Elevada frequência de Aeromonas spp. e genes de virulência em cultivos de tilápia-do-nilo (Oreochromis niloticus) em tanques-rede, na região semiárida de Pernambuco, Brasil / High frequency of Aeromonas spp. and virulence genes in Nile Tilapia farms (Oreochromis niloticus) in semi-arid regions of Pernambuco, Brazil

Objetivou-se avaliar a ocorrência de Aeromonas spp. em peixes e amostras de água na região semiárida de Pernambuco e avaliar a frequência de aerolissina (aerA), enterotoxina citotóxica (act), enterotoxina citotônica (alt) e serina protease (ahp) nesses isolados. Foram analisados 70 peixes vivos e oito mortos com sinais clínicos de aeromoniose e 16 amostras de água. Aeromonas spp. foram identificadas por análises microbiológicas (provas bioquímicas) e molecular, usando-se primers específicos para a região 16S rRNA, e a distribuição dos quatro fatores de virulência (aerA, alt, act e ahp) foi investigada por ensaio de PCR. Cento e cinquenta e cinco (84,7%) isolados foram confirmados como Aeromonas spp. na análise molecular. Os genes de virulência mais frequentes foram act (53,55%) e aerA (51,61%). De acordo com o tipo de amostra, observou-se maior frequência do gene aerA (87,5% P=0,0474) em isolados de peixes mortos e a menor frequência do gene act (47,73% P=0,0002) em peixes vivos. Este estudo demonstrou a presença de aeromoniose no cultivo de tilápias em tanques-rede, nos municípios de Jatobá e Petrolândia, na região semiárida de Pernambuco. A detecção de aerA, act e alt pode ser utilizada na tipagem de virulência de Aeromonas spp.(AU)

The purpose of this study was to evaluate the occurrence of Aeromonas spp. from fishes and tilapia net-cage farm water in semi-arid regions of Pernambuco and to evaluate the frequency of the aerolysin (aerA), cytotoxic enterotoxin (act), cytotonic enterotoxin (alt) and serine protease (ahp) genes in Aeromonas isolates. 70 live and eight dead fish with aeromoniosis clinical signs and 16 water samples were analyzed. Aeromonas spp. isolated were identified by microbiological (biochemical evidence) and molecular analysis using specific primers for 16SrRNA region, while the distribution of four virulence factors, including aerA, alt, act and ahp, was investigated by PCR assay. One hundred fifty-five (84.7%) isolates were confirmed as Aeromonas spp. by molecular analysis. The most frequent virulence genes in isolates were act (53.55%) and aerA (51,61%). According to the kind of sample, the higher frequency of aerA gene (87.5% P= 0.0474) was observed in isolates from dead fish and the lowest frequency of act gene (47.73% P= 0.0002) from live fish. This study found the presence of aeromoniosis on tilapia farming in net-cages on Jatobá and Petrolândia counties in the semiarid Pernambuco region. The detection of aerA, act and alt can be used for virulence typing of Aeromonas spp. isolates.(AU)

Elevada frequência de Aeromonas spp. e genes de virulência em cultivos de tilápia-do-nilo (Oreochromis niloticus) em tanques-rede, na região semiárida de Pernambuco, Brasil / High frequency of Aeromonas spp. and virulence genes in Nile Tilapia farms (Oreochromis niloticus) in semi-arid regions of Pernambuco, Brazil

Objetivou-se avaliar a ocorrência de Aeromonas spp. em peixes e amostras de água na região semiárida de Pernambuco e avaliar a frequência de aerolissina (aerA), enterotoxina citotóxica (act), enterotoxina citotônica (alt) e serina protease (ahp) nesses isolados. Foram analisados 70 peixes vivos e oito mortos com sinais clínicos de aeromoniose e 16 amostras de água. Aeromonas spp. foram identificadas por análises microbiológicas (provas bioquímicas) e molecular, usando-se primers específicos para a região 16S rRNA, e a distribuição dos quatro fatores de virulência (aerA, alt, act e ahp) foi investigada por ensaio de PCR. Cento e cinquenta e cinco (84,7%) isolados foram confirmados como Aeromonas spp. na análise molecular. Os genes de virulência mais frequentes foram act (53,55%) e aerA (51,61%). De acordo com o tipo de amostra, observou-se maior frequência do gene aerA (87,5% P=0,0474) em isolados de peixes mortos e a menor frequência do gene act (47,73% P=0,0002) em peixes vivos. Este estudo demonstrou a presença de aeromoniose no cultivo de tilápias em tanques-rede, nos municípios de Jatobá e Petrolândia, na região semiárida de Pernambuco. A detecção de aerA, act e alt pode ser utilizada na tipagem de virulência de Aeromonas spp.(AU)

The purpose of this study was to evaluate the occurrence of Aeromonas spp. from fishes and tilapia net-cage farm water in semi-arid regions of Pernambuco and to evaluate the frequency of the aerolysin (aerA), cytotoxic enterotoxin (act), cytotonic enterotoxin (alt) and serine protease (ahp) genes in Aeromonas isolates. 70 live and eight dead fish with aeromoniosis clinical signs and 16 water samples were analyzed. Aeromonas spp. isolated were identified by microbiological (biochemical evidence) and molecular analysis using specific primers for 16SrRNA region, while the distribution of four virulence factors, including aerA, alt, act and ahp, was investigated by PCR assay. One hundred fifty-five (84.7%) isolates were confirmed as Aeromonas spp. by molecular analysis. The most frequent virulence genes in isolates were act (53.55%) and aerA (51,61%). According to the kind of sample, the higher frequency of aerA gene (87.5% P= 0.0474) was observed in isolates from dead fish and the lowest frequency of act gene (47.73% P= 0.0002) from live fish. This study found the presence of aeromoniosis on tilapia farming in net-cages on Jatobá and Petrolândia counties in the semiarid Pernambuco region. The detection of aerA, act and alt can be used for virulence typing of Aeromonas spp. isolates.(AU)

Detecção de Aeromonas spp. e do gene de virulência aerolisina em tilápias do Nilo (Oreochromis niloticus) com a técnica de mPCR / Detection of Aeromonas spp. and virulence gene aerolysin in Nile tilapia (Oreochromis niloticus) using PCR technique

As infecções causadas por bactérias do gênero Aeromonas estão entre as doenças mais comuns em peixes cultivados em todo o mundo, com ocorrência de aeromoniose em todos os países que possuem cultivo de tilápia do Nilo (Oreochromis niloticus). O presente trabalho descreve o desenvolvimento de uma nova multiplex PCR (mPCR) para diagnóstico de Aeromonas spp. e identificação do gene aerolisina (aerA). Para padronização da mPCR foram utilizadas cepas de referência de várias espécies do gênero Aeromonas e de outros gêneros. Também foram usadas cepas de campo de A. hydrophila oriundas de cultivos de peixes pacamãs (Lophiosilurus alexandri) e Aeromonas spp. de tilápias do Nilo. Os primers foram desenhados com base na região 16S rRNA e aerA. Para verificar a melhor temperatura de anelamento foram utilizados gradientes entre 59°C a 61°C com 40ng de DNA molde. Os produtos da amplificação da região 16S rRNA e do gene aerA apresentaram 786 e 550pb, respectivamente. A mPCR apresentou melhor temperatura de anelamento a 57,6°C com limite de detecção das concentrações de DNA em ambos genes (16S rRNA and aerA) de 10-10g/μL. A mPCR padronizada é rápida, sensível e específica no diagnóstico de Aeromonas spp. e identificação do gene aerolisina. Esta metodologia apresenta vantagens quando comparada aos métodos de diagnóstico convencionais, podendo ser utilizada em cultivos comerciais de tilápias do Nilo ou outros peixes. A identificação do gene aerolisina é uma importante ferramenta na determinação do potencial patogênico dos isolados de Aeromonas spp. estudados.(AU)

Infections caused by bacteria of the genus Aeromonas are among the most common diseases in fish farming systems worldwide, and this disease occurs in all countries which have Nile tilapia (Oreochromis niloticus) farmed. The present work describes the development of a new multiplex PCR (mPCR) technique that diagnosis the genus Aeromonas and detects aerolysin gene (aerA). Reference strains of several Aeromonas species and other genera were used for standardization of mPCR. Strains of A. hydrophila from "pacaman" fish (Lophiosilurus alexandri) and Aeromonas spp. from Nile tilapia from farming systems were used too. Primers were designed based on the 16S rRNA region and aerA (aerolysin toxin). To verify a better annealing temperature were used gradients between 59°C and 61°C with 40ng of the DNA template. The 16S rRNA gene and the aerA gene amplification products showed 786 and 550 bp, respectively. The mPCR showed better annealing temperature at 57.6°C, and the detection limit for both genes (16S rRNA and aerA) was 10-10g/μL of the DNA. The standardized mPCR is quick, sensitive, and specific for Aeromonas spp. diagnosis and to detect aerolysin gene. This method showed advantages when compared to the conventional diagnostic methods and can be used in Nile tilapia or other fish farming systems. The detection of aerolysin gene is an important tool to determine the potential pathogenicity of Aeromonas spp. isolates.(AU)

Detecção de Aeromonas spp. e do gene de virulência aerolisina em tilápias do Nilo (Oreochromis niloticus) com a técnica de mPCR / Detection of Aeromonas spp. and virulence gene aerolysin in Nile tilapia (Oreochromis niloticus) using PCR technique

As infecções causadas por bactérias do gênero Aeromonas estão entre as doenças mais comuns em peixes cultivados em todo o mundo, com ocorrência de aeromoniose em todos os países que possuem cultivo de tilápia do Nilo (Oreochromis niloticus). O presente trabalho descreve o desenvolvimento de uma nova multiplex PCR (mPCR) para diagnóstico de Aeromonas spp. e identificação do gene aerolisina (aerA). Para padronização da mPCR foram utilizadas cepas de referência de várias espécies do gênero Aeromonas e de outros gêneros. Também foram usadas cepas de campo de A. hydrophila oriundas de cultivos de peixes pacamãs (Lophiosilurus alexandri) e Aeromonas spp. de tilápias do Nilo. Os primers foram desenhados com base na região 16S rRNA e aerA. Para verificar a melhor temperatura de anelamento foram utilizados gradientes entre 59°C a 61°C com 40ng de DNA molde. Os produtos da amplificação da região 16S rRNA e do gene aerA apresentaram 786 e 550pb, respectivamente. A mPCR apresentou melhor temperatura de anelamento a 57,6°C com limite de detecção das concentrações de DNA em ambos genes (16S rRNA and aerA) de 10-10g/μL. A mPCR padronizada é rápida, sensível e específica no diagnóstico de Aeromonas spp. e identificação do gene aerolisina. Esta metodologia apresenta vantagens quando comparada aos métodos de diagnóstico convencionais, podendo ser utilizada em cultivos comerciais de tilápias do Nilo ou outros peixes. A identificação do gene aerolisina é uma importante ferramenta na determinação do potencial patogênico dos isolados de Aeromonas spp. estudados.(AU)

Infections caused by bacteria of the genus Aeromonas are among the most common diseases in fish farming systems worldwide, and this disease occurs in all countries which have Nile tilapia (Oreochromis niloticus) farmed. The present work describes the development of a new multiplex PCR (mPCR) technique that diagnosis the genus Aeromonas and detects aerolysin gene (aerA). Reference strains of several Aeromonas species and other genera were used for standardization of mPCR. Strains of A. hydrophila from "pacaman" fish (Lophiosilurus alexandri) and Aeromonas spp. from Nile tilapia from farming systems were used too. Primers were designed based on the 16S rRNA region and aerA (aerolysin toxin). To verify a better annealing temperature were used gradients between 59°C and 61°C with 40ng of the DNA template. The 16S rRNA gene and the aerA gene amplification products showed 786 and 550 bp, respectively. The mPCR showed better annealing temperature at 57.6°C, and the detection limit for both genes (16S rRNA and aerA) was 10-10g/μL of the DNA. The standardized mPCR is quick, sensitive, and specific for Aeromonas spp. diagnosis and to detect aerolysin gene. This method showed advantages when compared to the conventional diagnostic methods and can be used in Nile tilapia or other fish farming systems. The detection of aerolysin gene is an important tool to determine the potential pathogenicity of Aeromonas spp. isolates.(AU)

Occurrence, hemolytic toxins and antimicrobial resistance of Aeromonas hydrophila strains from dairy cow and anatolian water buffalo quarter milk samples in Turkey

Background: Motile aeromonads are considered to be one of the most important food-borne pathogens because of potential human health significance. Aerolysin and hemolysin are virulence factors playing a significant role in the pathogenesis of infections. Antimicrobial resistance is an important problem limiting therapeutic options. The main objective of the present study was to isolate motile Aeromonas species from cow and Anatolian buffalo quarter milk samples and determine the antimicrobial resistance and hemolysin (hlyA) and aerolysin (aerA) virulence genes of isolated species by PCR.Material, Methods & Results: The present study was carried out on apparently healthy 200 dairy cows and 103 Anatolian water buffaloes in different stages of lactation, hand-milked twice a day, held in private farms located in Afyonkarahisar province of Western Turkey. Before milking, 771 and 399 quarter milk samples were collected from cows and Anatolian buffaloes, respectively. For the isolation, APW, SAA and blood agar were used. The certain identification of isolates was made using API 20NE system. The strains were tested for susceptibility to 21 different antibiotics by disc diffusion test. Bacterial DNAs were extracted from all strains using a genomic DNA extraction kit and strains were screened for the presence of hlyA and aerA genes by PCR. While A. hydrophila was isolated from 22 (1.9%) of 1170 quarter milk samples, A. caviae and A. sobria were not detected in the examined milk samples. The isolation rate of A. hydrophila from cow and buffalo milk samples was 2.1% (n = 16) and 1.5% (n = 6), respectively. The highest resistance rate in strains was against ampicillin (100%), followed by ampicillin-sulbactam (95.5%), methicillin (95.5%) and cephazoline (81.8%). The most of strains were also resistant at least to one of the antibiotics.[...](AU)

Occurrence, hemolytic toxins and antimicrobial resistance of Aeromonas hydrophila strains from dairy cow and anatolian water buffalo quarter milk samples in Turkey

Background: Motile aeromonads are considered to be one of the most important food-borne pathogens because of potential human health significance. Aerolysin and hemolysin are virulence factors playing a significant role in the pathogenesis of infections. Antimicrobial resistance is an important problem limiting therapeutic options. The main objective of the present study was to isolate motile Aeromonas species from cow and Anatolian buffalo quarter milk samples and determine the antimicrobial resistance and hemolysin (hlyA) and aerolysin (aerA) virulence genes of isolated species by PCR.Material, Methods & Results: The present study was carried out on apparently healthy 200 dairy cows and 103 Anatolian water buffaloes in different stages of lactation, hand-milked twice a day, held in private farms located in Afyonkarahisar province of Western Turkey. Before milking, 771 and 399 quarter milk samples were collected from cows and Anatolian buffaloes, respectively. For the isolation, APW, SAA and blood agar were used. The certain identification of isolates was made using API 20NE system. The strains were tested for susceptibility to 21 different antibiotics by disc diffusion test. Bacterial DNAs were extracted from all strains using a genomic DNA extraction kit and strains were screened for the presence of hlyA and aerA genes by PCR. While A. hydrophila was isolated from 22 (1.9%) of 1170 quarter milk samples, A. caviae and A. sobria were not detected in the examined milk samples. The isolation rate of A. hydrophila from cow and buffalo milk samples was 2.1% (n = 16) and 1.5% (n = 6), respectively. The highest resistance rate in strains was against ampicillin (100%), followed by ampicillin-sulbactam (95.5%), methicillin (95.5%) and cephazoline (81.8%). The most of strains were also resistant at least to one of the antibiotics.[...]

Molecular characterization of virulence factors in Aeromonas hydrophila obtained from fish / Caracterização molecular de fatores de virulência em Aeromonas hydrophila obtidas de peixes

Multiple factors can be involved in the virulence processes of Aeromonas hydrophila. The objective of the present paper was to verify the presence of aerolysin, hidrolipase, elastase and lipase virulence genes through the polymerase chain reaction (PCR) in A. hydrophila isolates obtained from fish of the São Francisco River Valley, and to evaluate virulence according to the presence of these genes in Nile tilapia fingerlings. One hundred and fourteen isolates from the bacteria were used. DNA was heat extracted and PCR undertaken using specific primers described in the literature. For in vivo tests Nile tilapia fingerlings were used. From the PCR tests, negative isolates for all genes tested were selected, positive isolates for two genes (aerolysin and elastase) and positive for the four genes tested. These were inoculated at a concentration of 10(8) UFC/ml into the tilapias, considered as treatments; another group of animals was used as control (with inoculation of saline solution). In all, 12 distinct standards regarding the presence of virulence factors in isolates from A. hydrophila, were observed. Of the 114 isolates analyzed, 100 (87.72%) presented at least one of the virulence factors under study. The virulence factors were widely distributed among the A. hydrophila isolates. Aerolysin was the most frequent virulence factor present in the isolates analyzed. A. hydrophila led to the mortality of the Nile tilapia fingerlings, regardless of the absence or quantity of virulence genes tested.(AU)

Múltiplos fatores podem estar envolvidos nos processos de virulência de Aeromonas hydrophila. O objetivo do presente trabalho foi verificar a presença dos genes de virulência aerolisina, hidrolipase, elastase e lipase, utilizando a reação em cadeia da polimerase (PCR), em isolados de Aeromonas hydrophila obtidos de peixes do Vale do São Francisco e, avaliar sua virulência de acordo com a presença desses genes de virulência em alevinos de tilápia do Nilo. Cento e quatorze isolados foram utilizados. O DNA foi termoextraído e a PCR realizada com a utilização de inciadores específiicos descritos pela literatura. Para os testes in vivo alevinos de tilápia do Nilo foram utilizados. Segundo os resultados da PCR, foram selecionados isolados negativos para todos os genes de virulência testados, isolados positivos para dois genes de virulência, (aerolisina e elastase) e positivos para os quatro genes avaliados. Esses isolados foram inoculados na concentração de 108 UFC/ml nos alevinos e foram considerados como tratamentos e, um outro grupo de animais foi utilizado como grupo controle (com inoculação de solução salina). Ao fiinal, 12 padrões distintos, em relação a presença dos fatores de virulência nos isolados de A. Hydrophila, foram observados. Dentre os 114 isolados analisados, 100 (87,72%) apresentaram pelo menos um dos genes de virulência sob estudo. Os fatores de virulência foram amplamente distribuídos entre os isolados de A. hydrophila. A aerolisina foi o fator de virulência mais frequente nos isolados analisados. A. hydrophila levou à mortalidade dos alevinos de tilápia do Nilo, independente da ausência ou quantidade de genes de virulência testados.(AU)

DESENVOLVIMENTO E PADRONIZAÇÃO DE UMA PCR MULTIPLEX PARA A DETECÇÃO DE Aeromonas spp. E Streptococcus spp. EM TILÁPIAS DO NILO (Oreochromis niloticus) NOS MUNICÍPIOS DE JATOBÁ E PETROLÂNDIA EM PERNAMBUCO, BRASIL.

O cultivo da tilápia do Nilo (Oreochromis niloticus) vem crescendo atualmente no Brasil e em Pernambuco. O sistema de cultivo intensivo associado ao manejo inadequado resulta no aparecimento de doenças oportunistas, principalmente as de origem bacteriana. As bactérias dos gêneros Aeromonas ssp. e Streptococcus ssp. são responsáveis pela maioria das mortalidades nas fazendas de peixe, causando morte por septicemia, além de se disseminar rapidamente nos plantéis. Objetivou-se neste estudo desenvolver um diagnóstico rápido por Reação em Cadeia de Polimerase - PCR para bactérias do gênero Aeromonas e Streptococcus, além de analisar a ocorrência dessas bactérias oriundas de tilapiculturas nos municípios de Jatobá e Petrolândia em Pernambuco. Foi padronizada uma PCR multiplex para o gênero Aeromonas e para a espécie Aeromonas hydrophila, com temperatura ideal de anelamento de 57.6°C e limite de detecção até 10-10 g/L de DNA extraído diretamente das colônias em cultivo microbiológico, utilizando como alvos os genes 16S rRNA e a citotoxina enterotóxica aerolisina (aer). Também foram estudadas a ocorrência de bactérias do gênero Aeromonas e Streptococcus oriundas de tilapiculturas localizadas nos municípios de Jatobá e Petrolândia no sertão de Pernambuco. Todos os 70 peixes coletados e todas as 16 amostras de água apresentaram isolados de Aeromonas spp. e Aeromonas hydrophila com prevalência dos fatores de virulência aerolisina (aer) e enterotoxina citotóxica (act) de 53,6% e 52,9%, respectivamente. Não foram encontrados isolados de Streptococcus ssp. tanto nos peixes como na água das tilapiculturas estudadas. A padronização de técnicas de diagnóstico bem como a ocorrência de aeromoniose em peixes cultivados no sertão de Pernambuco, demonstra a importância de pesquisas nessa área com objetivo de impulsionar a tilapicultura no Estado e otimizar o diagnóstico de doenças bacterianas.

Culture os nile tilapia (Oreochromis niloticus) is currently expanding in Brazil and Pernambuco. Intensive culture systems are associated with inadequate management, which results in the ocorrence of opportunistic bacterial diseases. The bacterial genera Aeromonas ssp. and Streptococcus ssp. are responsible for mortality in fish farms, due to septicemia and rapid spread of infection among animals. The aim of this study was to develop a quick assay for diagnosis by Polimerase Chain Reaction - PCR for Aeromonas ssp. and Streptococcus ssp., to investigate the occurrence of these bacterias from tilapia culture in Jatobá and Petrolândia - PE. It was standardized a mPCR for Aeromonas hydrophila and Aeromonas genus, with annealing temperature 57.6 °C and 10-10 g/L detection limit of DNA extracted directly from colonies in microbiological culture, using as targets the 16S rRNA genes and the virulence gene enterotoxic cytotoxin aerolysin (aer). Were also studied the occurrence of Aeromonas ssp. and Streptococcus ssp. colected from tilapia cultures located on Jatoba and Petrolândia - PE. All 70 collected fish and 16 water samples showed Aeromonas spp.and Aeromonas hydrophila isolates, with prevalence of virulence factors (aer) and cytotoxic enterotoxin (act) of 53.6% and 52.9%, respectively. None Streptococcus ssp.isolates were identify. The diagnostic techniques standardization and the occurrence of Aeromoniosis in fish farmed in Pernambuco demonstrates the importance of research in this area with the objective of boosting tilapicultura in the state and optimize the bacterial diseases diagnosis.

Avaliação do efeito do pH, temperatura e concentração de amônia sobre o crescimento, virulência e expressão de alguns genes de Aeromonas spp.

Muitas são as causas de perdas econômicas na aquicultura, em meio a elas pode-se citar as doenças provocadas por micro-organismos. A contaminação do pescado por micro-organismos patogênicos pode levar a morte dos animais ou à lesões nos tecidos, tornando-os inapropriados para o consumo humano. Dentre as bactérias patogênicas destaca-se o gênero Aeromonas caracterizado por ser um patógeno oportunista que pode conter diversos fatores de virulência. Vários fatores ambientais podem afetar a produtividade de peixes e o desenvolvimento de doenças. No entanto, não se conhece a influência dos fatores ambientais sobre a expressão de genes de virulência em Aeromonas spp.. Deste modo os objetivos do presente estudo foram avaliar a influência dos fatores ambientais sobre o crescimento in vitro, a virulência in vivo e expressão de genes de virulência em Aeromonas spp.. Trinta e cinco isolados bacterianos de foram caracterizados por PCR quanto à presença de genes de virulência (aerolisina, hidrolipase, elastase, lipase, enterotoxina ast, flagelo lateral laf e flagelo polar fla). Seis isolados contendo genes de virulência foram submetidos a testes de crescimento in vivo em diferentes pontos de pH, temperatura e amônia e, também tiveram sua virulência testada in vivo em peixes submetidos às mesmas condições ambientais. Dois pontos de cada variável ambiental foram determinados para submissão dos isolados bacterianos a análise de expressão gênica dos fatores de virulência aerolisina, lipase e fla, mais frequentes na população bacteriana. A maioria dos genes foi detectada nos isolados analisados, com exceção do gene hidrolipase, sendo detectados em maior frequência os genes aerolisina, lipase e fla. Foi verificado que os três fatores ambientais influenciam o crescimento de Aeromonas spp. in vitro e, que diferentes pHs e concentrações de amônia influenciam a virulência bacteriana in vivo. O gene fla demonstrou ter sua expressão aumentada quando as bactérias são submetidas a maiores concentrações de amônia. A expressão do gene aerolisina não foi influenciada pelos fatores ambientais e o gene da lipase demonstrou ser pouco expresso in vitro. A expressão da virulência de Aeromonas aponta ser influenciada principalmente pelo imunocomprometimento do hospedeiro do que pelas condições abióticas a que está exposta no ambiente antes da infecção.

There are many causes of economic losses in aquaculture, among which we can mention the diseases caused by microorganisms. The fish contamination by pathogenic bacteria may lead animals to death or cause tissue injuries, making them unsuitable for human consumption. Among the pathogenic bacteria, it can be highlighted the Aeromonas genus characterized as an opportunistic pathogen that can contain several virulence factors. Many environmental factors can affect the fish productivity and the development of diseases. However, the influence of environmental factors on the expression of virulence genes in Aeromonas spp.. still remains unknown. This study aimed to evaluate the influence of environmental factors on in vitro growth, on in vivo virulence and on the expression of virulence genes in Aeromonas spp.. Thirty-five bacterial isolations were classified by PCR according the presence of virulence genes (aerolysin, hidrolipase, elastase, lipase, ast enterotoxin, laf lateral flagellum and fla polar flagellum). Six isolations containing virulence genes were subjected to in vitro growth tests in different levels of pH, temperature and ammonia concentration and also had their virulence tested in fish subjects, under the same environmental conditions. Two points in each environmental condition were assigned so the bacteria isolations could be analyzed for gene expression of the three more frequent virulence factors in the population. Most of the genes were detected in the analyzed isolates, except for the hidrolipase gene. The more frequent genes were aerolysin, lipase and fla. It was found that three environmental factors influences the in vitro growth of Aeromonas spp., and that different pH and ammonia concentrations affect the bacterial virulence in vivo. The fla was upregulated gene when the bacteria are subjected to higher ammonia concentrations. The expression of aerolysin gene was not affected by environmental factors, and the lipase gene was little expressed in vitro. It was possible to conclude that the expression of the virulence genes in Aeromonas were more influenced rather by the immunocompromise of the host than by abiotic conditions that the bacteria is exposed to the environment before causing the infection.

Aeromonas associated diarrhoeal disease in south Brazil: prevalence, virulence factors and antimicrobial resistance

Aeromonas were isolated from 27 (6.6%) of 408 patients admitted with acute gastroenteritis in two hospitals at Rio Grande do Sul, Brazil. Isolates were classified as A. hydrophila (51.8%), A. caviae (40.8%), and A. veronii biotype sobria (7.4%). The highest prevalence of Aeromonas associated infections occurred in lactants and children. Virulence genes (aerA -aerolysin/hemolysin, ahpA -serine-protease, satA - glycerophospholipid-cholesterol acyltransferase, lipA -lipase, and ahyB -elastase) and virulence factors (hemolytic, proteolitic, lipolitic activities, and biofilm formation) were identified in most A. hydrophila and A. veronii biotype sobria isolates, with lower frequencies on A. caviae. All Aeromonas isolates were resistant to ampicillin, ticarcillin/clavulanic acid, cephalotin, and cephazolin, and most of them (>70%) exhibited resistance to imipenem, carbenicillin, amoxillin/sulbactan, and piperacillin. Multiple-resistance, more than four antibiotics, was evidenced in 29.6% of the isolates. The most efficient antibiotics were the quinolones (ciprofloxacin and norfloxacin), and the aminoglycosides (amikacin and netilmicin).

Aeromonas foram isoladas de 27 (6.6%) dos 408 pacientes admitidos com gastroenterite aguda em dois hospitais do Rio Grande do Sul, Brasil. Os isolados foram classificados com A. hydrophila (51.8%), A. caviae (40.8%), e A. veronii biotype sobria (7.4%). A maior prevalência de Aeromonas ocorreu em lactantes e crianças. Genes (aerA -aerolisina/hemolisina, ahpA -serina-protease, satA - glicerofosfolipidio-colesterol aciltransferase, lipA -lipase, e ahyB -elastase) e factores (atividade hemolítica, proteolítica, lipolítica, e formação de biofilme) de virulência foram identificados na maioria dos isolados de A. hydrophila e A. veronii biotype sobria, com freqüências menores em A. caviae. Todos os isolados de Aeromonas apresentaram resistência a ampicilina, ticarcilina/ácido clavulânico, cefalotina e cefazolina, e a maior parte (>70%) exibiram resistência a imipenem, carbenicilina, amoxacilina/sulbactam e piperacilina. Resistência múltipla foi evidenciada em 29,6% dos isolados. Os antibióticos mais eficientes foram as quinolonas (ciprofloxacina e norfloxacina) e os aminoglicosídicos (amicacina e netilmicina).

Molecular characterization of Aeromonas hydrophila isolates from diseased fishes in district Kasur, Punjab, Pakistan

Abstract Pakistan is an agricultural country and fisheries play a very important role in the economic development of the country. Different diseases are prevalent in Pakistani fish but information related to the causative agents is not well-known. Keeping in view the significance of bacterial pathogens as the causative agents of multiple fish diseases, the present study was conducted for identification, characterization and analysis of virulence genes of Aeromonas spp. isolated from diseased fishes. A total of fifty fish samples having multiple clinical indications were collected from different fish farms of district Kasur, Punjab Pakistan. For isolation of Aeromonas spp. samples were enriched and inoculated on Aeromonas isolation medium. Isolates were identified and characterized by different biochemical tests, Analytical Profile Index (API) 20E kit and Polymerase Chain Reaction (PCR) assays. All isolates were screened for three putative virulence genes including aerolysin (aer), haemolysin (hyl) and heat labile cytotonic enterotoxin (alt). Seven isolates of Aeromonas (A.) hydrophila were retrieved and identified based on API 20E. These isolates were further confirmed as A. hydrophila on the basis of PCR assays. Three isolates were detected positive for the presence of virulence genes (alt and hyl). Whereas aerolysin (aer) gene was not present in any of A. hydrophila isolates. The present study confirmed A. hydrophila as the causative agent of epizootic ulcerative syndrome and motile Aeromonas septicemia in fish farms of district Kasur, Punjab Pakistan. Moreover, detection of two virulence genes (alt and hyl) in A. hydrophila isolates is a threat for fish consumers of study area.

Resumo O Paquistão é um país agrícola, onde a pesca desempenha um papel muito importante para o desenvolvimento econômico. Diferentes doenças são prevalentes em peixes do Paquistão, mas as informações relacionadas aos agentes causadores não são bem conhecidas. Tendo em vista a importância dos patógenos bacterianos como agentes causadores de múltiplas doenças em peixes, o presente estudo foi conduzido para identificação, caracterização e análise de genes de virulência de isolados de Aeromonas spp. de peixes doentes. Foram coletadas 50 amostras de peixes com múltiplas indicações clínicas em diferentes fazendas do distrito de Kasur, Punjab, Paquistão. Para isolar Aeromonas spp., as amostras foram enriquecidas e inoculadas em meio de isolamento. Os isolados foram identificados e caracterizados por diferentes testes bioquímicos, kit Analytical Profile Index (API) 20E, e ensaios de reação em cadeia da polimerase (PCR). Todos os isolados foram selecionados para três genes de virulência putativos, incluindo aerolisina (aer), hemolisina (hyl) e enterotoxina citotônica termolábil (alt). Sete isolados de Aeromonas hydrophila foram recuperados e identificados com base no API 20E. Esses isolados foram posteriormente confirmados como A. hydrophila de acordo com ensaios de PCR. Três isolados indicaram a presença de genes de virulência (alt e hyl), enquanto o gene aerolisina (aer) não esteve presente em nenhum dos isolados de A. hydrophila. O presente estudo confirmou A. hydrophila como o agente causador da síndrome ulcerativa epizoótica e septicemia móvel por Aeromonas em fazendas de peixes, no distrito de Kasur, Punjab, Paquistão. Além disso, a detecção de dois genes de virulência (alt e hyl) em isolados de A. hydrophila é uma ameaça para os consumidores de peixes da área de estudo.

Molecular characterization of Aeromonas hydrophila isolates from diseased fishes in district Kasur, Punjab, Pakistan / Caracterização molecular de isolados de Aeromonas hydrophila de peixes doentes no distrito de Kasur, Punjab, Paquistão

Abstract Pakistan is an agricultural country and fisheries play a very important role in the economic development of the country. Different diseases are prevalent in Pakistani fish but information related to the causative agents is not well-known. Keeping in view the significance of bacterial pathogens as the causative agents of multiple fish diseases, the present study was conducted for identification, characterization and analysis of virulence genes of Aeromonas spp. isolated from diseased fishes. A total of fifty fish samples having multiple clinical indications were collected from different fish farms of district Kasur, Punjab Pakistan. For isolation of Aeromonas spp. samples were enriched and inoculated on Aeromonas isolation medium. Isolates were identified and characterized by different biochemical tests, Analytical Profile Index (API) 20E kit and Polymerase Chain Reaction (PCR) assays. All isolates were screened for three putative virulence genes including aerolysin (aer), haemolysin (hyl) and heat labile cytotonic enterotoxin (alt). Seven isolates of Aeromonas (A.) hydrophila were retrieved and identified based on API 20E. These isolates were further confirmed as A. hydrophila on the basis of PCR assays. Three isolates were detected positive for the presence of virulence genes (alt and hyl). Whereas aerolysin (aer) gene was not present in any of A. hydrophila isolates. The present study confirmed A. hydrophila as the causative agent of epizootic ulcerative syndrome and motile Aeromonas septicemia in fish farms of district Kasur, Punjab Pakistan. Moreover, detection of two virulence genes (alt and hyl) in A. hydrophila isolates is a threat for fish consumers of study area.

Resumo O Paquistão é um país agrícola, onde a pesca desempenha um papel muito importante para o desenvolvimento econômico. Diferentes doenças são prevalentes em peixes do Paquistão, mas as informações relacionadas aos agentes causadores não são bem conhecidas. Tendo em vista a importância dos patógenos bacterianos como agentes causadores de múltiplas doenças em peixes, o presente estudo foi conduzido para identificação, caracterização e análise de genes de virulência de isolados de Aeromonas spp. de peixes doentes. Foram coletadas 50 amostras de peixes com múltiplas indicações clínicas em diferentes fazendas do distrito de Kasur, Punjab, Paquistão. Para isolar Aeromonas spp., as amostras foram enriquecidas e inoculadas em meio de isolamento. Os isolados foram identificados e caracterizados por diferentes testes bioquímicos, kit Analytical Profile Index (API) 20E, e ensaios de reação em cadeia da polimerase (PCR). Todos os isolados foram selecionados para três genes de virulência putativos, incluindo aerolisina (aer), hemolisina (hyl) e enterotoxina citotônica termolábil (alt). Sete isolados de Aeromonas hydrophila foram recuperados e identificados com base no API 20E. Esses isolados foram posteriormente confirmados como A. hydrophila de acordo com ensaios de PCR. Três isolados indicaram a presença de genes de virulência (alt e hyl), enquanto o gene aerolisina (aer) não esteve presente em nenhum dos isolados de A. hydrophila. O presente estudo confirmou A. hydrophila como o agente causador da síndrome ulcerativa epizoótica e septicemia móvel por Aeromonas em fazendas de peixes, no distrito de Kasur, Punjab, Paquistão. Além disso, a detecção de dois genes de virulência (alt e hyl) em isolados de A. hydrophila é uma ameaça para os consumidores de peixes da área de estudo.