Effects of functional oil blend on performance, blood metabolites, organ biometry and intestinal morphometry in nursery piglets / Efeitos da mistura de óleo funcional no desempenho, metabólitos sanguíneos, biometria de órgãos e morfometria intestinal em leitões de creche

This study was conducted to assess the effects of functional oil (FO) blend on performance, blood metabolites, organ biometry and intestinal morphometry in piglets. A total of 128 crossbreed piglets (Landrace × Large White, 64 uncastrated males and 64 females, 21 d of age, and 6.79 ± 1.76 kg BW) were allocated in a randomized complete block design with two dietary treatments: a FO-free (FOF) diet or a diet based on added FO (1,500 mg/kg of diet with castor oil plus cashew nutshell oil). Piglets fed FO showed higher (p ≤ 0.05) average daily feed intake, daily body weight gain and final body weight after 23 d of study. For the total period, piglets fed FO showed greater (p = 0.007) feed conversion ratio. On d 23, higher serum total protein (p = 0.026) and globulin (p = 0.050) concentration, lower liver (p = 0.042) and stomach (p = 0.074) weight, and greater (p = 0.082) villi height (VH) in duodenum were observed in piglets fed FO. Nonetheless, piglets fed FOF showed greater (p = 0.054) ileal VH, but greater (p = 0.004) crypt depth (CD) in jejunum. Piglets fed FO showed higher VH to CD ratio in jejunum (p = 0.068) and duodenum (p = 0.074) on d 23 and 37, respectively. Based on the results, FO blend improved the performance of weaned piglets; however, it negatively affected the feed conversion ratio in the total period. Moreover, FO blend promoted changes in total protein concentrations and improvements in digestive and absorptive capacity assessed through VH to CD ratio, with a significant reduction in organs.

Este estudo foi conduzido para avaliar os efeitos de uma mistura de óleo funcional (OF) no desempenho zootécnico, nos metabólitos sanguíneos, na biometria de órgãos e na morfometria intestinal de leitões. Um total de 128 leitões mestiços (Landrace × Large White, 64 machos inteiros e 64 fêmeas; 21 dias de idade e peso corporal de 6,79 ± 1,76 kg) foram alocados em um delineamento de blocos casualizados completos, com dois tratamentos dietéticos: uma dieta sem OF (SOF) ou uma dieta baseada na adição de OF (1.500 mg/kg de dieta com OF de mamona e castanha de caju). Os leitões alimentados com OF apresentaram maior (p ≤ 0,05) consumo de ração diário médio, ganho de peso corporal diário e peso corporal aos 23 dias de experimento. Entretanto, os leitões que consumiram dietas com OF tiveram conversão alimentar superior (p = 0,007) no período total. No dia 23, houve aumento na concentração de proteína total (p = 0,026) e globulina (p = 0,050), menor peso de fígado (p = 0,042) e estômago (p = 0,074), e maior (p = 0,082) altura de vilosidade (AV) no duodeno em leitões que consumiram OF; entretanto, os leitões SOF tiveram (p = 0,054) AV superior no íleo, mas apresentaram (p = 0,004) profundidade de cripta (PC) superior no jejuno. Uma maior relação AV:PC no jejuno (p = 0,068) e duodeno (p = 0,074) foi observada em leitões com OF nos dias 23 e 37, respectivamente. Com base nos resultados, a mistura de OF melhorou o desempenho dos leitões desmamados; no entanto, afetou negativamente a taxa de conversão alimentar no período total. Além disso, a mistura de OF promoveu alterações nas concentrações proteínas totais e melhorias na capacidade digestiva e absortiva avaliadas através da relação AV:PC, com uma redução significativa nos órgãos.

Antioxidant activity of oily extract obtained from Lippia origanoides improves the quality of bovine embryos produced in vitro / Atividade antioxidante de óleo essencial obtido de Lippia origanoides melhora a qualidade de embriões bovinos produzidos in vitro

The aim of this study was to evaluate the supplementation of embryo culture medium with antioxidant obtained from oily extract of Lippia origanoides on in vitro blastocyst development and quality. Oocytes collected from slaughterhouse ovaries were matured and fertilized in vitro following standard laboratory procedures. Zygotes were cultured in SOF medium supplemented according to the following treatments: T1 embryo culture medium without antioxidant supplementation; T2)50µM/mL Cysteamine; T3)2.5µg/mL; T4)5.0µg/mL and T5)10.0µg/mL of antioxidant obtained from oily extract of Lippia origanoides. On the seventh day of culture, the blastocysts were fixed and evaluated for apoptosis rates, number of total cell and inner cell mass cells by means of the TUNEL Test. The use of antioxidants during cultivation did not increase (P> 0.05) the final blastocyst production rate. The treatments T2, T3, T4 and T5 had the lowest (P< 0.05) apoptotic indexes (4.5±1.1%, 8.4±2.5%, 3.4±1.1% and 5.5±0.9%, respectively) when compared to T1 treatment (10.0±1.4%). The number of inner cell mass did not differ (P> 0.05) among embryos from different treatments. The addition of antioxidant obtained from oily extract of Lippia origanoides reduces the apoptosis rate and improves the quality without increasing the total in vitro production of bovine embryos.(AU)

O objetivo desse estudo foi avaliar a suplementação de meio de cultura de embriões com antioxidante obtido do extrato oleoso da Lippia origanoides no desenvolvimento e na qualidade de blastocistos produzidos in vitro. Oócitos coletados de ovários de matadouros foram maturados e fertilizados in vitro segundo procedimento laboratorial padrão. Zigotos foram cultivados em meio SOF suplementado de acordo com os seguintes tratamentos: T1) meio de cultivo embrionário sem suplementação antioxidantes; T2) 50µM/mL Cisteamina; T3) 2,5µg/mL; T4) 5,0µg/mL e T5) 10,0µg/mL do antioxidante obtido do extrato oleoso de Lippia origanoides. No sétimo dia de cultivo, os blastocistos foram fixados e avaliados para taxa de apoptose, número total de células e massa celular interna através do teste TUNEL. O uso de antioxidantes durante cultivo não aumentou (P>0,05) a taxa de produção final de blastócitos. Os tratamentos T2, T3, T4 e T5 tiverem menor índice apoptótico (p>0,05 - 4,5±1,1%, 8,4±2,5%, 3,4±1,1% e 5,5±0,9%, respectivamente) quando comparados a T2 (10,0±1,4%). O valor de massa celular interna não diferenciou (p>0,05) entre embriões de diferentes tratamentos. A adição de antioxidante obtido do extrato oleoso de Lippia origanoides reduziu a taxa de apoptose e melhorou a qualidade sem aumentar a produção in vitro de embriões bovinos.(AU)

Antioxidant activity of oily extract obtained from Lippia origanoides improves the quality of bovine embryos produced in vitro / Atividade antioxidante de óleo essencial obtido de Lippia origanoides melhora a qualidade de embriões bovinos produzidos in vitro

The aim of this study was to evaluate the supplementation of embryo culture medium with antioxidant obtained from oily extract of Lippia origanoides on in vitro blastocyst development and quality. Oocytes collected from slaughterhouse ovaries were matured and fertilized in vitro following standard laboratory procedures. Zygotes were cultured in SOF medium supplemented according to the following treatments: T1 embryo culture medium without antioxidant supplementation; T2)50µM/mL Cysteamine; T3)2.5µg/mL; T4)5.0µg/mL and T5)10.0µg/mL of antioxidant obtained from oily extract of Lippia origanoides. On the seventh day of culture, the blastocysts were fixed and evaluated for apoptosis rates, number of total cell and inner cell mass cells by means of the TUNEL Test. The use of antioxidants during cultivation did not increase (P> 0.05) the final blastocyst production rate. The treatments T2, T3, T4 and T5 had the lowest (P< 0.05) apoptotic indexes (4.5±1.1%, 8.4±2.5%, 3.4±1.1% and 5.5±0.9%, respectively) when compared to T1 treatment (10.0±1.4%). The number of inner cell mass did not differ (P> 0.05) among embryos from different treatments. The addition of antioxidant obtained from oily extract of Lippia origanoides reduces the apoptosis rate and improves the quality without increasing the total in vitro production of bovine embryos.(AU)

O objetivo desse estudo foi avaliar a suplementação de meio de cultura de embriões com antioxidante obtido do extrato oleoso da Lippia origanoides no desenvolvimento e na qualidade de blastocistos produzidos in vitro. Oócitos coletados de ovários de matadouros foram maturados e fertilizados in vitro segundo procedimento laboratorial padrão. Zigotos foram cultivados em meio SOF suplementado de acordo com os seguintes tratamentos: T1) meio de cultivo embrionário sem suplementação antioxidantes; T2) 50µM/mL Cisteamina; T3) 2,5µg/mL; T4) 5,0µg/mL e T5) 10,0µg/mL do antioxidante obtido do extrato oleoso de Lippia origanoides. No sétimo dia de cultivo, os blastocistos foram fixados e avaliados para taxa de apoptose, número total de células e massa celular interna através do teste TUNEL. O uso de antioxidantes durante cultivo não aumentou (P>0,05) a taxa de produção final de blastócitos. Os tratamentos T2, T3, T4 e T5 tiverem menor índice apoptótico (p>0,05 - 4,5±1,1%, 8,4±2,5%, 3,4±1,1% e 5,5±0,9%, respectivamente) quando comparados a T2 (10,0±1,4%). O valor de massa celular interna não diferenciou (p>0,05) entre embriões de diferentes tratamentos. A adição de antioxidante obtido do extrato oleoso de Lippia origanoides reduziu a taxa de apoptose e melhorou a qualidade sem aumentar a produção in vitro de embriões bovinos.(AU)

The role of Kisspeptin in bovine in vitro embryo production / Efeito da Kisspeptina na produção in vitro de embriões bovinos

The aim of this study was to investigate the effect of Kisspeptin (Kp) on the medium used in different stages of in vitro production of bovine embryo (IVEP), evaluating cleavage (CR) and blastocyst (BR) rates. The study was divided into three experiments that analyzed, respectively, the action of Kp on in vitro maturation (IVM), in vitro fertilization (IVF), and in vitro culture (IVC) of bovine embryos. In experiment 1, the oocytes were matured in IVM medium and distributed into the following treatments: maturation (IVM Control, n = 102), maturation with addition of 10-7 M Kp (Kp 10-7 IVM, n = 90), and hormone-free maturation luteinizing hormone (LH) and follicle-stimulating hormone (FSH) with the addition of 10-7M Kp (No hormones + Kp 10-7, n = 84), following maturation to normal stages of IVEP. In experiment 2, the oocytes were fertilized in IVF medium, in the following treatments: TALP-FERT without Kp (Control IVF, n = 103) and TALP-FERT with the addition of 10-7M Kp (Kp 10-7 IVF, n = 119), usually following the other steps. Finally, in the third experiment, the oocytes passed through all phases and were divided into IVC in two treatments: SOF medium without Kp (Control IVC, n = 109) and SOF medium with the addition of 10-7M Kp (Kp 10-7, N = 106). The data were analyzed by PROC GLIMMIX of the SAS program. In experiment 1, the means of CR and BR were similar (P > 0.05) between treatments (IVM Control76.47% and 37.25%, Kp 10-7 MIV80% and 33.33%, and No hormones + Kp 10-770.24% and 30.95%, respectively). In experiment 2, the means of CR were similar for the IVF Control and Kp 10-7 IVF groups (P > 0.05), 76.70% and 86.55% respectively. But, the mean of the BR of the group Kp 10-7 IVF was 38.66%, which was higher (P 0.05) were similar between the IVC Control and Kp 10-7 IVC groups (CR 83.50% and 78.30%, and BR 26.60% and 23.60%, respectively)...

Objetivou-se com esse estudoinvestigar o efeito da Kisspeptina (Kp) nos meios base utilizados nas etapas da Produção in vitro de Embriões (PIVE) bovinos, avaliando as taxas de clivagem (TC) e blastocistos (TB). O estudo foi dividido em três experimentos, sendo respectivamente analisado em cada um a ação da Kp na maturação in vitro (MIV), fertilização in vitro (FIV) e cultivo in vitro (CIV) de embriões bovinos. No experimento 1 os oócitos foram maturados em meio base MIV, distribuídos nos seguintes tratamentos: maturação (Controle MIV, n=102), maturação com adição de 10-7M de Kp-10 (Kp 10-7 MIV, n=90) e maturação sem hormônios LH e FSH com adição de 10-7M de Kp-10 (Sem hormônios + Kp 10-7, n=84), seguindo após a maturação para as etapas normais da PIVE. No experimento 2 os oócitos foram fecundados em meio base da FIV, nos seguintes tratamentos:TALP-FERT sem Kp (Controle FIV, n = 103) e TALP-FERT com adição de 10-7M de Kp-10 (Kp 10-7 FIV, n = 119), seguindo normalmente pelas outras etapas. Finalmente, no terceiro experimento os oócitos passaram por todas as fases e foram divididos no CIV em 2 tratamentos: meio SOF sem Kp (Controle CIV, n = 109) e meio SOF com adição de 10-7M de Kp-10 (Kp 10-7 3, n = 106). Os dados foram analisados pelo PROC GLIMMIX do programa SAS. No experimento 1 as médias das TC e TB foram semelhantes (P > 0,05) entre os tratamentos Controle MIV 76,47% e 37,25%, Kp 10-7 MIV 80% e 33,33% e Sem hormônios + Kp 10- 7 70,24% e 30,95%, respectivamente. No experimento 2 as médias das TC foram semelhantes para os grupos Controle FIV e Kp 10-7 FIV (P > 0,05), sendo 76,70% e 86,55%, respectivamente. Porém, a média da TB do grupo Kp 10-7 FIV 38,66%, foi superior (P 0,05) também foram similares entre os tratamentos Controle CIV e Kp 10-7 CIV...

The role of Kisspeptin in bovine in vitro embryo production / Efeito da Kisspeptina na produção in vitro de embriões bovinos

The aim of this study was to investigate the effect of Kisspeptin (Kp) on the medium used in different stages of in vitro production of bovine embryo (IVEP), evaluating cleavage (CR) and blastocyst (BR) rates. The study was divided into three experiments that analyzed, respectively, the action of Kp on in vitro maturation (IVM), in vitro fertilization (IVF), and in vitro culture (IVC) of bovine embryos. In experiment 1, the oocytes were matured in IVM medium and distributed into the following treatments: maturation (IVM Control, n = 102), maturation with addition of 10-7 M Kp (Kp 10-7 IVM, n = 90), and hormone-free maturation luteinizing hormone (LH) and follicle-stimulating hormone (FSH) with the addition of 10-7M Kp (No hormones + Kp 10-7, n = 84), following maturation to normal stages of IVEP. In experiment 2, the oocytes were fertilized in IVF medium, in the following treatments: TALP-FERT without Kp (Control IVF, n = 103) and TALP-FERT with the addition of 10-7M Kp (Kp 10-7 IVF, n = 119), usually following the other steps. Finally, in the third experiment, the oocytes passed through all phases and were divided into IVC in two treatments: SOF medium without Kp (Control IVC, n = 109) and SOF medium with the addition of 10-7M Kp (Kp 10-7, N = 106). The data were analyzed by PROC GLIMMIX of the SAS program. In experiment 1, the means of CR and BR were similar (P > 0.05) between treatments (IVM Control76.47% and 37.25%, Kp 10-7 MIV80% and 33.33%, and No hormones + Kp 10-770.24% and 30.95%, respectively). In experiment 2, the means of CR were similar for the IVF Control and Kp 10-7 IVF groups (P > 0.05), 76.70% and 86.55% respectively. But, the mean of the BR of the group Kp 10-7 IVF was 38.66%, which was higher (P < 0.05) than that of the FIV Control group, which was 31.07%. In the third experiment, the means of CR and BR (P > 0.05) were similar between the IVC Control and Kp 10-7 IVC groups (CR 83.50% and 78.30%, and BR 26.60% and 23.60%, respectively)...(AU)

Objetivou-se com esse estudoinvestigar o efeito da Kisspeptina (Kp) nos meios base utilizados nas etapas da Produção in vitro de Embriões (PIVE) bovinos, avaliando as taxas de clivagem (TC) e blastocistos (TB). O estudo foi dividido em três experimentos, sendo respectivamente analisado em cada um a ação da Kp na maturação in vitro (MIV), fertilização in vitro (FIV) e cultivo in vitro (CIV) de embriões bovinos. No experimento 1 os oócitos foram maturados em meio base MIV, distribuídos nos seguintes tratamentos: maturação (Controle MIV, n=102), maturação com adição de 10-7M de Kp-10 (Kp 10-7 MIV, n=90) e maturação sem hormônios LH e FSH com adição de 10-7M de Kp-10 (Sem hormônios + Kp 10-7, n=84), seguindo após a maturação para as etapas normais da PIVE. No experimento 2 os oócitos foram fecundados em meio base da FIV, nos seguintes tratamentos:TALP-FERT sem Kp (Controle FIV, n = 103) e TALP-FERT com adição de 10-7M de Kp-10 (Kp 10-7 FIV, n = 119), seguindo normalmente pelas outras etapas. Finalmente, no terceiro experimento os oócitos passaram por todas as fases e foram divididos no CIV em 2 tratamentos: meio SOF sem Kp (Controle CIV, n = 109) e meio SOF com adição de 10-7M de Kp-10 (Kp 10-7 3, n = 106). Os dados foram analisados pelo PROC GLIMMIX do programa SAS. No experimento 1 as médias das TC e TB foram semelhantes (P > 0,05) entre os tratamentos Controle MIV 76,47% e 37,25%, Kp 10-7 MIV 80% e 33,33% e Sem hormônios + Kp 10- 7 70,24% e 30,95%, respectivamente. No experimento 2 as médias das TC foram semelhantes para os grupos Controle FIV e Kp 10-7 FIV (P > 0,05), sendo 76,70% e 86,55%, respectivamente. Porém, a média da TB do grupo Kp 10-7 FIV 38,66%, foi superior (P < 0,05) ao grupo controle FIV 31,07%. No terceiro experimento as médias das TC e TB (P > 0,05) também foram similares entre os tratamentos Controle CIV e Kp 10-7 CIV...(AU)

Efeito da adição do ácido linoleico conjugado no cultivo in vitro de embriões F1 Holandês x Zebu na sobrevivência pós-vitrificação

ABSTRACT The effect of adding conjugated linoleic acid (CLA) to the culture media on the viability after cryopreservation of F1 Holstein X Zebu embryos was evaluated. Three different culture media were tested: control (n = 340 oocytes): SOF medium and fetal bovine serum (FBS) without the CLA; FBS + CLA (n = 359 oocytes): SOF, FBS and CLA; CLA (n = 339 oocytes): SOF and CLA without the FBS. The produced blastocysts were subjected to vitrification, by the Open Pulled Straw method. Fifteen blastocysts per treatment were fixed for lipid quantification by staining with Sudan Black B. Embryo re-expansion and hatching capability were used to assess viability (control = 27; FBS + CLA = 30; CLA = 17). Transfers of one or two embryos to recipients were performed to evaluate in vivo survival: T1 [recipients that received one blastocyst (n=17 embryos, Control=5, FBS+CLA=6 and CLA=6)]; T2 [recipients that received two blastocysts (n =54 embryos, Control=18, FBS+CLA=14 and CLA=22)]. There was no difference in cleavage rate (62.1%; 74%; 74% for Control; FBS + CLA, CLA, respectively), blastocyst production in relation to the cleaved structures (59.7%; 47.7%; 38 3% for Control; FBS + CLA, CLA, respectively) and blastocyst production relative to the total oocytes (37.1%, 35.4%, 28.3% for Control; FBS + CLA, CLA, respectively) between treatments (P> 0.05). A reduction of lipid droplets was observed in embryos cultured in medium supplemented with CLA compared to embryos cultured in the FCS in the absence and presence of CLA (P 0.05). The reexpansion rate was higher in the Control group (70.4%) compared to the CLA (47.1%) and lowest for FBS+CLA (43.3%) (P 0.05). The hatching rates were similar among treatments, 42.1%; 23.1%; 25% for control; SFB + CLA; CLA respectively (P>0.05). Only one pregnancy was observed in early and confirmatory diagnosis, as the result of a Control group embryo transfer. Although embryos cultured with CLA have shown smaller intracytoplasmic lipid content, no difference was observed in viability following vitrification between treatments.

RESUMO Avaliou-se o efeito da adição do ácido linoleico conjugado (CLA) ao meio de cultivo in vitro na viabilidade pós-vitrificação de embriões F1 Holandês x Zebu. Foram utilizados três meios de cultivo: controle (n=340 oócitos): meio SOF e soro fetal bovino (SFB), sem o CLA; SFB+CLA (n=359 oócitos): meio SOF, SFB e CLA; CLA (n=339 oócitos): meio SOF e CLA, sem o SFB. Todos os blastocistos produzidos foram submetidos à vitrificação, pelo método de Open Pulled Straw. Quinze blastocistos de cada tratamento foram fixados para quantificação lipídica por coloração com Sudan Black B. Para avaliar a viabilidade embrionária, foi observada a capacidade de reexpansão e eclosão pós-aquecimento dos embriões (controle=27; SFB+CLA=30; CLA=17). Foram realizadas transferências em um ou dois embriões por receptora para avaliação da sobrevivência in vivo: T1 [receptoras que receberam um blastocisto (n=17 embriões, sendo controle=5, SFB+CLA=6 e CLA=6)]; T2 [receptoras que receberam dois blastocistos, (n= 54 embriões, sendo controle=18, SFB+CLA=14 e CLA=22)]. Não houve diferença nas taxas de clivagem (62,1%; 74,0%; 74,0% para controle; SFB+CLA; CLA, respectivamente), produção de blastocistos em relação aos clivados (59,7%; 47,7%; 38,3% para controle; SFB+CLA; CLA, respectivamente) e produção de blastocistos em relação ao total de oócitos (37,1%; 35,4%; 28,3% para controle; SFB+CLA; CLA, respectivamente) (P>0,05). Houve diminuição de gotículas lipídicas nos embriões cultivados em meio suplementado com CLA em relação aos embriões cultivados na presença do SFB e na ausência do CLA (P 0,05). A taxa de reexpansão foi maior no grupo controle (70,4%) em relação ao CLA (47,1%) e menor no grupo SFB+CLA (43,3%) (P 0,05). O CLA foi eficaz em reduzir a deposição de lipídeos intracitoplasmáticos nas células embrionárias, porém não houve diferença de viabilidade após a desvitrificação dos embriões.

Effective individual culture system for in vitro production of bovine embryos / Sistema eficaz de cultivo individual de embriões bovinos produzidos in vitro

A new and effective protocol to culture bovine embryos without coculture and with individualized culture media has been established, which would allow the study of a single embryo's metabolism. For this purpose, bovine embryos were produced in vitro by standard protocols in three different types of media: KSOM, SOFaa, and KSOM followed by SOFaa at day 2. Presumptive zygotes were divided into six groups: control, cultured in groups (C-KSOM, C-SOFaa, and C-KS), and individual well system (W-KSOM, W-SOFaa, and W-KS). Cleavage and blastocyst rates were assessed on days 2 and 7 respectively. Relative quantification of transcripts related to important metabolic processes (GLUT1, GLUT3, GSK3, SOD1, HSPD1, G6PD) were assessed in C-KS and W-KS blastocysts. Results show that cleavage was significantly higher only in W-KSOM when compared to C-KSOM, while blastocyst rates differ only between C-SOF and W-SOF. All the other comparisons did not present statistical difference. Moreover, gene expression analysis revealed that blastocysts cultured in groups and in the individual well system present similar transcription patterns. Thus, the obtained conclusion was that the individual well system performed could be used as an effective alternative protocol for individual culture of bovine embryos, since the rates are similar to routine group culture.(AU)

Estabeleceu-se um protocolo novo e eficaz de cultivo individual de embriões bovinos sem o uso de cocultivo e sem compartilhamento de meio visando à análise do metabolismo individual do embrião. Para isso, embriões foram produzidos in vitro por protocolos convencionais em três diferentes tipos de meio: KSOM, SOFaa e KSOM seguido por SOFaa no dia 2. Os zigotos presumíveis foram divididos em seis grupos: controles (cultivo em grupo ­ C-KSOM, C-SOFaa e C-KS) e sistema de poços individuais (W-KSOM, W-SOFaa e W-KS). As taxas de clivagem foram avaliadas nos dias 2 e 7, respectivamente. Além disso, a quantificação relativa de transcritos relacionados a importantes processos metabólicos (GLUT1, GLUT3, GSK3, SOD1, HSPD1 e G6PD) foi avaliada nos blastocistos dos grupos C-KS e W-KS. Os resultados mostram que as taxas de clivagem foram maiores apenas no grupo W-KSOM quando comparado ao grupo C-KSOM, enquanto a taxa de blastocistos diferiu apenas entre os grupos C e W-SOF. Além disso, a análise da expressão gênica mostrou que blastocistos cultivados em grupo ou em sistema de poços individuais são semelhantes quanto à expressão gênica. Assim, a conclusão obtida foi que o sistema individual proposto pode ser utilizado como um protocolo alternativo eficiente para o cultivo individual de embriões de bovino, uma vez que suas características permanecem semelhantes àquelas do sistema convencional de produção de embriões.(AU)

Effective individual culture system for in vitro production of bovine embryos / Sistema eficaz de cultivo individual de embriões bovinos produzidos in vitro

A new and effective protocol to culture bovine embryos without coculture and with individualized culture media has been established, which would allow the study of a single embryo's metabolism. For this purpose, bovine embryos were produced in vitro by standard protocols in three different types of media: KSOM, SOFaa, and KSOM followed by SOFaa at day 2. Presumptive zygotes were divided into six groups: control, cultured in groups (C-KSOM, C-SOFaa, and C-KS), and individual well system (W-KSOM, W-SOFaa, and W-KS). Cleavage and blastocyst rates were assessed on days 2 and 7 respectively. Relative quantification of transcripts related to important metabolic processes (GLUT1, GLUT3, GSK3, SOD1, HSPD1, G6PD) were assessed in C-KS and W-KS blastocysts. Results show that cleavage was significantly higher only in W-KSOM when compared to C-KSOM, while blastocyst rates differ only between C-SOF and W-SOF. All the other comparisons did not present statistical difference. Moreover, gene expression analysis revealed that blastocysts cultured in groups and in the individual well system present similar transcription patterns. Thus, the obtained conclusion was that the individual well system performed could be used as an effective alternative protocol for individual culture of bovine embryos, since the rates are similar to routine group culture.(AU)

Estabeleceu-se um protocolo novo e eficaz de cultivo individual de embriões bovinos sem o uso de cocultivo e sem compartilhamento de meio visando à análise do metabolismo individual do embrião. Para isso, embriões foram produzidos in vitro por protocolos convencionais em três diferentes tipos de meio: KSOM, SOFaa e KSOM seguido por SOFaa no dia 2. Os zigotos presumíveis foram divididos em seis grupos: controles (cultivo em grupo ­ C-KSOM, C-SOFaa e C-KS) e sistema de poços individuais (W-KSOM, W-SOFaa e W-KS). As taxas de clivagem foram avaliadas nos dias 2 e 7, respectivamente. Além disso, a quantificação relativa de transcritos relacionados a importantes processos metabólicos (GLUT1, GLUT3, GSK3, SOD1, HSPD1 e G6PD) foi avaliada nos blastocistos dos grupos C-KS e W-KS. Os resultados mostram que as taxas de clivagem foram maiores apenas no grupo W-KSOM quando comparado ao grupo C-KSOM, enquanto a taxa de blastocistos diferiu apenas entre os grupos C e W-SOF. Além disso, a análise da expressão gênica mostrou que blastocistos cultivados em grupo ou em sistema de poços individuais são semelhantes quanto à expressão gênica. Assim, a conclusão obtida foi que o sistema individual proposto pode ser utilizado como um protocolo alternativo eficiente para o cultivo individual de embriões de bovino, uma vez que suas características permanecem semelhantes àquelas do sistema convencional de produção de embriões.(AU)

Efeito da adição do ácido linoleico conjugado no cultivo in vitro de embriões F1 Holandês x Zebu na sobrevivência pós-vitrificação / Effect of conjugated linoleic acid addition in in vitro culture medium in F1 Holstein X Zebu embryo survival post vitrification

Avaliou-se o efeito da adição do ácido linoleico conjugado (CLA) ao meio de cultivo in vitro na viabilidade pós-vitrificação de embriões F1 Holandês x Zebu. Foram utilizados três meios de cultivo: controle (n=340 oócitos): meio SOF e soro fetal bovino (SFB), sem o CLA; SFB+CLA (n=359 oócitos): meio SOF, SFB e CLA; CLA (n=339 oócitos): meio SOF e CLA, sem o SFB. Todos os blastocistos produzidos foram submetidos à vitrificação, pelo método de Open Pulled Straw. Quinze blastocistos de cada tratamento foram fixados para quantificação lipídica por coloração com Sudan Black B. Para avaliar a viabilidade embrionária, foi observada a capacidade de reexpansão e eclosão pós-aquecimento dos embriões (controle=27; SFB+CLA=30; CLA=17). Foram realizadas transferências em um ou dois embriões por receptora para avaliação da sobrevivência in vivo: T1 [receptoras que receberam um blastocisto (n=17 embriões, sendo controle=5, SFB+CLA=6 e CLA=6)]; T2 [receptoras que receberam dois blastocistos, (n= 54 embriões, sendo controle=18, SFB+CLA=14 e CLA=22)]. Não houve diferença nas taxas de clivagem (62,1%; 74,0%; 74,0% para controle; SFB+CLA; CLA, respectivamente), produção de blastocistos em relação aos clivados (59,7%; 47,7%; 38,3% para controle; SFB+CLA; CLA, respectivamente) e produção de blastocistos em relação ao total de oócitos (37,1%; 35,4%; 28,3% para controle; SFB+CLA; CLA, respectivamente) (P>0,05). Houve diminuição de gotículas lipídicas nos embriões cultivados em meio suplementado com CLA em relação aos embriões cultivados na presença do SFB e na ausência do CLA (P<0,05). A taxa de reexpansão foi maior no grupo controle (70,4%) em relação ao CLA (47,1%) e menor no grupo SFB+CLA (43,3%) (P<0,05). O CLA foi eficaz em reduzir a deposição de lipídeos intracitoplasmáticos nas células embrionárias, porém não houve diferença de viabilidade após a desvitrificação dos embriões.(AU)

The effect of adding conjugated linoleic acid (CLA) to the culture media on the viability after cryopreservation of F1 Holstein X Zebu embryos was evaluated. Three different culture media were tested: control (n = 340 oocytes): SOF medium and fetal bovine serum (FBS) without the CLA; FBS + CLA (n = 359 oocytes): SOF, FBS and CLA; CLA (n = 339 oocytes): SOF and CLA without the FBS. The produced blastocysts were subjected to vitrification, by the Open Pulled Straw method. Fifteen blastocysts per treatment were fixed for lipid quantification by staining with Sudan Black B. Embryo re-expansion and hatching capability were used to assess viability (control = 27; FBS + CLA = 30; CLA = 17). Transfers of one or two embryos to recipients were performed to evaluate in vivo survival: T1 [recipients that received one blastocyst (n=17 embryos, Control=5, FBS+CLA=6 and CLA=6)]; T2 [recipients that received two blastocysts (n =54 embryos, Control=18, FBS+CLA=14 and CLA=22)]. There was no difference in cleavage rate (62.1%; 74%; 74% for Control; FBS + CLA, CLA, respectively), blastocyst production in relation to the cleaved structures (59.7%; 47.7%; 38 3% for Control; FBS + CLA, CLA, respectively) and blastocyst production relative to the total oocytes (37.1%, 35.4%, 28.3% for Control; FBS + CLA, CLA, respectively) between treatments (P> 0.05). A reduction of lipid droplets was observed in embryos cultured in medium supplemented with CLA compared to embryos cultured in the FCS in the absence and presence of CLA (P <0.05). The reexpansion rate was higher in the Control group (70.4%) compared to the CLA (47.1%) and lowest for FBS+CLA (43.3%) (P<0.05). The hatching rates were similar among treatments, 42.1%; 23.1%; 25% for control; SFB + CLA; CLA respectively (P>0.05). Only one pregnancy was observed in early and confirmatory diagnosis, as the result of a Control group embryo transfer. Although embryos cultured with CLA have shown smaller intracytoplasmic lipid content, no difference was observed in viability following vitrification between treatments.(AU)

Efeito da adição do ácido linoleico conjugado no cultivo in vitro de embriões F1 Holandês x Zebu na sobrevivência pós-vitrificação / Effect of conjugated linoleic acid addition in in vitro culture medium in F1 Holstein X Zebu embryo survival post vitrification

Avaliou-se o efeito da adição do ácido linoleico conjugado (CLA) ao meio de cultivo in vitro na viabilidade pós-vitrificação de embriões F1 Holandês x Zebu. Foram utilizados três meios de cultivo: controle (n=340 oócitos): meio SOF e soro fetal bovino (SFB), sem o CLA; SFB+CLA (n=359 oócitos): meio SOF, SFB e CLA; CLA (n=339 oócitos): meio SOF e CLA, sem o SFB. Todos os blastocistos produzidos foram submetidos à vitrificação, pelo método de Open Pulled Straw. Quinze blastocistos de cada tratamento foram fixados para quantificação lipídica por coloração com Sudan Black B. Para avaliar a viabilidade embrionária, foi observada a capacidade de reexpansão e eclosão pós-aquecimento dos embriões (controle=27; SFB+CLA=30; CLA=17). Foram realizadas transferências em um ou dois embriões por receptora para avaliação da sobrevivência in vivo: T1 [receptoras que receberam um blastocisto (n=17 embriões, sendo controle=5, SFB+CLA=6 e CLA=6)]; T2 [receptoras que receberam dois blastocistos, (n= 54 embriões, sendo controle=18, SFB+CLA=14 e CLA=22)]. Não houve diferença nas taxas de clivagem (62,1%; 74,0%; 74,0% para controle; SFB+CLA; CLA, respectivamente), produção de blastocistos em relação aos clivados (59,7%; 47,7%; 38,3% para controle; SFB+CLA; CLA, respectivamente) e produção de blastocistos em relação ao total de oócitos (37,1%; 35,4%; 28,3% para controle; SFB+CLA; CLA, respectivamente) (P>0,05). Houve diminuição de gotículas lipídicas nos embriões cultivados em meio suplementado com CLA em relação aos embriões cultivados na presença do SFB e na ausência do CLA (P<0,05). A taxa de reexpansão foi maior no grupo controle (70,4%) em relação ao CLA (47,1%) e menor no grupo SFB+CLA (43,3%) (P<0,05). O CLA foi eficaz em reduzir a deposição de lipídeos intracitoplasmáticos nas células embrionárias, porém não houve diferença de viabilidade após a desvitrificação dos embriões.(AU)

The effect of adding conjugated linoleic acid (CLA) to the culture media on the viability after cryopreservation of F1 Holstein X Zebu embryos was evaluated. Three different culture media were tested: control (n = 340 oocytes): SOF medium and fetal bovine serum (FBS) without the CLA; FBS + CLA (n = 359 oocytes): SOF, FBS and CLA; CLA (n = 339 oocytes): SOF and CLA without the FBS. The produced blastocysts were subjected to vitrification, by the Open Pulled Straw method. Fifteen blastocysts per treatment were fixed for lipid quantification by staining with Sudan Black B. Embryo re-expansion and hatching capability were used to assess viability (control = 27; FBS + CLA = 30; CLA = 17). Transfers of one or two embryos to recipients were performed to evaluate in vivo survival: T1 [recipients that received one blastocyst (n=17 embryos, Control=5, FBS+CLA=6 and CLA=6)]; T2 [recipients that received two blastocysts (n =54 embryos, Control=18, FBS+CLA=14 and CLA=22)]. There was no difference in cleavage rate (62.1%; 74%; 74% for Control; FBS + CLA, CLA, respectively), blastocyst production in relation to the cleaved structures (59.7%; 47.7%; 38 3% for Control; FBS + CLA, CLA, respectively) and blastocyst production relative to the total oocytes (37.1%, 35.4%, 28.3% for Control; FBS + CLA, CLA, respectively) between treatments (P> 0.05). A reduction of lipid droplets was observed in embryos cultured in medium supplemented with CLA compared to embryos cultured in the FCS in the absence and presence of CLA (P <0.05). The reexpansion rate was higher in the Control group (70.4%) compared to the CLA (47.1%) and lowest for FBS+CLA (43.3%) (P<0.05). The hatching rates were similar among treatments, 42.1%; 23.1%; 25% for control; SFB + CLA; CLA respectively (P>0.05). Only one pregnancy was observed in early and confirmatory diagnosis, as the result of a Control group embryo transfer. Although embryos cultured with CLA have shown smaller intracytoplasmic lipid content, no difference was observed in viability following vitrification between treatments.(AU)

Supplementing alfa-Linolenic acid in the in vitro maturation media improves nuclear maturation rate of oocytes and early embryonic development in the Nili Ravi buffalo

The present study was conducted to investigate the effect of omega-3 poly unsaturated fatty acid (PUFA), α-linolenic acid (ALA; 18:3 n-3) on the in vitro maturation (IVM) of buffalo oocytes and subsequent embryonic development. Buffalo cumulus oocyte complexes (COCs; n = 2282) were in vitro matured in TCM-199 (0.6% fatty acid free bovine serum albumin, 0.02 Units/ml FSH, 1 µg/ml 17-β-estradiol, 10 µg/ml epidermal growth factor, 50 µg/ml gentamicin) supplemented with 0 (control), 25, 50, 100, 150 or 300 µm ALA under an atmosphere of 5% CO2 in air at 38.5ºC for 22-24 h. The matured oocytes were then fertilized in Tyrode’s Albumin Lactate Pyruvate (TALP) medium and cultured in synthetic oviductal fluid (SOF) medium. Concentrations up to 100 μm ALA improves (P ≤ 0.05) the cumulus expansion compared to control. Higher percentage of oocytes reaching MII stage was observed at 50 μm and 100 μm of ALA compared to control (P ≤ 0.05). Concentrations of 150 and 300 µm ALA were detrimental both for cumulus expansion and nuclear maturation rate of buffalo oocytes. Moreover, supplementation with 100 μm ALA improved (P ≤ 0.05) cleavage rate compared to control and treatment with 50 and 100 μm ALA yielded significantly higher morulae compared to control. The results of present study indicate that the supplementation with 100 μm ALA to the IVM medium improves nuclear maturation rate of buffalo oocytes and subsequent early embryonic development.

Supplementing alfa-Linolenic acid in the in vitro maturation media improves nuclear maturation rate of oocytes and early embryonic development in the Nili Ravi buffalo

The present study was conducted to investigate the effect of omega-3 poly unsaturated fatty acid (PUFA), α-linolenic acid (ALA; 18:3 n-3) on the in vitro maturation (IVM) of buffalo oocytes and subsequent embryonic development. Buffalo cumulus oocyte complexes (COCs; n = 2282) were in vitro matured in TCM-199 (0.6% fatty acid free bovine serum albumin, 0.02 Units/ml FSH, 1 µg/ml 17-β-estradiol, 10 µg/ml epidermal growth factor, 50 µg/ml gentamicin) supplemented with 0 (control), 25, 50, 100, 150 or 300 µm ALA under an atmosphere of 5% CO2 in air at 38.5ºC for 22-24 h. The matured oocytes were then fertilized in Tyrodes Albumin Lactate Pyruvate (TALP) medium and cultured in synthetic oviductal fluid (SOF) medium. Concentrations up to 100 μm ALA improves (P ≤ 0.05) the cumulus expansion compared to control. Higher percentage of oocytes reaching MII stage was observed at 50 μm and 100 μm of ALA compared to control (P ≤ 0.05). Concentrations of 150 and 300 µm ALA were detrimental both for cumulus expansion and nuclear maturation rate of buffalo oocytes. Moreover, supplementation with 100 μm ALA improved (P ≤ 0.05) cleavage rate compared to control and treatment with 50 and 100 μm ALA yielded significantly higher morulae compared to control. The results of present study indicate that the supplementation with 100 μm ALA to the IVM medium improves nuclear maturation rate of buffalo oocytes and subsequent early embryonic development.(AU)

Avaliação do desenvolvimento in vitro de embriões bovinos após exposição à crotamina linear / Evaluation of bovine embryo in vitro development after exposure to linear crotamine

The present study investigated the effects of different concentrations of linear crotamine (CrL), used asagent for cell transfection, on in vitro development of bovine embryos. Embryos were exposed to 0; 5 and 12.5µM of CrL in Synthetic Oviductal Fluid (SOF) for 6 h. Vehicle solution was NaCl 150 mM and not exposedembryos (in vitro fertilized-IVF group) was included. In vitro developmental competence was evaluated bycleavage (day 2), blastocyst (day 7 and 8), and hatching (day 8) rates. No difference (P > 0.05) was observedamong CrL groups and control group (IVF) for all observed parameters. In conclusion, the use of the tested CrLconcentrations for 6 h during in vitro culture of bovine embryos have no deleterious effects on embryodevelopment.

Avaliação do desenvolvimento in vitro de embriões bovinos após exposição à crotamina linear / Evaluation of bovine embryo in vitro development after exposure to linear crotamine

The present study investigated the effects of different concentrations of linear crotamine (CrL), used asagent for cell transfection, on in vitro development of bovine embryos. Embryos were exposed to 0; 5 and 12.5µM of CrL in Synthetic Oviductal Fluid (SOF) for 6 h. Vehicle solution was NaCl 150 mM and not exposedembryos (in vitro fertilized-IVF group) was included. In vitro developmental competence was evaluated bycleavage (day 2), blastocyst (day 7 and 8), and hatching (day 8) rates. No difference (P > 0.05) was observedamong CrL groups and control group (IVF) for all observed parameters. In conclusion, the use of the tested CrLconcentrations for 6 h during in vitro culture of bovine embryos have no deleterious effects on embryodevelopment.(AU)

Larval development of Spodoptera eridania and Spodoptera frugiperda fed on fresh ear of field corn expressing the Bt proteins (Cry1F and Cry1F + Cry1A.105 + Cry2Ab2) / Desenvolvimento larval de Spodoptera eridania e Spodoptera frugiperda alimentadas com espigas de milho verde expressando proteínas Bt (Cry1F e Cry1F + Cry1A.105 + Cry2Ab2)

The objective of this study was to evaluate extent of larval period, larval survival (%), food consumption, and pupal biomass of Spodoptera eridania and Spodoptera frugiperda (Lepidoptera: Noctuidae ) fed on fresh ears of field corn expressing Bt proteins (Cry1F and Cry1F+Cry1A.105+Cry2Ab2). Larvae of Spodoptera spp. survived less than two days when they consumed Bt corncobs and showed 100% mortality. Spodoptera eridania reared on non-Bt corn cobs showed higher larval development (21.6 days) than S. frugiperda (18.4 days) and lower viability (56.4% and 80.2% for S. eridania and S. frugiperda , respectively). A higher amount of corn grains was consumed by S. eridania (5.4g) than by S. frugiperda (3.9g). In summary, this study demonstrated that the toxins Cry1F and Cry1F + Cry1A.105 + Cry2Ab2 expressed in fresh corn cobs contributed to protect ears of corn against S. frugiperda and the non-target pest S. eridania . However, itis important to monitor non-Bt cornfields because of the potential of both species to cause damage to ear sof corn.(AU)

Este estudo teve como objetivo avaliar o período de desenvolvimento larval, sobrevivência larval (%), consumo de alimento e biomassa pupalde Spodoptera eridania e Spodoptera frugiperda (Lepidoptera: Noctuidae ), alimentadas com grãos verdes de milho Bt que expressam as proteínas Cry1F e Cry1F + Cry1A.105 + Cry2Ab2). As larvas de Spodoptera spp. alimentadas com milho Bt sobreviveram por até dois dias, registrando-se 100% de mortalidade. A espécie S. eridania alimentada com grãos de milho não Bt apresentou um maior desenvolvimento larval (21,6 dias) do que S. frugiperda (18,4 dias), e menor viabilidade larval (56,4% e 80,2% para S. eridania e S. frugiperda respectivamente). Uma maior taxa de consumo de grãos foi observada para S. eridania (5,4g) do que para S. frugiperda (3,9g). Em síntese, este estudo comprova que as toxinas Cry1F e Cry1F + Cry1A.105 Cry2Ab2 expressas em grãos imaturos de milho contribuem na proteção das espigas de milho contra S. frugiperda e a praga não-alvo S. eridania , entretanto, é importante monitorar as lavouras cultivadas com milho não Bt, devido o potencial de ambas as espécies em ocasionar danos nas espigas da planta.(AU)

USO DO PEPTÍDEO Ctn[1-9], DERIVADO DA TOXINA CROTALICIDINA, NA ATIVAÇÃO DE OÓCITOS BOVINOS

Em mamíferos, o influxo do cálcio é fator primordial para a ativação oocitária após ovulação de um oócito maturado e com competência ao desenvolvimento. Biotecnologias da reprodução, como a injeção intracitoplasmática de espermatozoide e tranferência nuclear de células somáticas necessitam da ativação oocitária artificial para dar continuidade ao desenvolvimento embrionário. Os estudos com as catelicidinas, presentes no veneno de cascavéis, mostraram propriedades antimicrobianas, antitumorais e antifúngicas. Além disso, o peptídeo sintético de crotalicidina (Ctn1-9), uma vipericidina relacionado à família das catelicidinas, possui capacidade de promover influxo de cálcio em células cancerígenas. Portanto, este trabalho teve como objetivo avaliar o efeito do (Ctn1-9), ligado covalentemente com a Rodamina B (RhoB-Ctn1-9), na ativação oocitária e no posterior desenvolvimento de embriões bovinos produzidos por partenogênese. Ovários bovinos foram colhidos em abatedouro local e foram puncionados os folículos medindo entre 2-8 mm. Os complexos cumulus-oócito obtidos (n = 1599) foram submetidos à maturação in vitro por 26 h e então divididos (n= 1178) nos diferentes grupos experimentais: Ctn1-9 (0, 1, 10 e 40 M) e grupo controle (ionomicina 5 M), com tempo de exposição de 4 min em todos os grupos. Posteriormente, os oócitos foram incubados por 4 h com 6-DMAP em meio SOF, seguido de cultivo in vitro em meio SOF por sete dias. A análise estatística foi realizada utilizando o software Minitab. Os dados são apresentados como porcentagem e comparados através do teste exato de Fisher. Os resultados foram considerados significativos quando P < 0,05. No dia dois de cultivo, em relação à taxa de clivagem, não houve diferença estatística (P > 0,05) entre as concentrações 1 M (19,6%), 10 M (22,4%) e 40 M (14,7%), entretanto o grupo 1 M e 10 M foram significativamente maiores (P < 0,05) do que o grupo 0 M (8,4%). Para a taxa de formação de blastocisto, grupos 0 M (0,6%), 10 M (1,8%) e 40 M (2,2%) não demonstraram diferença significativa (P > 0,05) entre eles, porém o grupo 40 M foi significativamente maior (P < 0,05) do que o grupo 1 M (0%). Em conclusão, o RhoB-Ctn[1-9] demonstrou ser capaz de induzir a clivagem em oócitos bovinos. Além disso, a ativação e o desenvolvimento até o estádio de blastocisto mostram pouca ou nenhuma toxicidade deste peptídeo como agente ativador de oócitos bovinos.

In mammals, calcium influx is critical to oocyte activation post-ovulation of a matured oocyte with competence to development. Reproductive biotechnologies such as intracytoplasmic sperm injection and somatic cell nuclear transfer necessarily use artificial oocyte activation to continue embryo development. The studies on cathelicidins, present in pit rattlesnake venom, showed antimicrobial, antitumor and antifungal properties. In addition, the synthetic peptide from crotalicidin (Ctn1-9), a vipericidin related to the cathelicidin family, has the capacity to promote calcium influx in cancer cells. Thus, the aim of this study was to evaluate the effect of Ctn[1-9], covalently conjugated with Rhodamine B (RhoB-Ctn1-9), on oocyte activation and development of bovine embryos produced by parthenogenesis. Bovine ovaries were collected in local abattoir and follicles measuring 2-8 mm were punctured. Cumulus-oocyte complexes (n = 1599) were subjected to in vitro maturation for 26 h and then divided (n= 1178) to different experimental groups: Ctn1-9 (0; 1; 10 and 40 M) and control group (ionomycin 5 M), with 4 min exposure time for all groups. Then, oocytes were incubated for 4 h in 6-DMAP in SOF medium and followed for in vitro culture in SOF medium for seven days. Statistical analysis were performed using Minitab software. Data are shown as percentage and compared by Fishers exact test. Results were significant when P < 0.05. In day two of culture, concerning cleavage rate, there was no statistical difference (P > 0.05) between concentration 1 M (19.6%), 10 M (22.4%) and 40 M (14.7%), however group 1 M and 10 M were significantly higher (P < 0.05) than group 0 M (8.4%). For the blastocyst formation rate, groups with 0 M (0.6%), 10 M (1.8%) and 40 M (2.2%) showed no significant difference (P > 0.05) among them, yet group 40 M was significantly higher (P < 0.05) than group 1 M (0%). In conclusion, RhoB-Ctn[1-9] showed to be able to induced cleavage in bovine oocytes. In addition, the activation and development to the blastocyst stage show little or no toxicity of this peptide as an activating agent for bovine oocytes.

PERFIL DE EXPRESSÃO DE GENES ASSOCIADOS À QUALIDADE E IMPLANTAÇÃO DE EMBRIÕES OVINOS CRIOPRESERVADOS POR DIFERENTES TÉCNICAS

A transferência de embriões frescos resulta em maior taxa de gestação comparada à transferência de embriões criopreservados, sugerindo comprometimento do estabelecimento da gestação após criopreservação. Este estudo objetivou avaliar o efeito da técnica de criopreservação (vitrificação ou congelação lenta) de embriões ovinos produzidos in vivo, na taxa de sobrevivência e perfil de expressão de genes relacionados à apoptose (BAX, BCL2), proliferação e diferenciação celular (TGFB1), respiração celular (NFR1), manutenção da pluripotência (NANOG) e implantação (CDX2). Trinta e duas ovelhas foram submetidas à superovulação e posterior coleta de embriões. Os embriões obtidos foram classificados quanto ao estágio de desenvolvimento e qualidade. Os embriões GI e GII foram uniformemente distribuídos dentro dos grupos experimentais: CONT) blastocistos frescos (n=15); CONG) congelação lenta (n=42); ou VIT) vitrificação (n=43). Os embriões CONT foram congelados a seco em três pools de cinco embriões, para posterior RT-qPCR. Os embriões CONG e VIT após descongelamento/aquecimento, respectivamente, foram alocados para análise de expressão gênica ou cultivo in vitro (24 e 48 h) em meio SOF com aminoácidos suplementado com 2,5% soro fetal bovino, a 38,5 °C e 5% CO2 (CONG: n=27; VIT: n=28). As taxas de sobrevivência de CONG e VIT foram, respectivamente, 29,6% (8/27) e 14,2% (4/28) em 24 h; e 48,1% (13/27) e 32,1% (9/28) em 48 h (P > 0,05). Independentemente da técnica de criopreservação, o gene CDX2 foi super expresso (P < 0,05) quando comparado ao CONT. A expressão dos genes BAX, BCL2, TGFB1 e CDX2 foi aumentada no grupo VIT (P < 0,05) quando comparados ao CONT. Contudo, quando as duas técnicas de criopreservação foram comparadas, apenas o gene BAX foi super expresso (P < 0,05) no VIT, em comparação com o CONG. Esses dados sugerem que o decréscimo de 16% (não-significativo) na taxa de sobrevivência, observado no grupo VIT, pode estar associado ao aumento na expressão do gene pró-apoptótico (BAX). Em conclusão, a técnica de vitrificação levou a um decréscimo de 16% (não significativo) na taxa de sobrevivência do embrião e aumento do gene pró-apoptótico.

Transfer of fresh sheep embryos have a higher pregnancy rate compared to cryopreserved embryos, suggesting that cryopreservation compromises embryonic signaling during implantation and establishment of pregnancy. This mechanism needs to be more clarified. Thus, this study aimed to evaluate the effect of the cryopreservation technique (vitrification or slow freezing) of sheep embryos produced in vivo on embryo survival rate and expression of genes related to apoptosis (BAX and BCL2), cellular differentiation and proliferation (TGFB1), cellular respiration (NFR1), maintenance of pluripotency (NANOG) and implantation (CDX2). Superovulation (n=32 ewes) was performed and embryos were transcervically collected. A total of 100 GI/II embryos was randomly allocated into three groups: 1) fresh blastocysts (CONT; n=15); 2) slow freezing (SF; n=42); or 3) vitrification (VT; n=43). After thawing/warming, three pools of five embryos per group were used for RT-qPCR; and other embryos were cultured in vitro (24 and 48 h) in SOF with aminoacids and 2.5% of fetal bovine serum medium at 38.5 °C and 5% CO2 (SF: n=27; VT: n=28). Embryonic survival rate of SF and VT were, respectively, 29.6% (8/27) and 14.2% (4/28) at 24 h; and 48.1% (13/27) and 32.1% (9/28) at 48 h (P > 0.05). Only the CDX2 gene was affected (up-regulated, P < 0.05) in both groups compared to CONT. The BAX gene was up-regulated in VT, compared to SF group. The VT increased (P < 0.05) the expression of all genes associated with embryonic quality and implantation, except for NANOG and NRF1, when compared to the CONT. In conclusion, the VT technique led to a decrease of 16% (non-significant) in embryo survival rate and increased pro-apoptotic gene expression.

UTILIZAÇÃO DE PLASMA RICO EM PLAQUETAS NA PRODUÇÃO IN VITRO DE EMBRIÕES BOVINOS

Um dos aspectos relevantes a se considerar para o sucesso durante a produção in vitro (PIV) de embriões é a constituição dos meios que compõem as etapas da biotecnologia reprodutiva. Os meios precisam suprir as necessidades metabólicas tanto dos gametas, durante a maturação oocitária e capacitação espermática, quanto do embrião durante as primeiras divisões celulares. A maior parte dos protocolos de PIV utiliza algum soro sanguíneo na composição dos meios como fonte de hormônios, proteínas, fatores de crescimento e nutrientes. Por outro lado, o soro contém citocinas, vitaminas e muitas outras substâncias que podem afetar a maturação, a fertilização e o desenvolvimento embrionário. Diversos trabalhos vêm reportando a utilização de Plasma Rico em Plaquetas (PRP) como alternativa para utilização de soros fetais durante o cultivo de células, principalmente de células tronco. Outros estudos demonstraram que o PRP está repleto de fatores de crescimento, como FGF, TGF, PDGF, IGF e EGF, bem como fatores de ligação como fibrinogênio e serotonina, vitais para a cultura celular e foliculogênese. Portanto, este trabalho tem por objetivo avaliar a utilização de PRP em substituição ao soro fetal bovino (SFB) durante a maturação de oócitos utilizados na produção in vitro de embriões bovinos. Os complexos cúmulos-oócitos (CCOs) foram distribuídos nos seguintes grupos experimentais durante a maturação in vitro (MIV): Grupo G1 (Meio de MIV com adição de 5% de PRP); Grupo G2 (Meio de MIV com adição de 5% de PRP mais 5% de SFB); Grupo G3 (Meio de MIV com adição de 5% de SFB); e grupo G4 (Meio de MIV sem adição de PRP e/ou SFB); . Após 20 horas de maturação, os CCOs foram passados para a placa de fecundação contendo o meio TALP FERT livre de soros. Aproximadamente 24 horas após a fertilização, os prováveis zigotos foram transferidos para gotas com meio SOF (Synthetic fluid oviduct) contendo 10% de SFB. foram avaliadas as taxas de clivagem e formação de blastocistos nos dias 2 e 7, do desenvolvimento embrionário, respectivamente. Também foi avaliada a qualidade dos CCOs maturados a partir da análise de expressão gênica de alguns marcadores genéticos. Os resultados demonstraram que não houveram diferenças significativas em relação aos grupos experimentais no tocante a taxas de produção de embriões (tanto nas primeiras clivagens quanto na formação de blastocistos) evidenciando que o PRP pode se tornar uma alternativa mais barata na PIVE em comparação ao SFB.

One of the relevant aspects to be considered for success during the in vitro production (IVP) of embryos is the constitution of the means that make up the stages of reproductive biotechnology. The media must meet the metabolic needs of both gametes, during oocyte maturation and sperm formation, and of the embryo during the first cell divisions. Most IVP protocols use some blood serum in the composition of the media as a source of hormones, proteins, growth factors, and nutrients. On the other hand, the serum contains cytokines, vitamins and many other substances that can affect maturation, fertilization, and embryonic development. Several studies have reported the use of Platelet Rich Plasma (PRP) as an alternative to the use of fetal sera during cell culture, mainly stem cells. Other studies have shown that PRP is full of growth factors, such as FGF, TGF, PDGF, IGF, and EGF, as well as binding factors such as fibrinogen and serotonin, which are vital for cell culture and folliculogenesis. Therefore, this work aims to evaluate the use of PRP to replace fetal bovine serum (SFB) during the maturation of oocytes used in the in vitro production of bovine embryos. Cumulus-oocyte complexes (CCOs) were distributed in the following experimental groups during in vitro maturation (IVM): Group G1 (IVM medium with addition of 5% PRP); Group G2 (MIV medium with addition of 5% PRP plus 5% SFB); Group G3 (MIV medium with addition of 5% SFB); and group G4 (MIV medium without addition of PRP and/or SFB). After 20 hours of maturation, the CCOs were passed to the fertilization plate containing the serum-free TALP FERT medium. Approximately 24 hours after fertilization, the probable zygotes were transferred to drops with SOF (Synthetic fluid oviduct) medium containing 10% SFB. the rates of cleavage and blastocyst formation were evaluated on days 2 and 7, of embryonic development, respectively. The quality of matured CCOs was also evaluated from the analysis of gene expression of some genetic markers. The results demonstrated that there were no significant differences in relation to the experimental groups regarding embryo production rates (both in the first cleavages and in the formation of blastocysts), showing that PRP can become a cheaper alternative in PIVE compared to SFB

Associação entre o óleo de soja e o óleo de peixe na dieta de cabras em lactação como estratégia para melhorar o perfil de ácidos graxos do leite / Association between soybean oil and fish oil in the diet of lactating goats as a strategy to improve milk fatty acids profile

Os objetivos neste experimento foram avaliar os efeitos da associação entre o óleo de soja e o óleo de peixe na dieta de cabras em lactação sobre o consumo de matéria seca e de nutrientes, a variação do peso corporal, a produção e composição do leite, assim como o perfil de ácidos graxos. As cabras foram alocadas em baias individuais, onde receberam dieta composta por 50% de feno de "coastcross" e 50% de concentrado. Foram utilizadas nove cabras mestiças Boer x Saanen multíparas, distribuídas em três quadrados latinos 3 X 3. O experimento teve duração de 51 dias, divididos em três períodos de 17 dias, sendo os 13 primeiros dias para adaptação dos animais às dietas e os 4 dias subsequentes para colheita de amostras e de dados. Os tratamentos experimentais foram: a) dieta controle (CT), sem adição de óleo; b) dieta contendo 3% de óleo de soja (OS); e c) dieta contendo 2,5% de óleo de soja + 0,5% de óleo de peixe (OS+P). A inclusão dos óleos reduziu (P<0,05) o consumo de matéria seca, no entanto aumentou (P<0,05) a eficiência alimentar dos animais, sem afetar (P>0,05) a produção de leite. Houve efeito (P<0,05) da dieta no perfil de ácidos graxos do leite, sendo que ambos os tratamentos com adição de óleo elevaram as concentrações de ácidos graxos de cadeia média e longa, reduzindo os de cadeia curta. O tratamento com a combinação do óleo de soja com o óleo de peixe foi o que promoveu os maiores aumentos na concentração de ácido vacênico (398%), rumênico (352%) e de CLA total (341%) no leite. Os resultados permitem concluir que a suplementação lipídica elevou a eficiência alimentar dos animais e que o fornecimento de óleo de soja em combinação ao óleo de peixe aumentou a concentração no leite dos ácidos graxos benéficos à saúde humana.(AU)

The aims in this experiment were to determine the effects of the association between soybean and fish oils on dry matter intake (DMI) and nutrient intake, body weight change, milk production and composition and milk fatty acid profile of dairy goats. The animals were housed in tie stalls and fed a 50% of coastcross hay and 50% concentrate diet. Nine multiparous crossbred Boer x Saanen goats were assigned in tree 3 X 3 Latin Squares. The experimental period lasted 51 days; divided into three periods of 17 days, being the first nine days used to adapt goats to diets and the 4 other days for data collection. Experimental diets were: a) control diet (CT) without oil; b) control diet supplemented with 3% of soybean oil (SO); and c) control diet supplemented with 2.5% of soybean oil plus 0.5% of fish oil (SO+F). DMI was negatively influenced by oil addition. However, feed efficiency was higher in diets with oils, maintaining similar milk production (P>0.05 for all comparisons). The supply of oils changed milk fatty acids profile (P<0.05), increasing the concentrations of medium and long-chain fatty acids and reducing short-chain. Milk from goats fed the SO+F diet had higher concentration of vaccenic (398%), rumenic acid (352%) and total CLA (341%). The results indicate that the oil supply increased the feed efficiency of goats, and that the combination of soybean and fish oils caused a higher elevation of fatty acids considered to have health benefits.(AU)

AVALIAÇÃO DO USO DE SOF (FLUIDO DE OVIDUTO SINTÉTICO) E CLA (ÁCIDO LINOLEICO CONJUGADO) NA EXPRESSÃO GÊNICA DE GENES RELACIONADOS AO METABOLISMO LIPÍDICO E MATURAÇÃO OOCITÁRIA EM COCs (COMPLEXOS CUMULUS-OÓCITO) BOVINOS

Visando o desenvolvimento de um meio capaz de suportar todas as etapas da produção in vitro de embriões bovinos, o objetivo desse estudo foi investigar se a utilização de fluido de oviduto sintético (SOF) acrescido ou não de ácido linoleico conjugado (CLA) durante a maturação in vitro de oócitos bovinos altera a abundância de transcritos ligados ao metabolismo lipídico e maturação oocitária. Os complexos cumulus-oócito (COCs) foram aspirados de ovários obtidos em abatedouro e maturados em quatro grupos: M199 (Medium 199), M199+CLA (M199 com 100 µM de CLA), SOF e SOF+CLA (SOF com 100 µM de CLA). A abundância relativa de RNAm de oócitos e células do cumulus foi avaliada após a maturação. As amostras de RNA total foram tratadas com DNAse antes de serem submetidas ao protocolo de transcrição reversa. Foram realizadas análises de RT-qPCR dos genes FADS2 (fatty acid desaturase 2), SCD1 (stearoyl-CoA desaturase 1), SREBP1 (sterol regulatory element binding transcription factor 1), GREM1 (gremlin 1), AREG (amphiregulin) e COX2 (cyclooxygenase 2). O Gene PPIA (peptidylprolyl isomerase A) foi utilizado como referência e o método Ct com correção de eficiência foi usado para calcular os valores de expressão relativa (genes alvo/PPIA) para cada gene alvo usando uma amostra de controle como calibrador. As amostras foram distribuídas em delineamento inteiramente casualizado em esquema fatorial 2x2, totalizando 4 tratamentos, com 5 repetições. Os dados foram submetidos a análise de variância e em caso de diferença significativa (p<0,05) as médias foram comparadas pelo teste de Tukey a 5% de significância. COCs maturados com SOF apresentam maior abundância relativa de RNAm dos marcadores qualidade GREM1 (p=0,0065) e COX2 (p=0,0040) em oócitos e GREM1 (p=0,0004) em células do cumulus. O meio SOF também proporciona maior abundância relativa de FADS2 (p=0,0001), essencial para o metabolismo lipídico, em oócitos. Adicionalmente, oócitos maturados com SOF apresentam menor abundância relativa de SCD1 sem influência da adição de CLA. Em contrapartida, a abundância relativa de SCD1 é reduzida no meio M199 com a utilização de CLA. Concluímos que o meio SOF proporciona maior abundância de marcadores de qualidade em oócitos independentemente da adição de CLA.

Evaluation of the use of SOF (Synthetic Ovidute Fluid) and CLA (Conjugated Linoleic Acid) in the gene expression of genes related to lipid metabolism and oocyte maturation in bovine COCs (Cumulus-Oocyte Complexes) In order to develop a medium capable of supporting all stages of in vitro production of bovine embryos, the aim of this study was to investigate whether the use of synthetic oviduct fluid (SOF) with or without conjugated linoleic acid (CLA) during in vitro maturation of bovine oocytes changes the abundance of transcripts linked to lipid metabolism and oocyte maturation. Cumulus-oocyte complexes (COCs) were aspirated from slaughtered ovaries and matured into four groups: M199 (Medium 199), M199+CLA (M199 with 100 µM CLA), SOF and SOF+CLA (SOF with 100 µM CLA). The relative abundance of oocytes and cumulus cells mRNA was evaluated after maturation. Total mRNA samples were treated with DNAse before being subjected to the reverse transcription protocol. RT-qPCR analyzes of the FADS2 (fatty acid desaturase 2), SCD1 (stearoyl-CoA desaturase 1), SREBP1 (sterol regulatory element binding transcription factor 1), GREM1 (gremlin 1), AREG (amphiregulin) and COX2 (cyclooxygenase 2) genes were performed. The gene PPIA (peptidylprolyl isomerase A) was used as reference and the Ct method with efficiency correction was used to calculate the relative expression values (target genes/PPIA) for each target gene using a control sample and calibrator. The samples were distributed in a completely randomized design in a 2x2 factorial scheme, totaling 4 treatments with 5 replications. Data were subjected to analysis of variance and in case of significant difference (p<0.05) the means were compared by Tukey test at 5% significance. The use of the SOF medium in the maturation of bovine COCs results in higher relative mRNA abundance of quality markers GREM1 (p=0.0065) and COX2 (p=0.0040) in oocytes and GREM1 (p=0.0004) in cumulus cells. In addition, the SOF medium provides higher relative abundance of FADS2 (p=0.0001), essential for lipid metabolism, in oocytes. Additionally, oocytes matured in SOF medium show lower relative abundance of SCD1 without influence of CLA addition. In contrast, the relative abundance of SCD1 is reduced in M199 medium using CLA. We conclude that the SOF medium provides greater abundance of oocyte quality markers regardless of the addition of CLA.