Association between chronic Anaplasma marginale and Babesia spp. infection and hematological parameters of taurine heifers / Associação entre infecção crônica por Anaplasma marginale e Babesia spp. e parâmetros hematológicos de novilhas taurinas

The aim of this study was to investigate the association between chronic Anaplasma marginale and Babesia spp. infection and hematological parameters of pregnant and non-pregnant taurine heifers. Blood samples from 94 females were collected on the first day (D-10) of timed artificial insemination (TAI) protocol and on pregnancy diagnosis (D+34). Hematological parameters were determined and compared between pregnant (PG) and non-pregnant (NPG) heifers, and within group at different sampling days. Real-time PCR (qPCR) was used to determine A. marginale and Babesia bovis infection, and for absolute quantification of Babesia spp. between PG and NPG groups. Correlation analysis was performed between the number of gDNA copies (CN) of Babesia spp. and hematological parameters. On D-10, mean hemoglobin concentration was higher for NPG, and hematocrit and total plasma protein were higher on D+34 for both groups. There was no difference in Babesia spp. CN between groups. In the first qPCR, all heifers were positive for A. marginale and B. bovis. Significant correlations were found between hemoglobin and erythrocyte and between hemoglobin and hematocrit (r = 0.8082 and r = 0.3009, respectively). Low levels of A. marginale and Babesia spp. did not affect hematological parameters of chronically infected pregnant and non-pregnant taurine heifers.(AU)

O objetivo deste estudo foi investigar a associação entre infecção crônica por Anaplasma marginale e Babesia spp. e parâmetros hematológicos de novilhas taurinas prenhes e não prenhes. Sangue de 94 fêmeas foi coletado no primeiro dia (D-10) do protocolo de inseminação artificial em tempo fixo (IATF) e no diagnóstico de gestação (D+34). Parâmetros hematológicos foram comparados entre novilhas prenhes (PG) e não prenhes (NPG) e dentro dos grupos entre dias de coleta. Usando-se PCR em tempo real (qPCR), determinou-se a infecção por A. marginale e Babesia bovis e quantificação absoluta de Babesia spp. Entre os grupos PG e NPG. A análise de correlação foi realizada entre o número de cópias (CN) de Babesia spp. e parâmetros hematológicos. No D-10, a concentração de hemoglobina foi maior para NPG e hematócrito, e proteína plasmática total foram maiores em D+34 para ambos os grupos. Não houve diferença para CN de Babesia spp. entre os grupos. Na primeira qPCR, todas as novilhas foram positivas para A. marginale e B. bovis. Correlações significativas foram encontradas entre hemoglobina/eritrócito e hemoglobina/hematócrito (r=0,8082 e r=0,3009, respectivamente). Baixos níveis de A. marginale e Babesia spp. não afetaram os parâmetros hematológicos de novilhas taurinas prenhes e não prenhes cronicamente infectadas.(AU)

Performance of the tetra-primer PCR technique compared to PCR-RFLP in the search for rs12979860 (C/T) and rs8099917 (T/G) single nucleotide polymorphisms (SNPs) in the IFNL4 gene / Desempenho da técnica tetra-primer PCR em relação a PCR-RFLP na pesquisa de polimorfismos de nucleotídeos únicos (SNPs) rs12979860 (C/T) e rs8099917 (T/G) no gene IFNL4

Single nucleotide polymorphisms (SNPs, rs12979860 e rs8099917) in the Interferon Lambda 4 gene (IFNL4, formerly IFNL3and/or IL28B) has been associated with failure in the innate immune response, sustained virological response in hepatitis C, and HTLV-1-associated myelopathy (HAM) development. To search for these polymorphisms several methodologies can be employed, such as sequencing, real-time or quantitative polymerase chain reaction (qPCR), restriction fragment length polymorphism analysis in PCR products (PCR-RFLP), and tetra-primer PCR. The present study compared the performance of the tetra-primer PCR in relation to the PCR-RFLP, both optimized in the Research HTLV Laboratory of the Center of Immunology of Instituto Adolfo Lutz in São Paulo. One hundred DNA samples obtained from patients of STD/Aids Reference Centre in São Paulo, previously analyzed for IL28B SNPs by PCR-RFLP were selected for analysis, after confirming that they represent all IL28B SNPs patterns described in the literature. The results obtained showed concordance between the PCR-RFLP and the tetra-primer PCR SNPs results, and because of the low cost, easy to perform, and minor employment of biological specimen and reagents, the tetra-primer PCR is of choice to be used in routine. (AU)

Polimorfismos de nucleotídeos únicos (single nucleotide polymorphisms, SNPs rs12979860 e rs8099917) no gene que codifica o Interferon Lambda 4 (IFNL4, antigamente IFNL3 e/ou IL28B) têm sido associados às falhas na resposta imune inata e resposta virológica sustentada na hepatite C, e a mielopatia associada ao HTLV-1 (HTLV-1-associated myelopathy, HAM). A pesquisa destes polimorfismos pode empregar diversas metodologias: sequenciamento, reação em cadeia da polimerase em tempo real ou quantitativa (quantitative polymerase chain reaction, qPCR), análise de fragmentos de restrição enzimática em produtos de PCR (restriction fragment length polymorphism in PCR products, PCR-RFLP) e a tetra-primer PCR. Este estudo comparou o desempenho da tetra-primer PCR em relação a PCR-RFLP, ambas otimizadas no Laboratório de Pesquisa em HTLV do Centro de Imunologia do Instituto Adolfo Lutz de São Paulo. Foram selecionadas 100 amostras de DNA obtidas de pacientes do Centro de Referência e Treinamento em DST/Aids de São Paulo cujos SNPs na IL28B foram anteriormente determinados por PCR-RFLP e representaram todos os perfis descritos em literatura. Os resultados obtidos mostraram concordância entre elas, e pelo fato da tetra-primer PCR ter menor custo, ser de fácil execução, empregar menos tempo, insumos e material biológico, é a técnica de escolha para uso em rotina. (AU)

Canine ringworm caused by Trichophyton mentagrophytes - detection by SYBR-Green real-time PCR

Background: Dermatophytes, fungi of universal distribution, invade semi or fully keratinized structures, such as skin, fur/ hair and nails. The various species of dermatophytes are classified into three genera anamorphic: Microsporum, Trichophyton and Epidermophyton. The genus Epidermophyton includes only E. floccosum, that rarely affects animals. The main species responsible for the disease in dogs and cats are Microsporum canis, M. gypseum and Trichophyton mentagrophytes, which were characterized through conventional mycological methodology (microscopic examination with KOH and culture). Molecular methodologies, such as real-time PCR, can contribute to a rapid laboratory diagnosis, helping clinicians to initiate an early antifungal treatment. This case report describes a case of canine dermatophytosis due to Trichophyton mentagrophytes detected from a clinical sample by SYBR-Green real-time PCR. Case: A 8-year-old dog, rescued from the street, was referred to a private veterinary clinic in the city of Canoas, RS, Brazil, presenting generalized lymphadenomegaly, crusted lesions all over the body, generalized alopecia, signs of excoriation and epistaxis. Initially, were administered prednisone [1 mg/kg every 48 h, BID] and cephalexin [30 mg/kg, BID]. Weekly baths with benzoyl peroxide were also given. The therapy was not clinically successful. Wood's Lamp Test was negative. As a differential diagnosis, PCR for detection of Leishmania was negative. Complete blood count and serum biochemical assay were also performed. For mycological diagnosis, hair specimen was clarified and examined microscopically using 10% potassium hydroxide (KOH) for the visualization of chains of arthroconidia (ectothrix invasion of hair). The infected hair was plated onto MycoselTM Agar, incubated at 28°C for 15 days. Microscopy of hyphae/ conidia and macroscopic colony characteristics (colors and texture) were conducted for the differentiation of the species within the genus Microsporum and Trichophyton. In addition, real-time PCR was applied for direct analysis of the fungal DNA obtained from the hair sample. Microscopic examination was negative. The dermatophyte present in the hair sample was confirmed as Trichophyton mentagrophytes by culture and qPCR (melting-point analysis). The patient was treated with systemic itraconazole [10 mg/ kg SID - 90 days]. Twice-weekly application of 2.5 % miconazole and 2% chlorhexidine shampoo until complete cure. Discussion: Dermatophytosis is often listed as self-limiting infection; however, animal dermatophytosis can spread between pets, as well as a zoonotic transmission to humans. The literature on dermatophytosis indicates that Microsporum canis is the predominant etiological agent, followed by M. gypseum. Trichophyon mentagrophytes that appear in a lower percentage of isolation. The culture of hair, even with specific medium containing chloramphenicol and cyclohexamide, may present contaminating fungi, not related to dermatophytosis, which can inhibit or override the growth of dermatophytes. The use of real-time PCR provided a faster and specific diagnosis of dermatophytosis when compared to the conventional mycological methodology for detection and identification of T. mentagrophytes, which takes around 10 to 15 days for culture. It is possible to use this technique as an alternative diagnosis for dermatophytes associated to clinical hair samples of dogs.

Molecular prevalence of Mycoplasma parvum in production cycle of technified swine herds / Prevalência molecular do Mycoplasma parvum em granjas de suínos tecnificados de ciclo completo

Porcine hemoplasmosis is characterized as a geographically cosmopolitan disease caused by Mycoplasma suis and Mycoplasma parvum. Asymptomatic pigs are considered the focus of hemoplasmosis because they are carriers and reservoirs to new infections. This study aimed to determine the molecular occurrence of porcine hemoplasmas (PH) in the production cycle of technified farrow-to-finished swine herds. For this purpose, 20 swine herds were evaluated, where 501 whole blood samples were collected for qPCR and phylogenetic analyses for hemoplasmas. The epidemiological analysis was performed for the entire population and per the growth stage. The total prevalence for PH was 31.93% (161/501); 95% (19/20) of sampled herds were positive. The occurrence of PH by swine growth stages was nursery (30.47%), growing (31.29%), finishing (26.18%), and slaughter (40.25%). The quantification cycles (Cq) ranged from 3.18-39.56 and the number of PH 16S rRNA copies per µL of DNA ranged from 5,57 x10 to 2.23 x1010 . Sequencing and phylogenetic analysis of five selected samples showed 100% identity with M. parvum strain Indiana and two M. parvum sequences from Brazil/Goiás. This is the first report on PH in technified herds in Southeastern Brazil by growth stages.

A hemoplasmose suína é uma doença geograficamente cosmopolita, causada por Mycoplasma suis e Mycoplasma parvum. Suínos assintomáticos são considerados foco de hemoplasmose por serem portadores e reservatórios de novas infecções. Este estudo teve como objetivo determinar a ocorrência molecular de hemoplasmas suínos (HP) no ciclo de produção de rebanhos suínos tecnificados. Foram avaliados 20 rebanhos suínos e coletadas 501 amostras de sangue total para qPCR e análises filogenéticas para hemoplasmas. A análise epidemiológica foi realizada pela população e por estágio de crescimento. A prevalência total de HP foi de 31,93% (161/501); 95% (19/20) dos rebanhos amostrados foram positivos. A ocorrência de HP por fases de crescimento dos suínos foi: creche (30,47%), em crescimento (31,29%), acabamento (26,18%) e abate (40,25%). Os ciclos de quantificação (Cq) variaram de 3,18-39,56 e o número de cópias de rRNA PH 16S por µL de DNA variou de 5,57 x102 a 2,23 x10¹0. O sequenciamento e a análise filogenética de cinco amostras selecionadas mostraram 100% de identidade com a cepa indiana de M. parvum e duas sequências de M. parvum do Brasil / Goiás. Este é o primeiro relato de HP em rebanhos tecnificados, na região Sudeste do Brasil, por estágios de crescimento.

Dogs naturally infected by Rangelia vitalii, Babesia canis vogeli, and Ehrlichia canis in São Paulo, Brazil / Cães naturalmente infectados por Rangelia vitalii, Babesia canis vogeli, e Ehrlichia canis em São Paulo, Brasil

Several agents can cause hemoparasitic diseases in dogs, and blood-sucking arthropods transmit these diseases. These agents can cause several clinical manifestations and, in some cases, can kill the host. Because these agents are essential in animal health, this study aims to detect the frequency of Ehrlichia canis, Rickettsia rickettsii, Anaplasma platys, and Rangelia vitalii by real-time PCR and Babesia vogeli in dogs in the southern region of the city of São Paulo, São Paulo. Of the 98 dog samples, 18 (18.4%) tested positive with real-time polymerase chain reaction for at least one studied agent. Of these 18 samples, 17 tested positive for a single agent (11.2% for B. canis vogeli, 1.02% for R. vitalii, and 5.1% for E. canis), and one showed co-infection with B. canis vogeli and R. vitalii. The results demonstrate the presence of hemoparasites in the studied animals, which can influence the quality and life expectancy of these animals. The Rangeliadetection warns small animal clinicians to include it as a differential diagnosis for hemoparasitosis.(AU)

As hemoparasitoses em cães podem ser causadas por diversos agentes, sendo essas doenças transmitidas por artrópodes hematófagos. Esses agentes podem causar diversas manifestações clínicas e, em alguns casos, podem matar o hospedeiro. Este estudo teve como objetivo detectar por PCR em tempo real a frequência de Ehrlichia canis, Rickettsia rickettsii, Anaplasma platys, Rangelia vitalii e Babesia canis vogeli em amostras de cães da zona sul da cidade de São Paulo, Brasil. Das 98 amostras de cães, 18 (18,4%) testaram positivo com reação em cadeia da polimerase em tempo real para pelo menos um agente estudado. Destas 18 amostras, 17 testaram positivo para um único agente (11,2% para B. canis vogeli, 1,02% para R. vitalii e 5,1% para E. canis), e uma apresentou coinfecção com B. canis vogeli e R. vitalii. Os resultados demonstram a presença de hemoparasitas nos animais estudados, o que pode influenciar a qualidade e a expectativa de vida desses animais. Além disso, é o primeiro relato da detecção de R. vitalli na zona sul de São Paulo e serve de alerta para os clínicos de pequenos animais incluírem esse agente como diagnóstico diferencial para as hemoparasitoses.(AU)

Distinct carbapenems susceptibility profiles in isogenic isolates of Klebsiella pneumoniae presenting Ompk36 disruption and expression of down-regulated blaKPC-2 / Perfis distintos de suscetibilidade a carbapenêmicos em isolados isogênicos de Klebsiella pneumoniae apresentando interrupção de Ompk36 e expressão de blaKPC-2 negativamente regulada

The isolation of multidrug-resistant Klebsiella pneumoniae in hospitals is a major public health threat, increasing patient hospitalization costs, morbidity and mortality. Therefore, this work investigated the resistance mechanisms that produced different carbapenems susceptibility profiles in two isogenic strains of K. pneumoniae isolated from the same patient in a public hospital in Recife, Pernambuco. The genes that encode the main porins in K. pneumoniae, ompK35 and ompK36, and several beta-lactamase genes were analyzed. The expression of these genes was evaluated by quantitative real time PCR (polymerase chain reaction) with reverse transcriptase (RT-qPCR). SDS-PAGE (sodium dodecyl sulphate­polyacrylamide gel electrophoresis) was performed to analyze the outer membrane proteins. The analysis of the ompK36 genetic environment disclosed an IS903 insertion sequence disrupting this gene in the ertapenem resistant isolate (KPN133). The blaKPC-2 gene showed down-regulated expression in both isolates. Our findings show that changes in porins, especially OmpK36, are more determinant to carbapenems susceptibility profile of bacterial isolates than variations in blaKPC gene expression.

O isolamento de Klebsiella pneumoniae multirresistente em hospitais é uma grande ameaça à saúde pública, aumentando os custos de internação, morbidade e mortalidade dos pacientes. Portanto, este trabalho investigou os mecanismos de resistência que produziram diferentes perfis de suscetibilidade aos carbapenêmicos em duas cepas isogênicas de K. pneumoniae isoladas do mesmo paciente em um hospital público em Recife, Pernambuco. Foram analisados ​​os genes que codificam as principais porinas em K. pneumoniae, ompK35 e ompK36, e diversos genes de beta-lactamases. A expressão desses genes foi avaliada por PCR (reação em cadeia da polimerase quantitativa em tempo real) com transcriptase reversa (RT-qPCR). SDS-PAGE (dodecil sulfato de sódio-poliacrilamida gel eletroforese) foi realizada para analisar as proteínas da membrana externa. A análise do ambiente genético ompK36 revelou uma sequência de inserção IS903 interrompendo este gene no isolado resistente ao ertapenem (KPN133). O gene blaKPC-2 apresentou expressão negativamente regulada em ambos os isolados. Nossos achados mostram que alterações nas porinas, especialmente OmpK36, são mais determinantes no perfil de suscetibilidade aos carbapenêmicos de isolados bacterianos do que variações na expressão do gene blaKPC.

Gender-based incidence, recovery period, and mortality rate of COVID-19 among the population of district Attock, Pakistan / Incidência baseada em gênero, período de recuperação e taxa de mortalidade de COVID-19 entre a população do distrito de Attock, Paquistão

Abstract COVID-19 is reported as an extremely contagious disease with common symptoms of fever, dry cough, sore throat, and tiredness. The published literature on incidence and gender-wise prevalence of COVID-19 is scarce in Pakistan. Therefore, the present study was designed to compare the distribution, incubation period and mortality rate of COVID-19 among the male and female population of district Attock. The data were collected between 01 April 2020 and 07 December 2020 from the population of district Attock, Pakistan. A total of 22,962 individuals were screened and 843 were found positive for RT-qPCR for SARS-CoV-2. The confirmed positive cases were monitored carefully. Among the positive cases, the incidence of COVID-19 was 61.7% among males and 38.2% among females. The average recovery period of males was 18.89±7.75 days and females were 19±8.40 days from SARS-CoV-2. The overall mortality rate was 8.06%. The death rate of male patients was significantly higher (P<0.05) compared to female patients. Also, the mortality rate was higher (P<0.05) in male patients of 40-60 years of age compared to female patients of the same age group. Moreover, the mortality rate significantly increased (P<0.05) with the increase of age irrespective of gender. In conclusion, the incidence and mortality rate of COVID-19 is higher in males compared to the female population. Moreover, irrespective of gender the mortality rate was significantly lower among patients aged <40 years.

Resumo Covid-19 é relatada como uma doença extremamente contagiosa com sintomas comuns de febre, tosse seca, dor de garganta e cansaço. A literatura publicada sobre incidência e prevalência de Covid-19 com base no gênero é escassa no Paquistão. Portanto, o presente estudo teve como objetivo comparar a distribuição, o período de incubação e a taxa de mortalidade de Covid-19 entre a população masculina e feminina do distrito de Attock. Os dados foram coletados entre 1 de abril de 2020 e 7 de dezembro de 2020 da população do distrito de Attock, Paquistão. Um total de 22.962 indivíduos foi selecionado, e 843 foram considerados positivos para RT-qPCR para SARS-CoV-2. Os casos positivos confirmados foram monitorados cuidadosamente. Entre os casos positivos, a incidência de Covid-19 foi de 61,7% no sexo masculino e 38,2% no feminino. O período médio de recuperação dos homens foi de 18,89 ± 7,75 dias e das mulheres 19 ± 8,40 dias do SARS-CoV-2. A mortalidade geral foi de 8,06%. A taxa de mortalidade de pacientes do sexo masculino foi significativamente maior (P < 0,05) em comparação com pacientes do sexo feminino. Além disso, a taxa de mortalidade foi maior (P < 0,05) em pacientes do sexo masculino com 40-60 anos de idade em comparação com pacientes do sexo feminino da mesma faixa etária. Além disso, a taxa de mortalidade aumentou significativamente (P < 0,05) com o aumento da idade, independentemente do sexo. Em conclusão, a incidência e a taxa de mortalidade de Covid-19 são maiores no sexo masculino em comparação com a população feminina. E também, independentemente do sexo, a taxa de mortalidade foi significativamente menor entre os pacientes com idade < 40 anos.

Reference gene stability in the Longissimus thoracis et lumborum muscle of Colombian Creole sheep / Estabilidade de genes de referência no músculo Longissimus thoracis et lumborum de ovelhas crioulas colombianas

The Colombian Creole sheep breed has a high economic and social importance for Colombia. Both males and females of this breed are multipurpose animals, and evaluating the production and meat quality of both sexes is important for small farmers in Colombia. This requires the use of tools that help to evaluate critical production points, such as Real-time quantitative polymerase chain reaction (RT-qPCR), which is a widely used molecular tool for the relative quantification of candidate genes in various tissues. For its correct use, the use of housekeeping genes with stable expression, so-called "reference genes", is required. However, recent studies have shown that the expression of these reference genes can vary among tissues and can be modulated by breed, sex, or external stimuli. Likewise, there is little information regarding the expression of these genes in the Longissimus thoracis et lumborum muscle of male and female Colombian Creole sheep. In this study, the stability in the expression of seven reference genes (ACTB, YWHAZ, SDHA, GAPDH, TUBB2A, B2M, and PGK1) in the Longissimus thoracis et lumborum muscle of male and female Colombian Creole sheep was compared since they are used in RT-qPCR studies to determine the most stable ones for this breed. Twelve animals, six males and six females, with a body weight of 26 ± 4 kg and 12 ± 3 months of age, were used under grazing conditions. Biopsies of the Longissimus thoracis et lumborum muscle were taken, from which RNA was extracted and cDNA was synthesized. Expression was determined using RT-qPCR, and its stability was analyzed by computational algorithms using the geNorm, Normfinder, and BestKeeper software packages, which were integrated using the RefFinder software package. The results indicate that GAPDH, ACTB, and SDHA have the highest stability, whereas the most variable expression was found for B2M. These data provide the basis for more precise results in RT-qPCR studies of gene expression in the muscle of Colombian Creole sheep.(AU)

A raça de ovinos Crioula Colombiana tem grande importância econômica e social para a Colômbia. Avaliar a produção e a qualidade da carne de machos e fêmeas é importante para pequenos produtores do país e, assim, faz necessário o uso ferramentas que ajudam a avaliar os pontos críticos de produção, como a reação em cadeia da polimerase em tempo real (Real-time quantitative polymerase chain reaction [RT-qPCR]). Esta é uma ferramenta molecular amplamente usada para a quantificação relativa de genes candidatos em vários tecidos. Para o seu uso correto, é necessário o uso de genes com expressão estável denominados genes de referência. No entanto, estudos recentes têm mostrado que a expressão desses genes de referência pode variar entre os tecidos e pode ser modulada por raça, sexo ou estímulos externos. Da mesma forma, existem poucas informações sobre a expressão desses genes no músculo Longissimus thoracis et lumborum de ovinos machos e fêmeas da raça Crioula Colombiana. Neste estudo foi comparada a estabilidade na expressão de sete genes de referência (ACTB, YWHAZ, SDHA, GAPDH, TUBB2A, B2M e PGK1) no músculo Longissimus thoracis et lumborum de ovinos Crioulo Colombiano machos e fêmeas, por serem genes utilizados em estudos de RT-qPCR visando determinar os mais estáveis para esta raça. Doze animais com peso corporal de 26 ± 4 kg e 12 ± 3 meses de idade foram utilizados em condições de pastejo. Foram realizadas biópsias do músculo Longissimus thoracis et lumborum, de onde o RNA foi extraído e o cDNA foi sintetizado. A expressão foi determinada usando RT-qPCR e sua estabilidade foi analisada por algoritmos computacionais usando geNorm, Normfinder e BestKeeper pacote de software, os quais foram integrados usando RefFinder pacote de software. Os resultados indicam que GAPDH, ACTB e SDHA apresentam maior estabilidade, enquanto a expressão mais variável foi para B2M. Esses dados fornecem a base para resultados mais precisos em estudos de RT-qPCR de expressão gênica em músculos defeminino ovinos da raça Crioula Colombiana.(AU)

The Rv2807 target gene: a determining factor to directly detect Mycobacterium bovis from suspected bovine tuberculosis lesions / Gene alvo Rv2807: um fator determinante para detectar Mycobacterium bovis diretamente de lesões suspeitas de tuberculose bovina

Bovine tuberculosis (bTB) is a zoonosis caused by Mycobacterium bovis, a species belonging to the Mycobacterium tuberculosis complex (MTC) group. Direct bTB diagnosis from suggestive lesions can be performed by nested q-PCR targeting the Rv2807 gene present in the MTC group, as well as the TbD1 gene, present in M. bovis. In this context, the aim of the present study was to assess the importance of considering positive MTC results for the Rv2807 target gene obtained through the nested real time polymerase chain reaction (nested q-PCR) applied to samples obtained directly from suspected bTB lesions. A total of 174 samples of suggestive bTB caseous lesions were obtained during cattle slaughter in slaughterhouses in the state of Mato Grosso, Brazil. DNA was extracted from the lesions and nested q-PCR was performed to detect both MTC and M. bovis. Both samples positive for the Rv2807 (41/174) and TbD1 (29/174) were submitted to bacterial culturing (23/41), and the DNA of the isolates (23) was extracted and submitted again to nested q-PCR. The Rv2807 gene (MTC) was previously amplified by nested q-PCR directly from the lesions, although the TbD1 gene specific for M. bovis was not amplified previously in four of the successfully isolated samples (4/23), only following isolation, and only the Rv2807 gene was amplified before and after isolation. In conclusion, the target gene Rv2807(MTC) exhibited higher positivity in the analyzed samples compared to the TbD1 gene (M. bovis).

A tuberculose bovina (bTB) é uma zoonose causada pelo Mycobacterium bovis, uma espécie pertencente ao grupo do complexo Mycobacterium tuberculosis (MTC). O diagnóstico direto de bTB a partir de lesões sugestivas pode ser realizado por nested q-PCR visando o gene Rv2807 presente no grupo MTC, bem como o gene TbD1, presente em M. bovis. Nesse contexto, o objetivo do presente estudo foi avaliar a importância de considerar os resultados de MTC positivos para o gene alvo Rv2807 obtidos através da reação em cadeia da polimerase nested real time (nested q-PCR) aplicada a amostras obtidas diretamente de lesões suspeitas de bTB. Um total de 174 amostras de lesões caseosas sugestivas de bTB foram obtidas durante o abate de bovinos em frigoríficos do estado de Mato Grosso, Brasil. DNA foi extraído das lesões e nested q-PCR foi realizado para detectar tanto MTC quanto M. bovis. Ambas as amostras positivas para Rv2807 (41/174) e TbD1 (29/174) foram submetidas a cultura bacteriana (23/41), e o DNA dos isolados (23) foi extraído e submetido novamente à nested q-PCR. O gene Rv2807 (MTC) foi previamente amplificado por nested q-PCR diretamente das lesões, embora o gene TbD1 específico para M. bovis não tenha sido amplificado anteriormente em quatro das amostras isoladas com sucesso (4/23), apenas após o isolamento, e apenas o gene Rv2807 foi amplificado antes e após o isolamento. Em conclusão, o gene alvo Rv2807 (MTC) apresentou maior positividade nas amostras analisadas em relação ao gene TbD1 (M. bovis).

New sensitive real-time PCR targeting p28 gene for detection of Ehrlichia canis in blood samples from dogs / Novo PCR em tempo real sensível que visa o gene p28 para a detecção de Ehrlichia canis em amostras de sangue de cães

ABSTRACT: This study aims to describe a new detection method of a quantitative real-time polymerase chain reaction (qPCR) targeting the 28 kDa outer membrane protein gene (p28) as well as to compare this method with a conventional PCR (cPCR), which targets the same gene, in order to evaluate the performance of the technique designed in this study in detecting Ehrlichia canis (E. canis). Optimum oligonucleotides concentrations were reached, and the analytical sensitivity and specificity of the qPCR were performed. A total of 218 dogs' whole blood samples were conventionally collected for this study. The DNA was extracted from each sample. Subsequently, the samples were tested by an established cPCR and the new qPCR to compare each technique's performances. This new qPCR method for the molecular detection of E. canis presented a detection limit of ten copies of the fragment and was considered specific for E. canis according to analytical specificity analyses performed in vitro and in silico. The standard curve revealed 100% efficiency and a coefficient of determination (R2) equivalent to 99.8%. Among the samples examined by qPCR, 24.31% were considered positive, significantly greater than those detected by cPCR (15.13%). The qPCR technique reached a higher sensitivity than the cPCR when targeting the p28 gene in detecting E. canis. The qPCR standardized in this study is an efficient method for confirming canine monocytic ehrlichiosis (CME) diagnosis and might provide the parasitemia monitoring during the disease treatment.

RESUMO: Este estudo tem como objetivo descrever um novo método de detecção de uma reação em cadeia da polimerase quantitativa em tempo real (qPCR) visando o gene da proteína da membrana externa de 28 kDa (p28), bem como comparar este método com um PCR convencional (cPCR), que visa o mesmo gene, a fim de avaliar o desempenho da técnica desenhada neste estudo na detecção de Ehrlichia canis (E. canis). As concentrações ideais de oligonucleotídeos foram alcançadas e a sensibilidade analítica e a especificidade do qPCR foram determinadas. Um total de 218 amostras de sangue total de cães foram coletadas convencionalmente para este estudo. O DNA foi extraído de cada amostra. Posteriormente, as amostras foram testadas por um cPCR estabelecido e o novo qPCR para comparar os desempenhos entre cada técnica. A curva padrão revelou 100% de eficiência e coeficiente de determinação (R2) equivalente a 99,8%. Dentre as amostras examinadas por qPCR, 24,31% foram consideradas positivas, percentual significativamente maior do que as detectadas por cPCR (15,13%). A técnica qPCR atingiu uma sensibilidade maior do que a cPCR na detecção de E. canis. A qPCR padronizada neste estudo é um método eficiente para a confirmação do diagnóstico de erliquiose monocítica canina (EMC) e pode fornecer o monitoramento de níveis de parasitemia ao longo do tratamento da doença.

New sensitive real-time PCR targeting p28 gene for detection of Ehrlichia canis in blood samples from dogs / Novo PCR em tempo real sensível que visa o gene p28 para a detecção de Ehrlichia canis em amostras de sangue de cães

This study aims to describe a new detection method of a quantitative real-time polymerase chain reaction (qPCR) targeting the 28 kDa outer membrane protein gene (p28) as well as to compare this method with a conventional PCR (cPCR), which targets the same gene, in order to evaluate the performance of the technique designed in this study in detecting Ehrlichia canis (E. canis). Optimum oligonucleotides concentrations were reached, and the analytical sensitivity and specificity of the qPCR were performed. A total of 218 dogs’ whole blood samples were conventionally collected for this study. The DNA was extracted from each sample. Subsequently, the samples were tested by an established cPCR and the new qPCR to compare each technique’s performances. This new qPCR method for the molecular detection of E. canis presented a detection limit of ten copies of the fragment and was considered specific for E. canis according to analytical specificity analyses performed in vitro and in silico. The standard curve revealed 100% efficiency and a coefficient of determination (R²) equivalent to 99.8%. Among the samples examined by qPCR, 24.31% were considered positive, significantly greater than those detected by cPCR (15.13%). The qPCR technique reached a higher sensitivity than the cPCR when targeting the p28 gene in detecting E. canis. The qPCR standardized in this study is an efficient method for confirming canine monocytic ehrlichiosis (CME) diagnosis and might provide the parasitemia monitoring during the disease treatment.

Este estudo tem como objetivo descrever um novo método de detecção de uma reação em cadeia da polimerase quantitativa em tempo real (qPCR) visando o gene da proteína da membrana externa de 28 kDa (p28), bem como comparar este método com um PCR convencional (cPCR), que visa o mesmo gene, a fim de avaliar o desempenho da técnica desenhada neste estudo na detecção de Ehrlichia canis (E. canis). As concentrações ideais de oligonucleotídeos foram alcançadas e a sensibilidade analítica e a especificidade do qPCR foram determinadas. Um total de 218 amostras de sangue total de cães foram coletadas convencionalmente para este estudo. O DNA foi extraído de cada amostra. Posteriormente, as amostras foram testadas por um cPCR estabelecido e o novo qPCR para comparar os desempenhos entre cada técnica. A curva padrão revelou 100% de eficiência e coeficiente de determinação (R²) equivalente a 99,8%. Dentre as amostras examinadas por qPCR, 24,31% foram consideradas positivas, percentual significativamente maior do que as detectadas por cPCR (15,13%). A técnica qPCR atingiu uma sensibilidade maior do que a cPCR na detecção de E. canis. A qPCR padronizada neste estudo é um método eficiente para a confirmação do diagnóstico de erliquiose monocítica canina (EMC) e pode fornecer o monitoramento de níveis de parasitemia ao longo do tratamento da doença.

New sensitive real-time PCR targeting p28 gene for detection of Ehrlichia canis in blood samples from dogs / Novo PCR em tempo real sensível que visa o gene p28 para a detecção de Ehrlichia canis em amostras de sangue de cães

This study aims to describe a new detection method of a quantitative real-time polymerase chain reaction (qPCR) targeting the 28 kDa outer membrane protein gene (p28) as well as to compare this method with a conventional PCR (cPCR), which targets the same gene, in order to evaluate the performance of the technique designed in this study in detecting Ehrlichia canis (E. canis). Optimum oligonucleotides concentrations were reached, and the analytical sensitivity and specificity of the qPCR were performed. A total of 218 dogs whole blood samples were conventionally collected for this study. The DNA was extracted from each sample. Subsequently, the samples were tested by an established cPCR and the new qPCR to compare each techniques performances. This new qPCR method for the molecular detection of E. canis presented a detection limit of ten copies of the fragment and was considered specific for E. canis according to analytical specificity analyses performed in vitro and in silico. The standard curve revealed 100% efficiency and a coefficient of determination (R²) equivalent to 99.8%. Among the samples examined by qPCR, 24.31% were considered positive, significantly greater than those detected by cPCR (15.13%). The qPCR technique reached a higher sensitivity than the cPCR when targeting the p28 gene in detecting E. canis. The qPCR standardized in this study is an efficient method for confirming canine monocytic ehrlichiosis (CME) diagnosis and might provide the parasitemia monitoring during the disease treatment.(AU)

Este estudo tem como objetivo descrever um novo método de detecção de uma reação em cadeia da polimerase quantitativa em tempo real (qPCR) visando o gene da proteína da membrana externa de 28 kDa (p28), bem como comparar este método com um PCR convencional (cPCR), que visa o mesmo gene, a fim de avaliar o desempenho da técnica desenhada neste estudo na detecção de Ehrlichia canis (E. canis). As concentrações ideais de oligonucleotídeos foram alcançadas e a sensibilidade analítica e a especificidade do qPCR foram determinadas. Um total de 218 amostras de sangue total de cães foram coletadas convencionalmente para este estudo. O DNA foi extraído de cada amostra. Posteriormente, as amostras foram testadas por um cPCR estabelecido e o novo qPCR para comparar os desempenhos entre cada técnica. A curva padrão revelou 100% de eficiência e coeficiente de determinação (R²) equivalente a 99,8%. Dentre as amostras examinadas por qPCR, 24,31% foram consideradas positivas, percentual significativamente maior do que as detectadas por cPCR (15,13%). A técnica qPCR atingiu uma sensibilidade maior do que a cPCR na detecção de E. canis. A qPCR padronizada neste estudo é um método eficiente para a confirmação do diagnóstico de erliquiose monocítica canina (EMC) e pode fornecer o monitoramento de níveis de parasitemia ao longo do tratamento da doença.(AU)

Expression of icaA and icaD genes in biofilm formation in Staphylococcus aureus isolates from bovine subclinical mastitis / Expressão dos genes icaA e icaD na formação de biofilme em isolados de Staphylococcus aureus de mastite subclínica bovina

Staphylococcus spp. plays a significant role in the etiology of bovine mastitis. Staphylococcus aureus is considered the most important species due to the high prevalence and the difficulty of in vivo treatment that is related to the expression of virulence factors and biofilm formation. This study aimed to detect the phenotypic expression of the biofilm formation in 20 S. aureus isolated from bovine mastitis and to evaluate the expression and regulation of genes involved in its production. MALDI-TOF and phenogenotypic identification assays were performed to characterize the isolates. The phenotypic biofilm production and the presence of icaA and icaD and bap genes were evaluated. The Agr system was typified (agr I, agr II, agr III and agr IV) and its regulator (agr RNAIII) was detected. Furtherly, Real-time PCR (qPCR) was performed at chosen times to quantify the expression of icaA, icaD and hld genes in three selected isolates. All 20 strains were biofilm producers and most presented icaA and icaD genes. Only one isolate presented the bap gene. The agr gene type II showed a prevalence of 70%. Transcriptional analysis revealed increased expression of ica genes at eight hours of growth. These results confirm that polysaccharides production mediated by the icaADBC operon genes is an essential mechanism to the biofilm formation and contributes to the early stages of bacterial growth.(AU)

Staphylococcus spp. desempenham um papel significativo na etiologia da mastite bovina. Staphylococcus aureus é considerada a espécie mais importante devido a alta prevalência e a dificuldade de tratamento in vivo que está relacionado à expressão dos fatores de virulência e formação de biofilme. Este estudo teve como objetivo detectar a expressão fenotípica da formação de biofilme em 20 cepas de S. aureus isoladas de mastite bovina e avaliar a expressão e regulação de genes envolvidos em sua produção. MALDI-TOF e ensaios de identificação fenogenotípica foram realizados para caracterizar os isolados. A produção fenotípica de biofilme e a presença dos genes icaA, icaD e bap foram avaliadas. O sistema Agr foi tipificado (agr I, agr II, agr III e agr IV) e seu regulador (agr RNAIII) foi detectado. Além disso, a PCR em tempo real (qPCR) foi realizada nos tempos determinados para quantificar a expressão dos genes icaA, icaD e hld em três isolados selecionados. Todas as 20 linhagens foram produtoras de biofilme e a maioria apresentava os genes icaA e icaD. Apenas um isolado apresentou o gene bap. O gene agr do tipo II mostrou uma prevalência de 70%. A análise transcricional revelou aumento da expressão de genes ica às oito horas de crescimento. Estes resultados confirmam que a produção de polissacarídeos mediada pelos genes do operon icaADBC é um mecanismo essencial para a formação do biofilme e contribui para os estágios iniciais do crescimento bacteriano.(AU)

Expression of icaA and icaD genes in biofilm formation in Staphylococcus aureus isolates from bovine subclinical mastitis / Expressão dos genes icaA e icaD na formação de biofilme em isolados de Staphylococcus aureus de mastite subclínica bovina

Staphylococcus spp. plays a significant role in the etiology of bovine mastitis. Staphylococcus aureus is considered the most important species due to the high prevalence and the difficulty of in vivo treatment that is related to the expression of virulence factors and biofilm formation. This study aimed to detect the phenotypic expression of the biofilm formation in 20 S. aureus isolated from bovine mastitis and to evaluate the expression and regulation of genes involved in its production. MALDI-TOF and phenogenotypic identification assays were performed to characterize the isolates. The phenotypic biofilm production and the presence of icaA and icaD and bap genes were evaluated. The Agr system was typified (agr I, agr II, agr III and agr IV) and its regulator (agr RNAIII) was detected. Furtherly, Real-time PCR (qPCR) was performed at chosen times to quantify the expression of icaA, icaD and hld genes in three selected isolates. All 20 strains were biofilm producers and most presented icaA and icaD genes. Only one isolate presented the bap gene. The agr gene type II showed a prevalence of 70%. Transcriptional analysis revealed increased expression of ica genes at eight hours of growth. These results confirm that polysaccharides production mediated by the icaADBC operon genes is an essential mechanism to the biofilm formation and contributes to the early stages of bacterial growth.(AU)

Staphylococcus spp. desempenham um papel significativo na etiologia da mastite bovina. Staphylococcus aureus é considerada a espécie mais importante devido a alta prevalência e a dificuldade de tratamento in vivo que está relacionado à expressão dos fatores de virulência e formação de biofilme. Este estudo teve como objetivo detectar a expressão fenotípica da formação de biofilme em 20 cepas de S. aureus isoladas de mastite bovina e avaliar a expressão e regulação de genes envolvidos em sua produção. MALDI-TOF e ensaios de identificação fenogenotípica foram realizados para caracterizar os isolados. A produção fenotípica de biofilme e a presença dos genes icaA, icaD e bap foram avaliadas. O sistema Agr foi tipificado (agr I, agr II, agr III e agr IV) e seu regulador (agr RNAIII) foi detectado. Além disso, a PCR em tempo real (qPCR) foi realizada nos tempos determinados para quantificar a expressão dos genes icaA, icaD e hld em três isolados selecionados. Todas as 20 linhagens foram produtoras de biofilme e a maioria apresentava os genes icaA e icaD. Apenas um isolado apresentou o gene bap. O gene agr do tipo II mostrou uma prevalência de 70%. A análise transcricional revelou aumento da expressão de genes ica às oito horas de crescimento. Estes resultados confirmam que a produção de polissacarídeos mediada pelos genes do operon icaADBC é um mecanismo essencial para a formação do biofilme e contribui para os estágios iniciais do crescimento bacteriano.(AU)

Toxoplasmose encefálica em um gambá-de-orelha-branca (Didelphis albiventris) / Encephalic toxoplasm in a white-eared possum (Didelphis albiventris)

Background: Toxoplasmosis is caused by Toxoplasma gondii, an obligate intracellular protozoan that belongs to the Apicomplexa phylum, coccidian subclass, and affects all warm-blooded animals. The role of opossums in the epidemiology of toxoplasmosis in Brazil is not fully understood, and there are very few descriptions of toxoplasmosis lesions in these animals. This report describes the anatomopathological, molecular and immunohistochemical findings of a case of encephalic toxoplasmosis in free-living white-eared possum (Didelphis albiventris). Case: A young male opossum (D. albiventris), was treated at the Veterinary Hospital of Wild Animals of the University of Brasília, Federal District. The animal was apathetic, uncoordinated, reluctant to move, and had an exposed proximal fracture in the left radius and ulna with laceration of muscles and adjacent tendinous structures. Amputation on the left thoracic limb was performed followed by analgesia and antibiotic therapy. The environment is frequented by other wild animals, and stray cats have access to the patio of the building. Twenty-five days after arriving at the hospital, the animal was found dead in its cage. After death, a necropsy was performed. Organ fragments from the abdominal cavity, thoracic and central nervous system were collected, processed routinely for histology and stained with hematoxylin and eosin. Macroscopic lesions in the central nervous system were not observed. On microscopy, the brain showed moderate random glial nodules throughout the neuropil associated with the presence of spherical to elongated parasitic cysts of about 20 µm, with a thin wall and with its interior full of bradyzoites, consistent with Toxoplasma gondii. There was also moderate fibrinoid necrosis and moderate multifocal lymphoplasmacytic infiltrate surrounding the blood vessels (perivascular cuffs) To investigate the etiology of the brain injury, brain sections were subjected to immunohistochemistry (IHC) and real-time polymerase chain reaction (qPCR) technique for detection of T. gondii and Neospora caninum. Immunostaining for T. gondii in the cyst wall and in bradyzoites and negative immunostaining for N. caninum. qPCR was positive for T. gondii and negative for N. caninum. Discussion: Diagnosis of encephalic toxoplasmosis in a Didelphis albiventris was possible based on histopathological, immunohistochemical and molecular findings. The morphological classification of the brain lesion was important for the diagnosis. Brain toxoplasmosis in opossums usually results in focal areas of malacia on macroscopy and focally extensive necrosis on microscopy, neutrophil infiltrate, calcified necrotic material, and perivascular cuffs of lymphocytes and plasma cells. In the present case, similar histopathological lesions were noted, but no significant macroscopic changes were observed. The etiology here was defined by immunohistochemistry and qPCR, techniques proven to be useful and with good specificity for diagnosing toxoplasmosis in mammals. It is believed that the positive immunohistochemical and molecular result for Toxoplasma gondii together with the negative result for Neospora caninum were conclusive for the diagnosis. Thus, we demonstrate here a post mortem diagnosis of toxoplasmosis in a free-living synanthropic opossum and the use of anatomopathology, immunohistochemistry and real-time polymerase chain reaction as a diagnostic option for this disease in opossums.

Evaluation of quantitative polymerase chain reaction for the detection of Toxoplasma gondii oocysts shed by cats / Avaliação da reação em cadeia da polimerase quantitativa para a detecção de oocistos de Toxoplasma gondii eliminados por gatos

Abstract Felines are definitive hosts of Toxoplasma gondii and can shed oocysts in their feces, contaminating the environment. Sporulated oocysts are highly resistant to the environment and have higher infectivity, which are attributed to many toxoplasmosis outbreaks. The aim of the present study was to evaluate a quantitative polymerase chain reaction (qPCR) technique for the detection of T. gondii oocysts shed by cats. Twelve cats from a previous vaccine experiment were challenged orally with 600 cysts of the TgDoveBr8 strain on day 72. Fecal samples were collected daily using the centrifugal flotation technique, with microscopic examination (Sheather technique) and qPCR for 20 days after the challenge. Cats from all groups shed oocysts in their feces. Five negative cats in the Sheather were positive according to qPCR on the 3rd day post-inoculation (dpi). Oocysts were detected on the 4th dpi using the Sheather; however, there was no statistical difference between the two methods (p=0.1116). In addition, there was no statistically significant difference in oocyst shedding between the groups according to the Sheather technique (p=0.6534) and qPCR (p=0.9670). In conclusion, these results demonstrate that qPCR can be used as an alternative to the Sheather to detect and quantify T. gondii oocysts.

Resumo Felinos são hospedeiros definitivos do Toxoplasma gondii e podem eliminar oocistos nas fezes, contaminando o meio ambiente. Oocistos esporulados são altamente resistentes ao meio ambiente com elevada infectividade, sendo atribuído a muitos surtos de toxoplasmose. O objetivo do estudo foi avaliar a reação em cadeia da polimerase quantitativa (qPCR) para a detecção de oocistos de T. gondii eliminados por gatos. Doze gatos de um experimento prévio de vacina foram desafiados por via oral com 600 cistos da cepa TgDoveBr8 no dia 72. Amostras fecais foram coletadas diariamente pela técnica de centrifugo-flutuação seguida de exame microscópico (técnica de Sheather) e qPCR por 20 dias após desafio. Gatos de todos os grupos eliminam oocistos nas fezes. Cinco gatos negativos na técnica Sheather foram positivos de acordo com a qPCR no 3º dia pós-inoculação (dpi). Oocistos foram detectados no 4º dpi no Sheather; entretanto, não houve diferença estatística entre os dois métodos (p=0,1116). Não houve diferença estatisticamente significativa na eliminação de oocistos entre os grupos de acordo com a técnica de Sheather (p = 0,6534) e qPCR (p = 0,9670). Em conclusão, esses resultados demonstram que qPCR pode ser usada como uma alternativa ao Sheather para detectar e quantificar oocistos de T. gondii.

Occurrence of Lawsonia intracellularis in horses raised in three regions of the state of Paraná, Brazil / Ocorrência de Lawsonia intracellularis em equinos criados em três regiões do estado do Paraná, Brasil

Lawsonia intracellularis is a bacterium already described in several species and most prevalent in pigs, in which it causes enteric problems. Horses can also be affected, developing a disease known as equine proliferative enteropathy, which results from the proliferation of intestinal crypt cells in response to infection by the bacterium. Despite the existence of reports of the disease in several countries, including Brazil, there are still no reports of the disease or epidemiological studies of its occurrence in symptomatic or asymptomatic horses in the state of Paraná. Thus, the present study was conducted to examine the occurrence of L. intracellularis in asymptomatic horses raised in the west, northwest and north regions of Paraná by means of serological testing and the real-time polymerase chain reaction (qPCR) technique. In the serological approach, the immunoperoxidase monolayer assay (IPMA) technique was employed. Feces were processed and subjected to qPCR. In total, samples were collected from 162 animals from 20 farms. Of these, 9/162 (5.55%) showed specific antibodies against L. intracellularis. Real-time PCR, on the other hand, identified 7/162 (4.32%) fecal samples positive for the presence of the bacterium. When the techniques were compared, none of the samples was positive by both, demonstrating that, for a better diagnosis, they must be performed together. In contrast to most reports in horses, the present studyde scribes higher serological and molecular occurrence in animals older than two years. These results are of great epidemiological relevance, as they indicate that the bacterium is present in the sampled regions of the state of Paraná. Therefore, the disease must be included in the differential diagnosis of diseases with similar clinical manifestations.

Lawsonia intracellularis é uma bactéria já descrita em várias espécies, sendo mais comum em suínos, ocasionando problemas entéricos nesses animais. Dentre estes, equinos podem ser acometidos, levando à uma doença conhecida como Enteropatia Proliferativa Equina que é decorrente da proliferação das células da cripta intestinal em reação à infecção pela bactéria. Apesar de existirem relatos da doença em diversos países, inclusive no Brasil, no estado do Paraná ainda não se tem relatos da doença e estudos epidemiológicos da ocorrência em equinos sintomáticos ou assintomáticos. O objetivo do presente estudo foi avaliar a ocorrência de L. intracellularis em equinos assintomáticos criados nas regiões Oeste, Noroeste e Norte do estado do Paraná através de sorologia e qPCR. Para a sorologia, utilizou-se a técnica da Imunoperoxidase em Monocamadas (IPMA). As fezes foram processadas e submetidas à técnica de Reação em Cadeia pela Polimerase em Tempo Real (qPCR). Ao todo, foram coletadas amostras de 162 animais de 20 propriedades. Destas, 9/162 (5,55%) apresentaram anticorpos específicos contra L. intracellularis. Já a qPCR, identificou 7/162 (4,32%) amostras de fezes positivas para a presença da bactéria. Ao se comparar as técnicas, nenhuma amostra foi positiva em ambas, demonstrando que, para um melhor diagnóstico, as mesmas devem ser realizadas em conjunto. Em contraste à grande parte dos relatos em equinos, o presente estudo encontrou uma maior ocorrência sorológica e molecular em animais com mais de dois anos de idade. Esses resultados são de grande relevância epidemiológica, pois indicam que a bactéria está presente nas regiões amostradas do estado do Paraná, levando à necessidade de incluir a doença no diagnóstico diferencial de enfermidades que cursam com manifestações clínicas semelhantes.

Occurrence of Lawsonia intracellularis in horses raised in three regions of the state of Paraná, Brazil / Ocorrência de Lawsonia intracellularis em equinos criados em três regiões do estado do Paraná, Brasil

Lawsonia intracellularis is a bacterium already described in several species and most prevalent in pigs, in which it causes enteric problems. Horses can also be affected, developing a disease known as equine proliferative enteropathy, which results from the proliferation of intestinal crypt cells in response to infection by the bacterium. Despite the existence of reports of the disease in several countries, including Brazil, there are still no reports of the disease or epidemiological studies of its occurrence in symptomatic or asymptomatic horses in the state of Paraná. Thus, the present study was conducted to examine the occurrence of L. intracellularis in asymptomatic horses raised in the west, northwest and north regions of Paraná by means of serological testing and the real-time polymerase chain reaction (qPCR) technique. In the serological approach, the immunoperoxidase monolayer assay (IPMA) technique was employed. Feces were processed and subjected to qPCR. In total, samples were collected from 162 animals from 20 farms. Of these, 9/162 (5.55%) showed specific antibodies against L. intracellularis. Real-time PCR, on the other hand, identified 7/162 (4.32%) fecal samples positive for the presence of the bacterium. When the techniques were compared, none of the samples was positive by both, demonstrating that, for a better diagnosis, they must be performed together. In contrast to most reports in horses, the present studyde scribes higher serological and molecular occurrence in animals older than two years. These results are of great epidemiological relevance, as they indicate that the bacterium is present in the sampled regions of the state of Paraná. Therefore, the disease must be included in the differential diagnosis of diseases with similar clinical manifestations.(AU)

Lawsonia intracellularis é uma bactéria já descrita em várias espécies, sendo mais comum em suínos, ocasionando problemas entéricos nesses animais. Dentre estes, equinos podem ser acometidos, levando à uma doença conhecida como Enteropatia Proliferativa Equina que é decorrente da proliferação das células da cripta intestinal em reação à infecção pela bactéria. Apesar de existirem relatos da doença em diversos países, inclusive no Brasil, no estado do Paraná ainda não se tem relatos da doença e estudos epidemiológicos da ocorrência em equinos sintomáticos ou assintomáticos. O objetivo do presente estudo foi avaliar a ocorrência de L. intracellularis em equinos assintomáticos criados nas regiões Oeste, Noroeste e Norte do estado do Paraná através de sorologia e qPCR. Para a sorologia, utilizou-se a técnica da Imunoperoxidase em Monocamadas (IPMA). As fezes foram processadas e submetidas à técnica de Reação em Cadeia pela Polimerase em Tempo Real (qPCR). Ao todo, foram coletadas amostras de 162 animais de 20 propriedades. Destas, 9/162 (5,55%) apresentaram anticorpos específicos contra L. intracellularis. Já a qPCR, identificou 7/162 (4,32%) amostras de fezes positivas para a presença da bactéria. Ao se comparar as técnicas, nenhuma amostra foi positiva em ambas, demonstrando que, para um melhor diagnóstico, as mesmas devem ser realizadas em conjunto. Em contraste à grande parte dos relatos em equinos, o presente estudo encontrou uma maior ocorrência sorológica e molecular em animais com mais de dois anos de idade. Esses resultados são de grande relevância epidemiológica, pois indicam que a bactéria está presente nas regiões amostradas do estado do Paraná, levando à necessidade de incluir a doença no diagnóstico diferencial de enfermidades que cursam com manifestações clínicas semelhantes.(AU)

Molecular detection of Leishmania infantum in donkeys and mules under semiarid conditions in Brazil / Detecção molecular de Leishmania infantum em asininos e muares sob condições semiáridas

Abstract Visceral leishmaniasis is a parasitic zoonosis that mainly affects poorest and most vulnerable populations, and domestic dogs are considered to be the main source of infection to the vector and therefore humans. However, several studies have investigated the role of other vertebrate hosts in the disease cycle. In this context, the aim of the present study was to conduct a survey of Leishmania infantum infection in donkeys and mules living in a semiarid region of Brazil. Whole blood sampled from 72 equids (65 donkeys and 7 mules) was used to perform molecular diagnosis using the real-time polymerase chain reaction (qPCR) technique. A total of 25% of the samples (18/72) were positive through qPCR, but there were no significant differences between the species (donkeys or mules), sex (male or female) and abandonment situation of the animals (yes or no). Donkeys and mules living under semiarid conditions have high frequency of L. infantum infection. It is therefore worth assigning importance to these species in the epidemiological cycle of visceral leishmaniasis, either as potential reservoirs or just as an abundant food source for vectors.

Resumo A leishmaniose visceral é uma zoonose parasitária que afeta principalmente populações mais pobres e vulneráveis, e os cães domésticos são considerados as principais fontes de infecção para o vetor e, portanto, para os humanos. Porém diversos estudos têm pesquisado o papel de outros hospedeiros vertebrados no ciclo da doença. Neste contexto, objetivou-se realizar um levantamento da infecção por Leishmania infantum em asininos e muares, vivendo em região semiárida do Brasil. Foi utilizado sangue total de 72 equídeos (65 asininos e 7 muares) para a realização de diagnóstico molecular por meio da técnica de Reação em Cadeia de Polimerase em Tempo Real (qPCR). Um total de 25% das amostras (18/72) resultaram positivas na qPCR, porém não houve diferença significativa entre as espécies (asininos e muares), sexo (macho e fêmea) e situação de abandono dos animais (sim ou não). Asininos e muares, vivendo em condições semiáridas, apresentam alta frequência de infecção por L. infantum, sendo válido atribuir importância a essas espécies no ciclo epidemiológico da leishmaniose visceral, seja como um reservatório em potencial, seja apenas como uma fonte alimentar abundante para os vetores.

The effect of androgen on wool follicles and keratin production in Hetian sheep / Efeito do androgênio na produção de folículos e queratina em ovinos Hetianos

To investigate the optimal androgen concentration for culturing Hetian sheep wool follicle and to detect effects of androgen concentration on wool follicle cell proliferation and apoptosis using immunofluorescence labeling and real-time quantitative fluorescence determinations of wool keratin-associated protein gene expression levels. Wool follicles were isolated by microdissection and wool follicles and skin pieces were cultured in various concentrations of dihydrotestosterone (DHT) in culture medium. Next, daily lengthwise growth measurements of wool follicles were obtained using a microscopic micrometer. Cultured Hetian wool follicles were stained using the SACPIC method to reveal wool follicle structure, while sheep skin slices were used to observe cell proliferation by immunostaining and cell apoptosis using the TUNEL method. At the molecular biological level, keratin-associated protein (Kap) gene expression was studied using wool follicles cultured for various numbers of days in vitro. Effects of androgen concentrations on Hetian wool follicle growth and development were experimentally studied. EdU proliferation assays revealed that androgen promoted cell proliferation within wool follicle dermal papillae. TUNEL apoptosis detection demonstrated that androgen treatment could delay cell apoptosis. Quantitative reverse transcription polymerase chain reaction (qPCR) results demonstrated that gene expression level patterns of Hetian mountain sheep super-high sulfur protein. Kap1.1, KIF1.2, Kap2.12 and Kap4.2 gene expression level of the mountainous experimental group was significantly higher than plains Hetian sheep. An androgen concentration of 100 nM can promote the growth of Hetian wool follicle cells in vitro, resulting in overexpression of some genes of the Kap family.(AU)

Investigar a concentração ideal de andrógenos em cultura de folículos pilosos de carneiro Hetiano e detectar os efeitos da concentração de andrógenos na proliferação e apoptose de células foliculares, por meio de imunofluorescência e de determinação quantitativa, em tempo real, da fluorescência dos níveis de expressão gênica de proteína associada à queratina. Folículos pilosos foram isolados por microdissecção, e folículos de lã e pedaços de pele foram cultivados em várias concentrações de di-hidrotestosterona (DHT) em meio de cultura. Em seguida, medições diárias de crescimento longitudinal dos folículos capilares foram obtidas usando um micrômetro microscópico. Folículos de lã cultivados de Hetianos foram corados pelo método SACPIC para revelar a estrutura do folículo piloso, enquanto fatias de pele de carneiro foram usadas para observar a proliferação celular por imunocoloração e apoptose celular por meio do método TUNEL. Em âmbito da biologia molecular, a expressão gênica da proteína associada à queratina (Kap) foi estudada usando folículos capilares cultivados por vários dias, in vitro. Os efeitos das concentrações de andrógenos no crescimento e desenvolvimento dos folículos de lã de Hetianos foram estudados experimentalmente. Ensaios de proliferação de EdU revelaram que o andrógeno promoveu a proliferação celular dentro das papilas dérmicas do folículo piloso. A detecção de apoptose por TUNEL demonstrou que o tratamento com andrógeno poderia atrasar a apoptose celular. Os resultados da reação em cadeia da polimerase transcrição reversa quantitativa (qPCR) demonstraram que os padrões de expressão gênica da proteína de enxofre Kap1.1, KIF1.2, Kap2.12 e Kap4.2 foram significativamente maiores no grupo de ovinos Hetianos de montanha. Uma concentração de androgênio de 100 nM pode promover o crescimento de células foliculares de lã de Hetianos in vitro, resultando na superexpressão de alguns genes da família Kap.(AU)