. Artificial activation of such receptor by specific pesticides induces an anomalous process of ecdysis, causing death of insects by desiccation and starvation. In this paper, we established a protocol for screening agonistic molecules towards ecdysone receptor of insect cells line S2 (Diptera) and Sf9 (Lepidoptera), transfected with the reporter plasmid ere.b.act.luc. Therefore, we set dose-response curves with the ecdysteroid 20-hydroxyecdysone, the phytoecdysteroid ponasterone-A, and tebufenozide, a pesticide belonging to the class of diacylhydrazines. In both cell lines, the median effective concentration values on reporter gene induction (EC50) of ponasterone-A was the smallest, meaning the most active agonist molecule. In Sf9 cells, tebufenozide had as smaller EC50 than 20-hydroxyecdysone, indicating the high agonistic capability and lepidopteran specificity. The protocol established in this study can be useful for a quick screening and rational research of site-specific pesticides.(AU)

O receptor de ecdisona, naturalmente ativado por hormônios esteroidais, é uma proteína-chave nos processos de muda e reprodução de insetos. A ativação artificial desse receptor por meio de pesticidas específicos induz um processo de ecdise anômala, levando o inseto à morte por dessecação e inanição. Neste trabalho, foi estabelecido um protocolo para a triagem de moléculas agonistas em relação ao receptor de ecdisona nas linhagens celulares responsivas S2 (Diptera) e Sf9 (Lepidoptera), transfectadas com o plasmídeo repórter ere.b.act.luc. Para tanto, curvas de dose-resposta foram estabelecidas com o ecdisteroide 20-hidroxiecdisona, o fitoecdisteroide ponasterona-A e tebufenozida, um pesticida pertencente à classe das diacilhidrazinas. Em ambas linhagens celulares, os valores médios de concentração efetiva para indução gênica (EC50) ponasterona-A foram menores, significando que este é o agonista mais potente. Em células Sf9, a tebufenozida apresentou EC50 menor que a 20-hidroxiecdisona, indicando uma alta atividade agonista e especificidade deste inseticida a lepidópteros. O protocolo estabelecido neste trabalho pode ser utilizado para uma rápida triagem e busca racional de pesticidas de alvo bioquímico específico.(AU)

Redes neurais artificiais na estimação de variáveis biométricas de mudas de espécies florestais produzidas em diferentes substratos / Artificial neural networks for estimating the biometric variables of seedlings from forest species produced in different substrates

O objetivo do trabalho foi avaliar o crescimento em diâmetro do coleto e altura, e a produção de matéria seca total de mudas de Myracrodruon urundeuva, Jacaranda brasiliana e Mimosa caesalpiniaefolia. Concomitantemente, desenvolveu-se uma Rede Neural Artificial (RNA) do tipo Multilayer Perceptron que seria capaz de estimar a H e a MST das mudas das espécies estudadas. As mudas foram cultivadas em ambiente protegido com 50% de sombra. Assim, os tratamentos foram considerados com cinco proporções do material orgânico (0, 20, 40, 60 e 80% v/v) na composição do substrato final (solo da área desertificada). Aos 120 dias após a semeadura, as mudas foram coletadas para determinação das variáveis biométricas. A rede MLP foi utilizada empregando-se o algoritmo de treinamento Levenberg-Marquardat. As variáveis utilizadas como entrada da MLP para a estimação da altura e massa seca das mudas foram: diâmetro do coleto, diâmetro mínimo, médio e máximo do coleto, as espécies e fontes de resíduos orgânicos (esterco bovino, esterco caprino e palha de arroz), totalizando dez entradas. Foi utilizada a função de ativação tangente hiperbólica. Como resultados, recomenda-se a proporção 80:20% (esterco bovino e/ou esterco caprino:solo da área degradada) ao substrato de cultivo para o crescimento das mudas das espécies. A adição de doses de esterco bovino e esterco caprino influenciaram o DC do...

The aim of this study was to evaluate the stem growth in diameter and height as well as the production of total dry matter from seedlings of Myracrodruon urundeuva, Jacaranda brasiliana and Mimosa caesalpiniaefolia. Concurrently, an Artificial Neural Network (RNA) of Multilayer Perceptron type that would be able to estimate the H and the MST of the seedlings of the studied species was developed. The seedlings were cultivated in a protected environment with 50% shade. Thus, the treatments were considered with five proportions of the organic material (0, 20, 40, 60 and 80% v/v) in the final substrate composition (desertified area soil). At 120 days after sowing, the seedlings were collected to determine the biometric variables. The MLP network was used with help of the Levenberg-Marquardat training algorithm. The variables used as input of the MLP for height and dry mass estimation of the seedlings were: stem diameter, minimum, medium and maximum diameter of stem; and species and sources of organic residues (cattle manure, goat manure and rice straw), totaling ten entries. The hyperbolic tangent activation function was conducted. As a result, a 80:20% ratio (bovine manure and/or goat manure: soil from the degraded area) is recommended to be used in the growing substrate for seedling growth. The addition of bovine manure and goat manure doses influenced the Jacaranda brasiliana DC...

Redes neurais artificiais na estimação de variáveis biométricas de mudas de espécies florestais produzidas em diferentes substratos / Artificial neural networks for estimating the biometric variables of seedlings from forest species produced in different substrates

O objetivo do trabalho foi avaliar o crescimento em diâmetro do coleto e altura, e a produção de matéria seca total de mudas de Myracrodruon urundeuva, Jacaranda brasiliana e Mimosa caesalpiniaefolia. Concomitantemente, desenvolveu-se uma Rede Neural Artificial (RNA) do tipo Multilayer Perceptron que seria capaz de estimar a H e a MST das mudas das espécies estudadas. As mudas foram cultivadas em ambiente protegido com 50% de sombra. Assim, os tratamentos foram considerados com cinco proporções do material orgânico (0, 20, 40, 60 e 80% v/v) na composição do substrato final (solo da área desertificada). Aos 120 dias após a semeadura, as mudas foram coletadas para determinação das variáveis biométricas. A rede MLP foi utilizada empregando-se o algoritmo de treinamento Levenberg-Marquardat. As variáveis utilizadas como entrada da MLP para a estimação da altura e massa seca das mudas foram: diâmetro do coleto, diâmetro mínimo, médio e máximo do coleto, as espécies e fontes de resíduos orgânicos (esterco bovino, esterco caprino e palha de arroz), totalizando dez entradas. Foi utilizada a função de ativação tangente hiperbólica. Como resultados, recomenda-se a proporção 80:20% (esterco bovino e/ou esterco caprino:solo da área degradada) ao substrato de cultivo para o crescimento das mudas das espécies. A adição de doses de esterco bovino e esterco caprino influenciaram o DC do...(AU)

The aim of this study was to evaluate the stem growth in diameter and height as well as the production of total dry matter from seedlings of Myracrodruon urundeuva, Jacaranda brasiliana and Mimosa caesalpiniaefolia. Concurrently, an Artificial Neural Network (RNA) of Multilayer Perceptron type that would be able to estimate the H and the MST of the seedlings of the studied species was developed. The seedlings were cultivated in a protected environment with 50% shade. Thus, the treatments were considered with five proportions of the organic material (0, 20, 40, 60 and 80% v/v) in the final substrate composition (desertified area soil). At 120 days after sowing, the seedlings were collected to determine the biometric variables. The MLP network was used with help of the Levenberg-Marquardat training algorithm. The variables used as input of the MLP for height and dry mass estimation of the seedlings were: stem diameter, minimum, medium and maximum diameter of stem; and species and sources of organic residues (cattle manure, goat manure and rice straw), totaling ten entries. The hyperbolic tangent activation function was conducted. As a result, a 80:20% ratio (bovine manure and/or goat manure: soil from the degraded area) is recommended to be used in the growing substrate for seedling growth. The addition of bovine manure and goat manure doses influenced the Jacaranda brasiliana DC...(AU)

Exposição de gametas, embriões e larvas de jundiá (Rhamdia quelen) ao 2,4-D e glifosato: efeitos sobre indicadores do equilíbrio redox e sobre a viabilidade da prole

Os agrotóxicos são produtos formulados, utilizados no ambiente agrícola visando o controle de pragas (insetos, animais, plantas ou fungos). Em viveiros escavados, o uso de herbicidas para eliminar todas as plantas aquáticas pode reduzir o habitat dos peixes, o suprimento de alimentos, o oxigênio dissolvido e a produtividade dos peixes. O objetivo deste trabalho foi avaliar os efeitos dos herbicidas 2,4-D, glifosato e a mistura de ambos sobre o estresse oxidativo, a genotoxicidade, as taxas de fertilização, eclosão, normalidade larval e sobre os parâmetros espermáticos em jundiás. Foram realizados dois experimentos, os quais foram distribuídos em delineamento experimental inteiramente casualizado, compostos por dez tratamentos e três repetições. Os tratamentos foram constituídos pelo uso de água com diferentes concentrações de glifosato (3,0; 6,0; 9,0 e 12,0 mg e.a. L-1), 2,4-D (5,0; 10,0; 20,0 e 30,0 mg e.a. L-1) e a mistura de ambos (5,0 mg e.a. L-1 de 2,4-D + 10,0 mg e.a. L-1 de glifosato) tanto para a incubação dos ovos quanto para a ativação do sêmen. Os ovos e o sêmen do grupo controle foram, respectivamente, incubados e ativados em água destilada. Os ovos incubados por 1 hora em incubadoras de fibra de vidro foram transferidos para placas de cultivo celular de 24 poços a uma densidade de 5 ovos por poço, contendo 2 mL de água contaminada em cada poço. Decorridas 12 horas após a fertilização artificial, foi mensurada a taxa de fertilização. A taxa de eclosão foi mensurada 38 horas após a fertilização artificial. A taxa de normalidade larval foi mensurada 62 horas após a fertilização artificial. Os ovos incubados por 1 hora em incubadoras de fibra de vidro foram transferidos para recipientes plásticos contendo 200 mL de água contaminada, a uma densidade de 3,0 mL de ovos (401 ± 33 ovos) por recipiente plástico. As larvas foram coletadas 45 horas após a fertilização artificial e, posteriormente, analisadas a atividade das enzimas catalase (CAT), glutationa-S-transferase (GST), superóxido dismutase (SOD), lipoperoxidação (LPO) e carbonilação de proteínas (PCO). Os ovos incubados por 1 hora em incubadoras de fibra de vidro foram transferidos para recipientes plásticos contendo 100 mL de água contaminada, a uma densidade de 1,5 mL de ovos (173 ± 23 ovos) por recipiente plástico. As larvas foram coletadas 48 horas após a fertilização artificial e, posteriormente, foram quantificados os danos no DNA. Alíquotas de sêmen foram avaliadas pelo plugin CASA (Computer Assisted Sperm Analysis) em software livre. O movimento dos espermatozoides foi avaliado aos 12 e 14 segundos após o início da ativação espermática. As variáveis analisadas foram: motilidade espermática, linearidade, velocidade curvilínea (VCL), velocidade média de deslocamento (VAP), velocidade em linha reta (VSL) e velocidade espermática (VE). A exposição ao glifosato e à mistura dos herbicidas diminuiu significativamente a fertilização dos ovócitos e a eclosão dos ovos. A água contaminada com o 2,4-D não afetou as taxas de fertilização e eclosão. As diferentes concentrações de 2,4-D e glifosato, além da mistura de ambos, não afetaram as taxas de normalidade larval. A atividade da CAT, da GST, da LPO e da PCO não foram alteradas em nenhuma das concentrações testadas de glifosato, 2,4-D e da mistura dos herbicidas. A atividade da SOD não foi evidenciada em nenhum dos tratamentos. A exposição ao 2,4-D e à mistura dos herbicidas provocou danos ao material genético das larvas de jundiá. A exposição ao glifosato não induziu a quebra na fita do DNA de larvas de jundiá. Os herbicidas 2,4-D, glifosato e a mistura de ambos foram prejudiciais para a motilidade dos espermatozoides. A linearidade, a VCL, a VAP, a VSL e a VE não foram afetadas pelo uso do glifosato, do 2,4-D e da mistura dos herbicidas. Nossos resultados mostram que apesar de terem sido utilizadas altas concentrações dos herbicidas, foram detectadas alterações causadas pelos mesmos em apenas alguns dos biomarcadores testados.

Pesticides are products formulated used in the agricultural environment to control pests (insects, animals, plants, or fungi). In excavated ponds, the use of herbicides to eliminate all aquatic plants can reduce fish habitat, food supply, dissolved oxygen, and fish productivity. The objective of this work was to evaluate the effects of the herbicides 2,4-D, glyphosate, and the mixture of both on oxidative stress, genotoxicity, the rates of fertilization, hatching, larval normality, and on sperm parameters in silver catfish. Two experiments were carried out, which were distributed completely randomized experimental design, composed by ten treatments and three replications. The treatments consisted of using water with different concentrations of glyphosate (3.0; 6.0; 9.0 and 12.0 mg a.e. L-1), 2.4-D (5.0; 10.0; 20.0 and 30.0 mg a.e. L-1) and the mixture of both (5.0 mg a.e. L-1 of 2,4-D + 10.0 mg a.e. L-1 of glyphosate) both for the incubation of eggs and semen activation. The eggs and semen of the control group were incubated and activated in distilled water, respectively. Eggs incubated for 1 hour in fiberglass incubators were transferred to 24-well cell culture plates at a density of 5 eggs per well, containing 2 mL of contaminated water in each well. 12 hours after artificial fertilization, the fertilization rate was measured. The hatching rate was measured 38 hours after artificial fertilization. The rate of larval normality was measured 62 hours after artificial fertilization. Eggs incubated for 1 hour in fiberglass incubators were transferred to plastic containers containing 200 mL of contaminated water, at a density of 3.0 mL of eggs (401 ± 33 eggs) per plastic container. The larvae were collected 45 hours after artificial fertilization and, subsequently, analyzed the activity of the enzymes catalase (CAT), glutathione-S-transferase (GST), superoxide dismutase (SOD), lipoperoxidation (LPO), and protein carbonylation (PCO). Eggs incubated for 1 hour in fiberglass incubators were transferred to plastic containers containing 100 mL of contaminated water, at a density of 1.5 mL of eggs (173 ± 23 eggs) per plastic container. The larvae were collected 48 hours after artificial fertilization and, subsequently, DNA damage was quantified. Semen aliquots were evaluated by the CASA plugin (Computer Assisted Sperm Analysis) in free software. Sperm movement was assessed at 12 and 14 seconds after the start of sperm activation. The variables analyzed were: sperm motility, linearity, curvilinear velocity (VCL), average path velocity (VAP), straight-line velocity (VSL), and sperm velocity (VE). Exposure to glyphosate and the mixture of herbicides significantly decreased the fertilization of oocytes and the hatching of eggs. Water contaminated with 2,4-D did not affect fertilization and hatching rates. The different concentrations of 2,4-D and glyphosate, in addition to the mixture of both, did not affect the rates of larval normality. The activity of CAT, GST, LPO, and PCO were not altered in any of the tested concentrations of glyphosate, 2,4-D, and the mixture of herbicides. SOD activity was not evident in any of the treatments. Exposure to 2,4-D and the mixture of herbicides caused damage to the genetic material of larvae silver catfish. Exposure to glyphosate did not induce DNA strand break in larvae silver catfish. The herbicides 2,4-D, glyphosate, and the mixture of both were harmful to sperm motility. Linearity, VCL, VAP, VSL, and VE were not affected by the use of glyphosate, 2,4-D, and the mixture of herbicides. Our results show that although high concentrations of the herbicides were used, changes caused by them were detected in only some of the tested biomarkers.

Effects of water pH on gamete activation, embryonic development, and larval normality in Prochilodus lineatus / Efeitos do pH da água na ativação dos gametas, desenvolvimento embrionário e normalidade larval no Prochilodus lineatus

We investigated the effects of breeding water pH on the spermatic motility, artificial fertilization, and initial development of offspring in curimba, Prochilodus lineatus. After hormonal induction, we conducted gamete activation, artificial fertilization, and embryo incubation in water with pH values of 4.43 ± 0.13, 5.82 ± 0.14, 7.37 ± 0.10, 8.21 ± 0.06, and 9.57 ± 0.16. When the water pH was 6.65, spermatic motility was maintained for ?25.21 s (P 0.05). The highest fertilization rates (P 0.05) were obtained when the water pH ranged from 5.82 ± 0.14 to 8.21 ± 0.06, and the highest hatching rates (P 0.05) were observed when the water pH was 7.37 ± 0.10. A water pH of between 7.37 ± 0.10 and 8.21 ± 0.06 resulted in more complete formation of the perivitelline space (P 0.05); additionally, embryos incubated in alkaline waters produced a higher percentage of normal larvae (P 0.05), despite increased mortality levels. Our results indicate that the pH of the water used for gamete activation, artificial oocyte fertilization, and incubation of eggs and larvae of P. lineatus should be ~7, in order to promote successful breeding and normal larval production.(AU)

Foram investigados os efeitos do pH da água de criação na motilidade espermática, fertilização artificial, e no desenvolvimento inicial da prole de curimba, Prochilodus lineatus. Após a indução hormonal, realizamos a ativação dos gametas, fecundação artificial e incubação dos embriões em água com os valores de pH de 4,43 ± 0,13, 5,82 ± 0,14, 7,37 ± 0,10, 8,21 ± 0,06 e 9,57 ± 0,16. Quando o pH da água foi de 6,65, a motilidade espermática foi mantida em ?25.21 s (P 0,05). As maiores taxas de fertilização (P 0,05) foram obtidas quando o pH da água variou de 5,82 ± 0,14 a 8,21 ± 0,06, e as maiores taxas de eclosão (P 0,05) foram observadas quando o pH da água foi de 7,37 ± 0,10. O pH da água entre 7,37 ± 0,10 e 8,21 ± 0,06 resultou na formação mais completa do espaço perivitelino (P 0,05); Além disso, os embriões incubados em águas alcalinas tiveram maior porcentagem de larvas normal (P 0,05), apesar do aumento dos níveis de mortalidade. Os nossos resultados indicam que o pH da água utilizada para a ativação dos gametas, a fertilização artificial do ovócitos, e de incubação dos ovos e larvas de P. lineatus deve ser ~ 7, a fim de promover a criação e produção bem sucedida de animais e de larvas normais.(AU)

ESTABELECIMENTO DE CARIOPLASTOS E CITOPLASTOS DE CATETOS, Pecari tajacu (LINNAEUS, 1758), VISANDO A CLONAGEM POR TRANSFERÊNCIA NUCLEAR DE CÉLULA SOMÁTICA EM TAIASSUÍDEOS

O direcionamento dos primeiros passos para a realização da transferência nuclear de célula somática (TNCS) em catetos garantirá uma ferramenta efetiva na conservação da espécie, perante sua acelerada diminuição populacional e sua atividade ecológica indispensável para o ecossistema. Para tanto, a presente tese foi dividida em duas etapas (três experimentos por etapa), sendo a primeira etapa o estudo das células doadoras de núcleo ou carioplastos e a segunda etapa, o estudo das células doadoras de citoplasma ou citoplastos. Assim, diante da importância de carioplastos de qualidade reconhecida para a TNCS, nós inicialmente estabelecemos cinco linhagens de fibroblastos de catetos, monitorando a viabilidade, atividade metabólica e estresse oxidativo, de acordo com os efeitos do número de passagens (primeira, terceira e décima) e criopreservação. Embora não haja efeito desses critérios sobre a viabilidade, células em décima passagem tiveram uma redução de seu metabolismo. Adicionalmente, células congeladas/descongeladas tiveram um aumento no número de espécies reativas de oxigênio e potencial de membrana mitocondrial. Além disso, sabendo da importância de manter estas células armazenadas em um biobanco de maneira adequada, nós otimizamos a solução crioprotetora utilizada na congelação lenta de fibroblastos de catetos. Deste modo, a solução composta por 10% de dimetilsulfóxido (DMSO) com 0,2 M de sacarose e 50% de soro fetal bovino (SFB) foi considerada a solução mais eficiente em manter a viabilidade, atividade proliferativa, metabolismo e níveis adequados de estresse oxidativo de células somáticas de catetos, quando comparada a soluções na ausência de sacarose e com 10% de SFB em diferentes combinações. Finalmente, um passo essencial no estabelecimento dos carioplastos para a TNCS consiste na sincronização das células em G0/G1 do ciclo celular. Deste modo, nós avaliamos diferentes métodos de sincronização do ciclo celular: (i) supressão de soro (SS) por um a quatro dias, (ii) inibição por contato (IC) por um a três dias e (iii) agentes químicos [DMSO, 6-dimetilaminopurina (6-DMAP), ciclohexamida (CHX), e citocalasina B (CB)] por um a dois dias, em termos de seus efeitos sobre a sincronização em G0/G1 e viabilidade. Assim, nós observamos que a IC por três dias foi o método mais eficiente para sincronização do ciclo celular e manutenção da viabilidade de fibroblastos de catetos. Portanto, com estes três experimentos, nós estabelecemos a etapa de carioplastos da TNCS de catetos, obtendo células de qualidade e aptas a serem usadas como doadoras de núcleo. Na segunda etapa, nós, inicialmente, adequamos as condições de maturação in vitro (MIV) de oócitos de catetos, avaliando o tempo de MIV e o efeito do fator de crescimento epidermal (EGF) sobre a habilidade meiótica. Assim, nós concluímos que 48 h é o período adequado para a MIV de oócitos quando comparado ao tempo de 24 h, de acordo com o potencial meiótico. Ainda, observou-se que o EGF pode ser utilizado para otimizar o meio de MIV. Finalmente, no terceiro experimento, nós avaliamos a habilidade de desenvolvimento destes oócitos após ativação artificial, usando a ionomicina como ativador primário e comparando diferentes ativadores secundários (6-DMAP, CHX e CB). Nós verificamos que a ativação química usando ionomicina e 6-DMAP foi a mais eficiente combinação, tendo esta tese alcançado como resultado significativo, uma taxa de 27,6% de blastocistos de catetos derivados da ativação oocitária artificial. Em síntese, nós obtivemos carioplastos e citoplastos que poderão ser empregados na TNCS de catetos, deixando a ponto as etapas fundamentais para a clonagem desta espécie. Ainda, destaca-se que os conhecimentos aqui gerados poderão ser aplicados em estudos de fecundação in vitro, compreensão do desenvolvimento embrionário, produção de células induzidas à pluripotência, e ensaios de toxicidade. Portanto, este trabalho foi um grande passo para a conservação de catetos.

The direction of the first steps for the achievement of somatic cell nuclear transfer (SCNT) in collared peccary will guarantee an effective tool in the conservation of the species, in view of its accelerated population decrease and its essential ecological activity for the ecosystem. Therefore, the present thesis was divided into two steps (three experiments per step), being the first step the study of the donor cells of nucleus or karyoplast and the second stage, the study of the donor cells of cytoplasm or cytoplasts. Thus, in view of the importance of acknowledge quality karyoplast for SCNT, we initially established five cell lines of collared peccary fibroblasts, monitoring viability, metabolic activity and oxidative stress, according to the effects of the number of passages (first, third and tenth) and cryopreservation. Although there is no effect of these criteria on viability, cells in tenth passage had a reduction in their metabolism. Additionally, frozen/thawed cells had an increase in the number of reactive oxygen species and mitochondrial membrane potential. Moreover, knowing the importance of maintaining these cells stored in a biobank properly, we optimize the cryoprotectant solution used in the slow freezing of collared peccary fibroblasts. Thus, the solution composed of 10% dimethyl sulfoxide (DMSO) with 0.2 M sucrose and 50% fetal bovine serum (FBS) was considered the most efficient solution in maintaining the viability, proliferative activity, metabolism and adequate levels of oxidative stress of somatic cell cells, when compared to solutions in the absence of sucrose and with 10% FBS in different combinations. Finally, an essential step in establishing the karyoplast for SCNT is the synchronization of cells in G0/G1 of the cell cycle. Thus, we evaluated different cell cycle synchronization methods: (i) serum suppression (SS) for one to four days, (ii) contact inhibition (CI) for one to three days and (iii) chemical agents [DMSO, 6-dimethylaminopurine (6-DMAP), cyclohexamide (CHX), and cytochalasin B (CB)] for one to two days, in terms of their effects on G0/G1 synchronization and viability. Thus, we observed that the IC for three days was the most efficient method for synchronizing the cell cycle and maintaining the viability of collared peccary fibroblasts. Consequently, with these three experiments, we have established karyoplast stage of SCNT in collared peccary, obtaining quality cells and able to be used as nuclear donors. In the second stage, we initially adjusted the in vitro maturation (IVM) conditions of collared peccary oocytes, evaluating the IVM time and the effect of the epidermal growth factor (EGF) on the meiotic ability. Thus, we concluded that 48 h is the appropriate period for oocyte IVM when compared to 24 h, according to meiotic potential. Still, it was observed that EGF can be used to optimize the IVM medium. Finally, in the third experiment, we evaluated the developmental ability of these oocytes after artificial activation, using ionomycin as the primary activator and comparing different secondary activators (6-DMAP, CHX and CB). We found that chemical activation using ionomycin and 6-DMAP was the most efficient combination, with this thesis achieving as a significant result, a rate of 27.6% of blastocysts of collared peccaries derived from oocyte artificial activation. In summary, we got karyoplast and cytoplasts that may be employed in the SCNT of collared peccary, leaving the point the fundamental steps for the cloning of this species. Furthermore, it is emphasized that the knowledge generated here can be applied for in vitro fertilization, studies understanding of embryonic development, production cells induced to pluripotency, and toxicity assessments. Therefore, this work was a great step for the conservation of collared peccaries.

USO DO PEPTÍDEO Ctn[1-9], DERIVADO DA TOXINA CROTALICIDINA, NA ATIVAÇÃO DE OÓCITOS BOVINOS

Em mamíferos, o influxo do cálcio é fator primordial para a ativação oocitária após ovulação de um oócito maturado e com competência ao desenvolvimento. Biotecnologias da reprodução, como a injeção intracitoplasmática de espermatozoide e tranferência nuclear de células somáticas necessitam da ativação oocitária artificial para dar continuidade ao desenvolvimento embrionário. Os estudos com as catelicidinas, presentes no veneno de cascavéis, mostraram propriedades antimicrobianas, antitumorais e antifúngicas. Além disso, o peptídeo sintético de crotalicidina (Ctn1-9), uma vipericidina relacionado à família das catelicidinas, possui capacidade de promover influxo de cálcio em células cancerígenas. Portanto, este trabalho teve como objetivo avaliar o efeito do (Ctn1-9), ligado covalentemente com a Rodamina B (RhoB-Ctn1-9), na ativação oocitária e no posterior desenvolvimento de embriões bovinos produzidos por partenogênese. Ovários bovinos foram colhidos em abatedouro local e foram puncionados os folículos medindo entre 2-8 mm. Os complexos cumulus-oócito obtidos (n = 1599) foram submetidos à maturação in vitro por 26 h e então divididos (n= 1178) nos diferentes grupos experimentais: Ctn1-9 (0, 1, 10 e 40 M) e grupo controle (ionomicina 5 M), com tempo de exposição de 4 min em todos os grupos. Posteriormente, os oócitos foram incubados por 4 h com 6-DMAP em meio SOF, seguido de cultivo in vitro em meio SOF por sete dias. A análise estatística foi realizada utilizando o software Minitab. Os dados são apresentados como porcentagem e comparados através do teste exato de Fisher. Os resultados foram considerados significativos quando P < 0,05. No dia dois de cultivo, em relação à taxa de clivagem, não houve diferença estatística (P > 0,05) entre as concentrações 1 M (19,6%), 10 M (22,4%) e 40 M (14,7%), entretanto o grupo 1 M e 10 M foram significativamente maiores (P < 0,05) do que o grupo 0 M (8,4%). Para a taxa de formação de blastocisto, grupos 0 M (0,6%), 10 M (1,8%) e 40 M (2,2%) não demonstraram diferença significativa (P > 0,05) entre eles, porém o grupo 40 M foi significativamente maior (P < 0,05) do que o grupo 1 M (0%). Em conclusão, o RhoB-Ctn[1-9] demonstrou ser capaz de induzir a clivagem em oócitos bovinos. Além disso, a ativação e o desenvolvimento até o estádio de blastocisto mostram pouca ou nenhuma toxicidade deste peptídeo como agente ativador de oócitos bovinos.

In mammals, calcium influx is critical to oocyte activation post-ovulation of a matured oocyte with competence to development. Reproductive biotechnologies such as intracytoplasmic sperm injection and somatic cell nuclear transfer necessarily use artificial oocyte activation to continue embryo development. The studies on cathelicidins, present in pit rattlesnake venom, showed antimicrobial, antitumor and antifungal properties. In addition, the synthetic peptide from crotalicidin (Ctn1-9), a vipericidin related to the cathelicidin family, has the capacity to promote calcium influx in cancer cells. Thus, the aim of this study was to evaluate the effect of Ctn[1-9], covalently conjugated with Rhodamine B (RhoB-Ctn1-9), on oocyte activation and development of bovine embryos produced by parthenogenesis. Bovine ovaries were collected in local abattoir and follicles measuring 2-8 mm were punctured. Cumulus-oocyte complexes (n = 1599) were subjected to in vitro maturation for 26 h and then divided (n= 1178) to different experimental groups: Ctn1-9 (0; 1; 10 and 40 M) and control group (ionomycin 5 M), with 4 min exposure time for all groups. Then, oocytes were incubated for 4 h in 6-DMAP in SOF medium and followed for in vitro culture in SOF medium for seven days. Statistical analysis were performed using Minitab software. Data are shown as percentage and compared by Fishers exact test. Results were significant when P < 0.05. In day two of culture, concerning cleavage rate, there was no statistical difference (P > 0.05) between concentration 1 M (19.6%), 10 M (22.4%) and 40 M (14.7%), however group 1 M and 10 M were significantly higher (P < 0.05) than group 0 M (8.4%). For the blastocyst formation rate, groups with 0 M (0.6%), 10 M (1.8%) and 40 M (2.2%) showed no significant difference (P > 0.05) among them, yet group 40 M was significantly higher (P < 0.05) than group 1 M (0%). In conclusion, RhoB-Ctn[1-9] showed to be able to induced cleavage in bovine oocytes. In addition, the activation and development to the blastocyst stage show little or no toxicity of this peptide as an activating agent for bovine oocytes.

Body surface temperature in crossbred dairy cows on Triângulo Mineiro/Brazil climatic conditions / Temperatura de superfície corporal em vacas leiteiras mestiças em condições climáticas do Triângulo Mineiro/Brasil

Cattle, when in heat stress, deflect energy to increase dissipation to environment, compromising productivity. Thus, in dairy production system it is important to maintain thermal comfort to ensure homeothermy and full performance. One of the physiological measures to evaluate thermal comfort of domestic animals is hair coat surface temperature. Knowing this temperature allows the understanding whether animal performs thermal exchanges by convection through the activation of heat dissipation latent mechanisms. This study aimed to evaluate body surface temperature in crossbred dairy cows on Triângulo Mineiro climatic conditions. This was carried out at Estação Experimental Glória of Universidade Federal de Uberlândia using 53 lactating crossbred cows. Cows were housed in shaded pen for artificial insemination and after it was performed body surface temperature mensurements. Temperature was measured from body surface at four different regions: forehead, withers, groin and hock using an Instruterm infrared thermometer model TI-890. The statistical model used the region to test the effect of surface temperature comparing means by Tukeys test, with a significance level of 5%. Means and standard deviations of ambient temperature, maximum temperature, minimum temperature and relative humidity were respectively 23.96 ± 2.57C; 29.43 ± 2.50C; 17.54 ± 2.38C; and 67.18 ± 15.39%. Temper

O artigo não apresenta resumo em português.

UTILIZAÇÃO DO PROCESSO BIOTECNOLÓGICO DO OVÁRIO ARTIFICIAL PARA AVALIAR A TOXICIDADE DO VITONOLIDO D E DA QUINOXALINA SOBRE OS FOLÍCULOS PRÉ-ANTRAIS CAPRINOS

Embora o número de novos casos de câncer venha aumentando anualmente, o número de sobreviventes também vem crescendo ao longo dos anos, em função do diagnostico precoce e de tratamentos quimioterápicos mais efetivos. Porém, dentre os grandes efeitos indesejáveis da quimioterapia, destaca-se a resistência a multi-drogas (RMD) e a falha ovariana que leva à infertilidade. Portanto, a presente estudo teve dois principais objetivos: 1) imunolocalizar membros da família de proteínas conhecidas como Transportadores ABC (ABCB1, ABCC2 e ABCG2) no tecido ovariano caprino (Fase 1) e 2) avaliar a toxicidade de dois novos compostos com potencial anticâncer, ou seja, o Vitanolido D - VD (Fase 2) e a Quinoxalina - QX (Fase 3) sobre os folículos pré-antrais (primordiais, primários e secundários) cultivados in vitro no interior do tecido ovariano. Na Fase 1, ovários de cabras foram processados e analisados por imuno-histoquímica, qPCR e Western Blottingg para a identificação do ABCB1, ABCC2 e ABCG2. Nas Fases 2 e 3, fragmentos do córtex ovariano foram cultivadas in vitro por 2 e 6 dias em -MEM+ ou -MEM+ adicionado de paclitaxel (PTX controle negativo) ou em diferentes concentrações de VD (1.5, 3.0 e 6.0 M) ou QX (1.5, 3.0 e 6.0 M), respectivamente. Nessas duas fases os folículos foram analisados antes (controle) e após o cultivo na presença dos compostos, considerando-se morfologia e ativação folicular; proliferação (Ki67) e apoptose (TUNEL) das células granulosa, a expressão proteica do ABCB1 e gênica dos fatores reguladores do ciclo celular ciclinas (A - CCNA, B1 - CCNB1, D1 - CCND1 e E1 - CCNE1) e quinases dependentes de ciclina (1 - CDK1; 2 - CDK2, 4 - CDK4 e 6 - CDK6)]. Os resultados mostraram que os três transportadores ABCs foram positivamente imunomarcadas em todas as categorias foliculares estudadas. No tocante aos compostos, a toxicidade do VD6.0 foi similar ao PTX e superior (P <0,05) às demais concentrações (1.5 e 3.0 M), após 2 e 6 dias. A QX também apresentou alta toxicidade aos folículos pré-antrais, especialmente na mais alta concentração (6.0 M), causando um bournout folicular e apoptose, superiores às concentrações de 1.5 e 3.0 M. Ao contrário do VD, a QX inibiu a expressão do ABCB1 nos folículos pré-antrais. Esse trabalho mostrou pela primeira vez que três membros da família dos ABC transportadores foram identificados no ovário caprino. Apesar dos valiosos resultados obtidos nesse estudo, os dois compostos, isto é, o VD e a QX, necessitam ser melhor investigados, sob o ponto de vista da função ovariana, visando auxiliar na sua utilização como agentes quimioterápicos com menor risco para a fertilidade feminina.

Although the number of new cases of cancer increases annually, the number of survivors has also increased over the years, due to the early diagnosis and more effective chemotherapy treatments. However, among the great undesirable effects of chemotherapy, the multidrug resistance (MDR) and the ovarian failure that lead to infertility. Therefore, the present thesis had two main objectives: 1) to immunolocalize members of the family of proteins known as ABC transporters (ABCB1, ABCC2 and ABCG2), responsible for the phenomenon of RMD in goat ovarian tissue (Phase 1) and 2) to evaluate the toxicity of two new compounds with anticancer potential, the Vitanolide D - VD (Phase 2) and Quinoxaline - QX (Phase 3) on the preantral follicles (primordial, primary and secondary) grown in vitro inside the ovarian tissue. In Phase 1, goat ovaries were processed and analyzed by immunohistochemistry, qPCR and Western Blotting for identification of ABCB1, ABCC2 and ABCG2. In Phases 2 and 3, fragments of the ovarian cortex were cultured in vitro for 2 or 6 days in -MEM+ or -MEM+ supplemented with paclitaxel (PTX - negative control) or at different RV concentrations (1.5, 3.0 and 6.0 M) or QX (1.5, 3.0 and 6.0 M), respectively. In these two phases the follicles were analyzed before (control) and after the culture in the presence of the compounds, considering morphology and follicular activation; proliferation (Ki67) and apoptosis (TUNEL) of the granulosa cells, the protein expression of ABCB1 and the gene of cyclin - cyclin regulatory factors (A - CCNA, B1 - CCNB1, D1 - CCND1 and E1 - CCNE1) and cyclin - dependent kinases 1-CDK1; 2-CDK2, 4-CDK4 and 6-CDK6)]. The results showed that the three ABCs transporters were positively immunolabelled in all follicular categories studied. Regarding the compounds, the toxicity of VD6.0 was similar to PTX and higher (P < 0.05) at the other concentrations (1.5 and 3.0 M) after 2 and 6 days. QX also showed high toxicity to the preantral follicles, especially in the highest concentration (6.0 M), causing a follicular burnout and apoptosis, higher than the concentrations of 1.5 and 3.0 M. Unlike VD, QX inhibited the expression of ABCB1 in preantral follicles. This work showed for the first time that three members of the family of ABC transporters were identified in ovary goat. Despite the valuable results obtained in this study, the two compounds, i.e., RV and QX, need to be better investigated, from the point of view of ovarian function, aiming to aid in their use as chemotherapeutic agents with lower risk for female fertility.

Initiation and s uppression of sperm motility is osmolality dependent in two South American fish species: streaked prochilod (Prochilodus lineatus) and piracanjuba(Brycon orbignyanus)

Solutions to induce or suppress the initiation of sperm motility in fish ha ve been used to improve reproductive success during artificial fertilization and preservation techniques . The aim of the present study was to evaluate the effects of three solutions (NaCl, glucose , and BTS™) - each prepared with 10 different osmolalities - on the initiation and suppression of fresh sperm motility in Prochilodus lineat us and Brycon orbignyanus . Sperm was diluted in each of the 30 solution s and immediately observed under a light microscope to determine which solution s trigger ed or suppress ed the initiation of sperm motility. When present, motility rate ( % motile sperm ) w as determined at 0, 30 , and 120 s post - activation and the motility quality score ranging from 0 ( no movement ) to 5 ( rapidly swimming sperm) was determined at 0 and 30 s post - activation . Osmolality , but not solution composition , significantly affected both motility rate and quality score . Solutions at osmolali ties up to 270 mOsm/kg in P. lineatus and up to 180 mOsm/kg in B. orbignyanus induced motility in at least 60% of sperm , with a minimum quality score of 3.0 , and were therefore classified as activating agents. The greatest motility at 0 , 30 , and 120 s post - activation was observed with solutions ranging from 135 to 225 mOsm/kg for P. lineatus and at 135 mOsm/kg for B. orbignyanus . On the other hand, solutions ranging from 360 to 450 mOsm/kg in P. lineatus and 270 to 450 mOsm/kg in B. orbignyanus suppressed motility in at least 95% of sperm and were classified as immobilizing media . The osmolality of the surrounding medium is the key factor in the initiation or suppression of sperm motility in P. lineatus a nd B. orbignyanu.

Initiation and s uppression of sperm motility is osmolality dependent in two South American fish species: streaked prochilod (Prochilodus lineatus) and piracanjuba(Brycon orbignyanus)

Solutions to induce or suppress the initiation of sperm motility in fish ha ve been used to improve reproductive success during artificial fertilization and preservation techniques . The aim of the present study was to evaluate the effects of three solutions (NaCl, glucose , and BTS™) - each prepared with 10 different osmolalities - on the initiation and suppression of fresh sperm motility in Prochilodus lineat us and Brycon orbignyanus . Sperm was diluted in each of the 30 solution s and immediately observed under a light microscope to determine which solution s trigger ed or suppress ed the initiation of sperm motility. When present, motility rate ( % motile sperm ) w as determined at 0, 30 , and 120 s post - activation and the motility quality score ranging from 0 ( no movement ) to 5 ( rapidly swimming sperm) was determined at 0 and 30 s post - activation . Osmolality , but not solution composition , significantly affected both motility rate and quality score . Solutions at osmolali ties up to 270 mOsm/kg in P. lineatus and up to 180 mOsm/kg in B. orbignyanus induced motility in at least 60% of sperm , with a minimum quality score of 3.0 , and were therefore classified as activating agents. The greatest motility at 0 , 30 , and 120 s post - activation was observed with solutions ranging from 135 to 225 mOsm/kg for P. lineatus and at 135 mOsm/kg for B. orbignyanus . On the other hand, solutions ranging from 360 to 450 mOsm/kg in P. lineatus and 270 to 450 mOsm/kg in B. orbignyanus suppressed motility in at least 95% of sperm and were classified as immobilizing media . The osmolality of the surrounding medium is the key factor in the initiation or suppression of sperm motility in P. lineatus a nd B. orbignyanu.(AU)

Caracterização seminal do acari zebra imperial Hypancistrus zebra Isbrücker e Nijssen, 1991 (Siluriformes: Loricariidae) e protocolos de criopreservação para conservação in vitro.

Neste estudo o sêmen de Hypancistrus zebra foi avaliado pela primeira vez, sendo caracterizado quanto aos parâmetros de qualidade espermática: taxa e duração da motilidade espermática, vigor espermático, integridade de membrana e morfologia espermática. Essa avaliação foi realizada em quatro momentos de coleta do sêmen no período de um ano (março de 2016; outubro de 2016; dezembro de 2016 e março de 2017), gerando o Capítulo I deste estudo. No Capítulo II, foram testadas a ativação e a inibição da motilidade espermática, soluções diluidoras e o resfriamento do sêmen de H. zebra, servindo de base para definir os protocolos de congelamento a serem testados. Estes, por sua vez, são abordados no Capítulo III, o qual testou o tempo de equilíbrio e a concentração das soluções crioprotetoras. Em todos os experimentos, os parâmetros de qualidade espermática foram avaliados antes e após a exposição aos tratamentos. Os espermatozoides de H. zebra apresentaram vigor espermático intermediário (3,00 ± 0,13) e uma longa duração da motilidade (14,72 ± 1,31 minutos), características incomuns de serem observadas em peixes de água doce. Os resultados obtidos no Capítulo I permitem concluir que o sêmen de H. zebra é de boa qualidade em qualquer época do ano, possibilitando o seu uso para a reprodução artificial e criopreservação. No Capítulo II, determinamos que a solução ativadora adequada ao sêmen de H. zebra é o NaCl 0,3%. O teste de inibição da motilidade mostrou que as soluções com osmolalidade inferior a 287,5 mOsm kg-1 são ativadoras e as soluções com osmolalidade superior são inibidoras da motilidade espermática para o sêmen da espécie. A solução de Hank (HBSS) foi o meio diluidor mais eficiente, podendo o sêmen permanecer estocado resfriado por até 72 horas. Os resultados do Capítulo III confirmam que o espermatozoide de H. zebra é muito sensível à exposição aos crioprotetores, sendo o tempo de equilíbrio de 5 minutos o mais adequado. Foi alcançado êxito no congelamento do sêmen utilizando os crioprotetores dimetilformamida 5% e dimetilsulfóxido 10%, resultando em aproximadamente 25% de células vivas. Esse resultado torna possível a formação de um banco de germoplasma para essa espécie ameaçada de extinção, permitindo a estocagem do sêmen e sua utilização para reprodução in vitro.

In this study, Hypancistrus zebra semen was evaluated for the first time, being characterized in terms of rate and duration of sperm motility, sperm vigor, membrane integrity and sperm morphology. This evaluation was carried out in four moments of semen collection over a year (March 2016, October 2016, December 2016 and March 2017), resulting the Chapter I of this study. In Chapter II, the activation and inhibition of sperm motility, extender solutions and the cooling of the H. zebra semen were tested, serving as the basis for defining the freezing protocols to be tested. These protocols are covered in Chapter III, which tested the equilibrium time and concentration of the cryoprotectant solutions. In all experiments, sperm quality parameters were evaluated before and after exposure to treatments. The spermatozoa of H. zebra presented intermediate sperm vigor (3.00 ± 0.13) and a long duration of motility (14.72 ± 1.31 min), unusual characteristics to be observed in freshwater fish. The results obtained in Chapter I allow us to conclude that H. zebra semen is of good quality at any time of the year, allowing its use for artificial reproduction and cryopreservation. In Chapter II, we determined that the adequate activating solution to the H. zebra semen is 0.3% NaCl. The motility inhibition test showed that solutions with osmolality lower than 287.5 mOsm/kg are activators and solutions with higher osmolality are inhibitors of sperm motility for the species. Hank's solution was the most efficient extender medium, and the semen could be stored for up to 72 hours. The results of Chapter III confirm that the spermatozoa of H. zebra are very sensitive to exposure to cryoprotectants, with the equilibrium time of 5 minutes being the most adequate. Success in semen freezing was achieved using 5% dimethyl formamide and 10% dimethyl sulfoxide as cryoprotectants, resulting in approximately 25% live cells. This result makes possible the formation of a germplasm bank for this endangered species, allowing the semen storage and its use for in vitro reproduction.

SOLUÇÕES IÔNICAS E NÃO IÔNICAS EMPREGADAS NA ATIVAÇÃO ESPERMÁTICA E NA FERTILIZAÇÃO ARTIFICIAL DE OVÓCITOS COM SÊMEN CRIOPRESERVADO DE JUNDIÁ (Rhamdia quelen)

O objetivo deste estudo foi ativar o sêmen criopreservado de jundiá (Rhamdia quelen) com diferentes soluções iônicas e não iônicas e, avaliar os efeitos sobre o movimento espermático e sobre as taxas de fertilização artificial. Amostras de sêmen de 24 reprodutores, submetidos à manipulação hormonal com extrato pituitário de carpa, deram origem a quatro amostras compostas ou pools de sêmen. Amostras provenientes de cada pool de sêmen foram diluídas em solução contendo 5% de frutose, 5% de leite em pó e 10% de metanol, envasadas em palhetes de 0,25mL e submetidas à criopreservação. Após o descongelamento, o sêmen foi ativado água destilada e em soluções à base de bicarbonato de sódio (0,20; 0,40; 0,60; 0,80 e 1,00%), cloreto de sódio (0,14; 0,28; 0,56; 0,70; 1,05%);cloreto de potássio (0,17; 0,35; 0,53; 0,71; 0,89%); cafeína (0,23; 0,46; 0,69; 0,93; 1,16%); frutose (0,72; 1,44; 2,16; 2,88; 3,60%); glicose (0,72; 1,44; 2,16; 2,88; 3,60%); L-carnitina (0,77; 1,55; 2,33; 3,10; 3,88%); Sacarose (1,36; 2,73; 4,10; 5,47; 6,84%). As taxas de motilidade, as velocidades e os tempos de ativação espermática foram avaliados por meio do modelo de superfície de resposta. Posteriormente, as amostras de sêmen de outros 24 machos, originaram outros quatro pools de sêmen. Estas amostras foram ativadas com as duas melhores concentrações de cada solução, exceto a cafeína e, utilizadas na fertilização artificial de ovócitos de Rhamdia quelen, empregando-se 70.000 espermatozoides móveis:ovócito. As taxas de fertilização foram avaliadas pela ANOVA, seguida pelo teste de Tukey. Todas as soluções empregadas na ativação espermática influenciaram o movimento dos espermatozóides. As maiores taxas de motilidade e velocidades espermáticas, além das maiores taxas de fertilização foram alcançadas com o emprego de soluções contendo 3,6% de glicose. Estes resultados possivelmente estão associados ao importante papel que a glicose tem no processo de respiração celular e produção de ATP. Portanto o uso da solução contendo 3,6% de glicose maximiza o movimento espermático e consequentemente as taxas de fertilização artificial dos ovócitos de jundiá (Rhamdia quelen).

The objective of this study was to activate the cryopreserved semen of jundia (Rhamdia quelen) with different ionic and nonionic solutions and to evaluate the effects on sperm movement and artificial fertilization rates. Semen samples from 24 breeding herds submitted to hormonal manipulation with pituitary carp extract gave rise to four composite samples or semen pools. Samples from each semen pool were diluted in a solution containing 5% fructose, 5% milk powder and 10% methanol, filled in 0.25 mL straw and submitted to cryopreservation. After thawing, the semen was activated distilled water and in sodium bicarbonate solutions (0.20, 0.40, 0.60, 0.80 and 1.00%), sodium chloride (0.14; 0.28, 0.56, 0.70, 1.05%), potassium chloride (0.17, 0.35, 0.53, 0.71, 0.89%); Caffeine (0.23, 0.46, 0.69, 0.93, 1.16%); Fructose (0.72, 1.44, 2.16, 2.88, 3.60%); Glucose (0.72, 1.44, 2.16, 2.88, 3.60%); L-carnitine (0.77, 1.55, 2.33, 3.10, 3.88%); Sucrose (1.36, 2.73, 4.10, 5.47, 6.84%). Motility rates, velocities and sperm activation times were assessed using the response surface model. Subsequently, semen samples from 24 other males gave rise to four other semen pools. These samples were activated with the two best concentrations of each solution, except caffeine and, used in the artificial fertilization of oocytes of Rhamdia quelen, using 70,000 mobile spermatozoa: oocyte. Fertilization rates were evaluated by ANOVA, followed by the Tukey test. All solutions employed in sperm activation influenced the movement of spermatozoa. The highest rates of motility and sperm velocity, in addition to higher fertilization rates, were achieved with solutions containing 3.6% glucose. These results are possibly associated with the important role that glucose has in the process of cellular respiration and ATP production. Therefore, the use of the solution containing 3.6% glucose maximizes the sperm movement and, consequently, the artificial fertilization rates of jundia ova (Rhamdia quelen).

Espermatologia e conservação do sêmen da tainha (Mugil liza).

O método de estocagem em temperaturas reduzidas é uma alternativa para disponibilizar sêmen de boa qualidade para inseminação artificial. Para este procedimento, é necessário definir protocolos específicos para a conservação do sêmen de cada espécie. No primeiro experimento foram analisandos 15 machos selvagens (51,5±2,2 cm e 1390,0±187,2 g) e 15 de cativeiro (28,3±1,5 cm e 231,9±34,0 g) de M. liza que apresentavam espermiação após massagem abdominal. Foram encontradas diferenças significativas no volume de sêmen, na densidade dos espermatozoides, espermatócrito, na vitalidade espermática e na morfometria. Os resultados demonstram que a idade dos peixes e as características individuais influenciam diretamente na qualidade do sêmen. Ativando os espermatozoides com soluções de diferentes salinidades e pH, o melhor tempo de motilidade foi obtido na salinidade 34,8 (189±15 seg.) e melhor porcentagem de motilidade na salinidade 34,6 (95±10%), sendo que a variação de salinidade entre 30 e 35 não gerou prejuízos significativos na motilidade dos espermatozoides da M. liza. O pH de 8,5 propiciou o maior tempo de motilidade (218±13 seg.) e 8,7 a melhor taxa de motilidade (93±12%). No experimento dois foi realizado teste de refrigeração do sêmen da espécie. Amostras de sêmen foram mantidas diluidas com CF-HBSS na proporção 1:3 (v:v) e in natura, a 4±2 °C por 96 horas. Durante este período, foi verificado aumento significativo no tempo de motilidade por 18 h, melhor taxa de vitalidade por 48 h e melhor taxa de ativação dos espermatozoides por 96 h de armazenamento quando utilizado o diluidor espermático. Estes resultados demonstram que mesmo sem diluentes o semen da tainha apresenta motilidade após 96 horas. A utilização do diluente gera uma melhora no desempenho de motilidade, podendo ser uma alternativa para aumentar o tempo de viabilidade do sêmen refrigerado de M. liza. Para os próximos estudos, é recomendavel utilizar outras substâncias diluidoras, adicionar à diluição compostos suplementares (vitaminas, antioxidantes, açúcares) e substâncias crioprotetoras e verificar sua influencia no tempo de estocagem dos espermatozoides. Testar novas composições de ativadores espermáticos, testes de fertilização, análises de motilidade computadorizadas e análises fisiológicas mais aprofundadas também são essênciais para o desenvolvimento das técnicas de conservação de sêmen

The low temperature storage method is an alternative to provide good quality semen for artificial insemination. For this procedure, it is necessary to define specific protocols for semen conservation of each species. In the first experiment 15 wild males (51.5±2.2 cm and 1390.0±187.2 g) and 15 cultured males (28.3±1.5 cm and 231.9±34.0 g) of M. liza witch presented spermiation after abdominal massage, significant differences were found in semen volume, as well as sperm density, spermatocrit, vitality and morphometry. These results demonstrate that fish age and individual characteristics directly influence semen quality. After testing spermatozoa activation with different salinities and pH solutions, the best motility time was obtained at salinity 34.8 (189±15 sec) and a better percentage of motility at salinity 34.6 (95±10%). Salinity variations between 30 and 35 did not cause significant losses in spermatozoa motility of M. liza. The pH of 8.5 provided the highest motility time (218±13 sec) and 8.7 the best motility rate (93±12%). In the experiment two was performed the refrigeration tests with this species semen, samples diluted with CF-HBSS in a ratio of 1:3 (v:v) and in natura were maintained at 4±2 °C for 96 hours. There was a significant increase in motility time for 18 h, better vitality rate for 48 h and better sperm activation rate for 96 h of storage when the spermatic diluent was used. Even without diluents the semen show motility after 96 h. The use of the HBSS-CF (1:3) diluent is a good alternative to increase the viability of the refrigerated semen of M. liza. In future studies, it is advisable using other diluting substances, adding supplementary compounds (vitamins, antioxidants, sugars) and cryoprotective substances and verifing their influence on spermatozoa storage time. Testing new compositions of sperm activators, fertilization tests, computerized motility analyzes, and more in-depth physiological analyzes are also relevant to the development of semen conservation techniques

Aspectos reprodutivos de machos de suruvi (Steindachneridion scriptum Miranda Ribeiro, 1918) na primeira maturação sexual e indução hormonal da espermiação

Este trabalho aborda aspectos relacionados com a descrição da primeira maturação gonadal de Steindachneridion scriptum, o suruvi, e de sua resposta ao uso de análogos de GnRH como indutores da espermiação em reprodutores mantidos em condições de cativeiro. Para tal, juvenis com quatro meses de idade foram estocados em condições de laboratório (250 peixes em caixas de polietileno de 750 L, indoor) e condições meio ambientais externas (480 peixes em tanques-rede de 8m3, outdoor). O desempenho zootécnico e as fases da espermatogênese foram acompanhados através de biometrias e coletas mensais das gônadas durante vinte meses de criação. Os exemplares atingiram um peso final médio de 436,78 ± 26,13 g no ambiente indoor e 107,02 ± 32,30 g no ambiente outdoor. O crescimento observado nos animais submetidos às condições de criação indoor e outdoor foi descrito pelo modelo de Ohnishi (P<0,001). A primeira maturação gonadal dos machos mantidos no ambiente indoor foi atingida aos 13 meses de idade (28,50 ± 2,15 cm), enquanto no ambiente outdoor os machos atingiram esta condição aos 22 meses de idade (20,96 ± 1,86 cm). Durante o terceiro ciclo reprodutivo dos machos (37 meses de idade) mantidos na condição indoor, 48 peixes foram distribuídos em um delineamento inteiramente ao acaso no qual os tratamentos foram doses de 4,4 mg/kg de peso vivo (PV) de EPC, 1,0 ml/kg de PV de Ovaprim®, 1,8 ml/kg de PV de acetato de buserelina, e de 1,4 ml/kg de PV de solução salina (0,9% de NaCl) como grupo controle. Não foram observadas diferenças significativas (P>0,05) para a osmolaridade, viabilidade e morfologia espermática entre os animais induzidos e não induzidos. A produção espermática total registrada nos peixes induzidos, que foi de 5,69 ± 3,30 x 1010 sptz/kg com EPC, de 7,79 ± 4,33 x 1010 sptz/kg com Ovaprim® e de 6,47 ± 3,81 x 1010 sptz/kg com acetato de buserelina, não apresentaram diferenças significativas (P>0,05), mas foram significativamente diferentes dos valores médios observados em peixes não induzidos, que foi de 1,17 ± 6,14 x 1010 sptz/kg (P<0,05). De igual forma, a motilidade e a velocidade espermática foram significativamente maiores (P<0,05) nos peixes induzidos, do que as observadas em peixes não induzidos durante os primeiros 20 s após ativação do sêmen. Todas as fases do ciclo reprodutivo incluindo a maturação final e espermiação podem ser atingidas pelos machos de S. scriptum mantidos em condições de laboratório, sendo recomendado o uso de acetato de buserelina, dentro das atividades de propagação artificial com o intuito de reduzir os custos relacionados ao uso de EPC.

This work deals with aspects related to description of the first gonadal maturation of suruvi Steindachneridion scriptum, and its response to the use of GnRH analogs as inducers of spermiation in broodstock under captive conditions. Juveniles with four-month-old were stored under laboratory condition (250 fish in polyethylene boxes of 750 L, indoor) and external condition (480 fish in 8m3 net tanks, outdoor). The zootechnical performance and the phases of spermatogenesis were monitored through biometrics and monthly collections of gonads for twenty months of breeding. Animals arrived at final weight of 436.78 ± 26.13 g in the indoor environment and 107.02 ± 32.30 g in the outdoor environment. The growth observed in animals submitted to indoor and outdoor conditions was described using the Ohnishi model (P<0.001). The first gonadal maturation of the males kept in the indoor environment was reached at 13 months of age (28.50 ± 2.15 cm), in the outdoor environment males arrived this condition at 22 months of age (20.96 ± 1.86 cm). During the third reproductive cycle of males (37 months of age) kept in indoor condition 48 animals were randomly assigned to in four treatments using total CPE doses of 4.4 mg/kg of body weight (BW), Ovaprim® doses of 1.0 ml/kg of BW, buserelin acetate doses of 1.8 ml/kg of BW and saline solution (0.9% NaCl) dose 1.4 ml/kg of BW, used as a control. No significant differences (P>0.05) were observed for osmolarity, viability and sperm morphology between the induced and non-induced animals. Total sperm production in fish induced which were 5.69 ± 3.30 x 1010 sptz/kg for CPE, 7.79 ± 4.33 x 1010 sptz/kg for Ovaprim® and 6.47 ± 3.81 x 1010 sptz/kg for buserelin acetate, did not show difference (P>0.05), but were different from non-induced animals, which was 1.17 ± 6.14 x 1010 sptz/kg (P<0.05). Also motile and sperm velocity were significantly higher (P<0.05) in induced fish than those observed in fish not induced during the first 20 s after sperm activation. All phases of the reproductive cycle, including final maturation and spermiation, can be achieved in male of S. scriptum under laboratory conditions and the use of buserelin acetate is recommended within the activities of artificial propagation to reduce costs related to the use of CPE.