Amelioration of exosome and mesenchymal stem cells in rats infected with diabetic nephropathy by attenuating early markers and aquaporin-1 expression / Melhoria das células-tronco exossomais e mesenquimais em ratos infectados com nefropatia diabética atenuando marcadores precoces e expressão de aquaporina-1

Diabetic nephropathy (DN) is a prevalent diabetic microvascular condition. It is the leading cause of kidney disease in the advanced stages. There is no currently effective treatment available. This research aimed to investigate the curative potentials of exosomes isolated from mesenchymal stem cells affecting DN. This study was performed on 70 male adult albino rats. Adult rats were randomized into seven groups: Group I: Negative control group, Group II: DN group, Group III: Balanites treated group, Group IV: MSCs treated group, Group V: Exosome treated group, Group VI: Balanites + MSCs treated group and Group VII: Balanites + exosome treated group. Following the trial period, blood and renal tissues were subjected to biochemical, gene expression analyses, and histopathological examinations. Results showed that MDA was substantially increased, whereas TAC was significantly decreased in the kidney in the DN group compared to normal health rats. Undesired elevated values of MDA levels and a decrease in TAC were substantially ameliorated in groups co-administered Balanites aegyptiacae with MSCs or exosomes compared to the DN group. A substantial elevation in TNF-α and substantially diminished concentration of IGF-1 were noticed in DN rats compared to normal health rats. Compared to the DN group, the co-administration of Balanites aegyptiacae with MSCs or exosomes substantially improved the undesirable elevated values of TNF-α and IGF-1. Furthermore, in the DN group, the mRNA expression of Vanin-1, Nephrin, and collagen IV was significantly higher than in normal healthy rats. Compared with DN rats, Vanin-1, Nephrin, and collagen IV Upregulation were substantially reduced in groups co-administered Balanites aegyptiacae with MSCs or exosomes. In DN rats, AQP1 expression was significantly lower than in normal healthy rats. Furthermore, the groups co-administered Balanites aegyptiacae with MSCs or exosomes demonstrated a substantial increase in AQP1 mRNA expression compared to DN rats.

A nefropatia diabética (ND) é uma condição microvascular diabética prevalente. É a principal causa de doença renal em estágios avançados. Atualmente, não há tratamento eficaz disponível. Esta pesquisa teve como objetivo investigar os potenciais curativos de exossomos isolados de células-tronco mesenquimais que afetam a ND. Este estudo foi realizado em 70 ratos albinos adultos machos. Ratos adultos foram randomizados em sete grupos: Grupo I: Grupo de controle negativo, Grupo II: Grupo DN, Grupo III: Grupo tratado com Balanites, Grupo IV: Grupo tratado com MSCs, Grupo V: Grupo tratado com exossomos, Grupo VI: Grupo tratado com Balanites + MSCs e Grupo VII: Balanites + grupo tratado com exossomas. Após o período experimental, o sangue e os tecidos renais foram submetidos a análises bioquímicas, de expressão gênica e exames histopatológicos. Os resultados mostraram que o MDA aumentou substancialmente, enquanto o TAC diminuiu significativamente no rim no grupo DN em comparação com ratos saudáveis normais. Valores elevados indesejados de níveis de MDA e uma diminuição no TAC foram substancialmente melhorados em grupos coadministrados Balanites aegyptiacae com MSCs ou exossomas em comparação com o grupo DN. Uma elevação substancial em TNF-α e uma concentração substancialmente diminuída de IGF-1 foram observadas em ratos DN em comparação com ratos saudáveis normais. Em comparação com o grupo DN, a coadministração de Balanites aegyptiacae com MSCs ou exossomas melhorou substancialmente os valores elevados indesejáveis de TNF-α e IGF-1. Além disso, no grupo DN a expressão de mRNA de vanina-1, nefrina e colágeno IV foi significativamente maior do que em ratos saudáveis normais. Comparado com ratos DN, Vanin-1, Nephrin e colágeno IV Upregulation foram substancialmente reduzidos em grupos co-administrados Balanites aegyptiacae com MSCs ou exossomos. Em ratos DN, a expressão de AQP1 foi significativamente menor do que em ratos saudáveis normais. Além disso, os grupos que coadministraram Balanites aegyptiacae com MSCs ou exossomos demonstraram um aumento substancial na expressão de mRNA de AQP1 em comparação com ratos DN.

Morphology and immunolocalization of aquaporins 1 and 9 in the agouti (Dasyprocta azarae) testis excurrent ducts

This study investigated the morphology and immunoexpression of aquaporins (AQPs) 1 and 9 in the rete testis, efferent ducts, epididymis, and vas deferens in the Azaras agouti (Dasyprocta azarae). For this purpose, ten adult sexually mature animals were used in histologic and immunohistochemical analyses. The Azaras agouti rete testis was labyrinthine and lined with simple cubic epithelium. Ciliated and non-ciliated cells were observed in the epithelium of the efferent ducts. The epididymal cellular population was composed of principal, basal, apical, clear, narrow, and halo cells. The epithelium lining of vas deferens was composed of the principal and basal cells. AQPs 1 and 9 were not expressed in the rete testis. Positive reaction to AQP1 was observed at the luminal border of non-ciliated cells of the efferent ducts, and in the peritubular stroma and blood vessels in the epididymis, and vas deferens. AQP9 was immunolocalized in the epithelial cells in the efferent ducts, epididymis and vas deferens. The morphology of Azaras agouti testis excurrent ducts is similar to that reported for other rodents such as Cuniculus paca. The immunolocalization results of the AQPs suggest that the expression of AQPs is species-specific due to differences in localization and expression when compared to studies in other mammals species. The knowledge about the expression of AQPs in Azaras agouti testis excurrent ducts is essential to support future reproductive studies on this animal, since previous studies show that AQPs may be biomarkers of male fertility and infertility.(AU)

Effects of aquaporin 4 and inward rectifier potassium channel 4.1 on medullospinal edema after methylprednisolone treatment to suppress acute spinal cord injury in rats

Purpose: To investigate the effects of aquaporin 4 (AQP4) and inward rectifier potassium channel 4.1 (Kir4.1) on medullospinal edema after treatment with methylprednisolone (MP) to suppress acute spinal cord injury (ASCI) in rats.Methods: Sprague Dawley rats were randomly divided into control, sham, ASCI, and MP-treated ASCI groups. After the induction of ASCI, we injected 30 mg/kg MP via the tail vein at various time points. The Tarlov scoring method was applied to evaluate neurological symptoms, and the wet-dry weights method was applied to measure the water content of the spinal cord.Results: The motor function score of the ASCI group was significantly lower than that of the sham group, and the spinal water content was significantly increased. In addition, the levels of AQP4 and Kir4.1 were significantly increased, as was their degree of coexpression. Compared with that in the ASCI group, the motor function score and the water content were significantly increased in the MP group; in addition, the expression and coexpression of AQP4 and Kir4.1 were significantly reduced.Conclusion: Methylprednisolone inhibited medullospinal edema in rats with acute spinal cord injury, possibly by reducing the coexpression of aquaporin 4 and Kir4.1 in medullospinal tissues.(AU)

Immunogenic potential of Rhipicephalus (Boophilus) microplus aquaporin 1 against Rhipicephalus sanguineus in domestic dogs / Potencial imunogênico da aquaporina 1 de Rhipicephalus (Boophilus) microplus contra o carrapato Rhipicephalus sanguineus em cães domésticos

This study evaluated a recombinant aquaporin 1 protein of Rhipicephalus (Boophilus) microplus (RmAQP1) as antigen in a vaccine against R. sanguineus. Five dogs were immunized with RmAQP1 (10 µg) + adjuvant (Montanide) (G1), and five were inoculated with adjuvant only (G2), three times. Twenty-one days after the last immunization, animals of both groups were challenged with R. sanguineus larvae, nymphs and adults, and their biotic potential was compared. Blood samples were collected before each immunization and every 28 days after the last immunization for 10 weeks. Serum antibody titers (IgG) were assessed by ELISA. We observed that: engorgement period of adult females from G1 was 12% shorter than G2; larvae from G1 had 8.7% longer engorgement period than G2 and weighed 7.2% less; nymphs from G1 had 4.5% shorter engorgement period than G2 and weighed 3.6% less; although the antibody titers increased following the second immunization, they rapidly decreased after the third immunization. Results indicated low immunoprotection of RmAQP1 against adult R. sanguineus ticks, and possible efficacy on larvae and nymphs fed on immunized dogs. Further studies should be performed for a full evaluation of the immunoprotection of RmAQP1 against R. sanguineus infestations in dogs.(AU)

Este estudo avaliou a proteína recombinante (aquaporina) do carrapato Rhipicephalus (Boophilus) microplus como antígeno em vacina contra Rhipicephalus sanguineus. Cinco cães foram imunizados com RmAQP1 (10 µg) + adjuvante (G1) e cinco foram inoculados apenas com adjuvante (G2), três vezes. 21 dias após a última imunização todos os animais foram desafiados com larvas, ninfas e adultos de R. sanguineus, e potencial biótico dos carrapatos foi comparado. Amostras de sangue foram coletadas antes de cada imunização e a cada 28 dias após a última imunização, durante 10 semanas. Títulos de anticorpos dos soros dos cães foram avaliados por ELISA. Resultados: o período de ingurgitamento das fêmeas do G1 foi 12% mais curto que o período de ingurgitamento de G2; o período de ingurgitamento das larvas do G1 8,7% foi mais longo e o peso 7,2% menor que no caso de G2; o período de ingurgitamento das ninfas do G1 4,5% foi mais curto e peso 3,6% menor que no caso do G2; aumento dos títulos de anticorpos do G1 após a segunda imunização e declínio após a terceira imunização. Os resultados indicaram baixo potencial de imunoproteção de RmAQP1 contra R. sanguineus adultos, e possível eficácia contra larvas e ninfas, na dose testada. Sugere-se desenvolver novos estudos para melhor avaliação da eficácia de RmAQP1 contra R. sanguineus em cães.(AU)

Renal Dose Dopamine Mediates the Level of Aquaporin-2 Water Channel (Aqp2) in Broiler Chickens

ABSTRACT Aquaporin 2 (AQP2) is a small protein located in the collecting tubules of kidneys; it plays an important role in the concentration and production of urine. The aim of this study was to determine the expression level of the AQP2 gene in the kidney of broiler chickens after the administration of renal­dose dopamine. Broiler chickens (25 days-old) were randomly divided into two groups (n=20 per group): intravenous administration of saline solution (control group) or renal-dose dopamine (dopamine group). The expression and localization of the AQP2 gene were evaluated by real-time quantitative polymerase chain reaction (RT-qPCR) and immunohistochemistry (IHC), respectively. The protein level of AQP2 was analyzed by western blot analysis. The dopamine group presented no significant difference (p>0.05) in the biochemical criterion or mRNA expression of AQP2 compared with the control group. However, AQP2 protein level was significantly reduced (p 0.05) in the membrane of renal tubular epithelial cells. In contrast, protein level was significantly increased (p 0.05) in the cytoplasm of the dopamine group compared with the control group. Moreover, AQP2 protein was apparently more distributed and localized in the cytoplasmic vacuoles than in the membranes of the kidney in the renal­dose dopamine administered chickens group. In conclusion, present findings suggest that renal­dose dopamine mediates the level of AQP2 protein via shuttle from the cell membrane to the cytoplasm rather than changing the expression of AQP2 gene to adjust the secretion and absorption of water in kidney.(AU)

AVALIAÇÃO DO POTENCIAL IMUNOGÊNICO DA AQUAPORINA DE Rhipicephalus (Boophilus) microplus CONTRA O CARRAPATO Rhipicephalus sanguineus SENSU LATO EM CÃES DOMÉSTICOS

O controle de carrapatos à base de acaricidas químicos tem levado a seleção de ectoparasitos resistentes além de contaminação ambiental e de produtos de origem animal. Frente a isso, há crescente incentivo na busca por alternativas de controle do ectoparasito, como o desenvolvimento de vacinas. O presente estudo teve como objetivo avaliar a utilização de uma proteína recombinante da aquaporina do Rhipicephalus (Boophilus) microplus como antígeno em uma vacina contra R. sanguineus, em cães domésticos. A investigação foi realizada em cooperação científica com o United States Department of Agriculture/Agricultural Research Service (USDA/ARS). Os efeitos da vacina foram avaliados nos diferentes estádios do ectoparasito em cães previamente vacinados com o antígeno + adjuvante (Montanide) (G1) e em animais de um grupo controle inoculados apenas como adjuvante (G2). Foram avaliados: i. potencial biótico (parâmetros biológicos) dos carrapatos;. Título de anticorpos séricos (IgG) de cães por meio do ensaio imunoenzimático indireto (Teste ELISA) pós imunização; iii. Avaliação histopatológica do sitio de fixação dos carrapatos em diversos momentos pósfixação na pele dos hospedeiros, incluindo a contagem de células inflamatórias migradas para o foco inflamatório; iv. Histologia do ovário dos carrapatos para observação de possíveis danos causados pela ação do imunógeno; v. locais de ação do antígeno no corpo do carrapato por meio de ensaio imunohistoquímico. Os principais resultados obtidos foram: 1) O período de ingurgitamento das fêmeas adultas do grupo imunizado foi 12% menor que o do grupo controle; 2) as larvas do grupo imunizado apresentaram período de ingurgitamento 8,7% maior que as do grupo controle e pesaram 7,2% menos; 3) as ninfas do grupo imunizado apresentaram período de ingurgitamento 4,5% menor e pesaram 3,6% menos que as do grupo controle; 4) apesar de os animais apresentarem um aumento na titulação de anticorpos pós-segunda imunização, estes títulos rapidamente diminuíram; 5) As alterações histopatológicas gerais observadas incluíram espessamento da epiderme (hiperplasia), infiltração celular inflamatória, edema de derme e neovascularização, dentre outros, o que representa aspectos inespecíficos presentes em uma reação inflamatória; 6) processo inflamatório moderado foi observado nos animais do grupo imunizado em todos os tempos avaliados; 7) O infiltrado inflamatório presente no tegumento dos cães era composto majoritariamente por linfócitos, plasmócitos e macrófagos, seguido de neutrófilos, observando-se também a presença esporádica de eosinófilos e de raros mastócitos ainda íntegros, não degranulados; 8) Histologia dos ovários de fêmeas alimentadas em cães imunizados demonstrou maior quantidade de vacuolização em ovócitos II e III, e maior número de deformações em ovócitos IV e V em relação ao grupo controle; 9) Ensaio imunohistoquímico em carrapatos adultos mostrou resultado negativo, ou seja, nenhuma marcação foi evidenciada no tecido do ectoparasito. Os resultados, analisados em conjunto, indicam um baixo potencial imunogênico do RmAQP1 contra carrapatos R. sanguineus adultos na dose testada e possível, ainda que baixa, eficácia contra larvas e ninfas. Sugere-se que novos estudos sejam desenvolvidos com dose maior de RmAQP1 para observação de seu potencial imunogênico contra R. sanguineus em cães.

Tick control based on chemical acaricides has led to rapid selection of resistant ectoparasites as well as environmental and animal products contamination. Therefore, there is an increasing incentive in the search for alternatives to the parasite´s control, such as the development of vaccines. This study aimed to evaluate the use of a recombinant aquaporin R.(Boophilus) microplus protein as antigen in a vaccine against R. sanguineus in domestic dogs. The research was conducted on scientific cooperation with the United States Department of Agriculture / Agricultural Research Service (USDA / ARS). The vaccine´s effects were evaluated at different stages of the ectoparasite in dogs previously vaccinated with antigen + adjuvant (Montanide) (G1) and in animals of a control group inoculated only with adjuvant (G2). It was evaluated: i. biotic potential (biological parameters) of ticks; serum antibodies (IgG) titers of the dogs after immunization, by indirect enzymelinked immunosorbent assay (ELISA); iii. Histopathological evaluation of the tick´s attachment site at various times post-fixation on the host´s skin, including the inflammatory cell counts migrated into the inflammatory site; iv. Tick´s ovarian histology for observation of possible damage caused by the action of the immunogen; v. possible antigen action sites in the tick's body by immunohistochemical assay. The main results were: 1) The engorgement period of adult females from the immunized group was 12% lower than the control group; 2) Larvae from the immunized group had 8.7% higher engorgement period than the control group and weighed 7.2% less; 3) Nymphs from the immunized group had 4.5% lower engorgement period and weighed 3.6% less than the control group; 4) Although the animals showed increased antibodies titer post-second immunization, these titers decreased rapidly; 5) The general histopathological changes observed included, among others, epidermal thickening (hyperplasia), inflammatory cell infiltration, edema and dermis neovascularization, all nonspecific aspects present in an inflammatory reaction; 6) Moderate inflammation was observed in animals from the immunized group in all time periods; 7) The inflammatory infiltrate in the tegument of the dogs was mostly comprised of lymphocytes, plasma cells and macrophages, followed by neutrophils, also presenting the sporadic presence of eosinophils and rare intact mast cells; 8) Histology of the ovaries of females fed on immunized dogs showed a higher amount of vacuolation in oocytes II and III, and higher presence of deformed oocytes IV and V when compared to the control group 9) Immunohistochemical test in adult ticks showed negative result meaning no immunolabeling was evidenced in ectoparasite tissue. The results, all together, indicate low immunogenic potential of the RmAQP1 against adult R. sanguineus ticks, and possible, though subtle, efficacy against larvae and nymphs in the tested dose. It is suggested that further studies are developed with higher dose of RmAQP1 to observe its possible immunogenic potential against R. sanguineus in dogs

USO DE POLÍMEROS SINTÉTICOS MELHORA A QUALIDADE DE FOLÍCULOS PRÉ-ANTRAIS CAPRINOS VITRIFICADOS E CULTIVADOS NO TECIDO OVARIANO

A vitrificação de tecido ovariano é uma alternativa para preservar a fertilidade de pacientes humanas que sofrem de câncer e que estão em risco de falência ovariana prematura. No entanto, existe sempre a necessidade de aprimorar o protocolo existente de vitrificação desse material biológico. Assim, o objetivo desse estudo foi avaliar se a adição de polímeros sintéticos na solução de vitrificação afetou a morfologia e desenvolvimento folicular, níveis de espécies reativas de oxigênio (ROS) e a expressão de proteínas relacionadas à proliferação celular (Ki-67), presença de canais de água (Aquaporina-3 ou AQP3) e apoptose (Caspase-3 ativada) no tecido ovariano da espécie caprina, conhecida por ser um excelente modelo translacional para o ser humano. Para isso, ovários caprinos foram obtidos de abatedouros locais e transportados ao laboratório dentro de uma hora. Uma vez no laboratório, o córtex ovariano de cada par ovariano foi cortado em pequenos fragmentos (n = 12; 1 x 1 x 0,5 mm) usando um Tissue Slicer® (Thomas Scientific) em condições estéreis. Somente aqueles com um número considerável de folículos pré-antrais foram considerados e distribuídos aleatoriamente entre os grupos. Dois fragmentos frescos foram fixados em 4 % de paraformaldeído (PAF) por 2 horas a 37 °C e denominados Controle Fresco, enquanto outros dois foram cultivados in vitro por 7 dias e denominados Controle Cultivado. Os fragmentos restantes (n = 8) foram distribuídos em quatro diferentes condições de vitrificação (2 fragmentos/condição): 1) Vitrificação com adição de sacarose; 2) Vitrificação com adição de SuperCool X-1000 0,2%; 3) SuperCool Z-1000 0,4% ou 4) com PVP K-12 0,2%, totalizando quatro tratamentos experimentais. Todas as soluções de vitrificação incluíam o antioxidante catalase. O Controle Cultivado e os tratamentos vitrificados foram destinados para o cultivo in vitro por 7 dias. Morfologicamente, o tratamento com SuperCool X-1000 não mostrou diferenças significativas em relação ao Controle Fresco e foi superior em relação aos demais. Quanto ao desenvolvimento folicular, todos os fragmentos vitrificados e cultivados in vitro mantiveram a percentagem de folículos em desenvolvimento equivalente ao Controle Fresco, exceto no grupo vitrificado com SuperCool Z-1000 que mostrou uma redução significativa na percentagem de desenvolvimento folicular após 7 dias de cultivo. No tocante à análise de proliferação, somente o Controle Fresco mostrou células da granulosa marcadas positivamente para Ki-67. As marcações de AQP3 mais fortes foram encontradas no tratamento com Supercool X-1000 em todas as categorias foliculares avaliadas exceto para o compartimento oocitário nos folículos secundários. A respeito da análise da caspase-3 ativada, não foram achadas diferenças estatisticamente significativas entre os tratamentos. Os níveis de ROS foram iguais para todos os tratamentos cultivados. Em conclusão, demonstrou-se que a vitrificação com o polímero sintético SuperCool X-1000 manteve amorfologia folicular semelhante à observada no tecido fresco, ou seja, folículos vitrificados com este polímero sintético podem resistir melhor o estresse sofrido durante este processo. Assim mesmo, os resultados de ROS sugerem que a interação entre o SuperCool X-1000 e o antioxidante catalase podem ajudar a reduzir o estresse oxidativo que pode levar a injurias nos folículos ovarianos.

Ovarian tissue vitrification is an alternative for fertility preservation in human female cancer patients that are at risk of premature ovarian failure. However, there is always the need for further improving the protocol used for vitrifying this biological material. Thus, the aim of this study was to evaluate whether the addition of synthetic polymers to the vitrification solution affected follicular morphology and development, reactive oxygen species (ROS) levels and the expression of proteins related to cell proliferation (Ki-67), water channels (Aquaporin-3 or AQP3) and apoptosis (activated Caspase-3) in ovarian tissue of the caprine species, known to be excellent translational models for the human being. Regarding the methodology, caprine ovaries were obtained from local abattoirs and transported to the laboratory within one hour. Once there, the ovarian cortex from each ovarian pair was cut into small fragments (n = 12; 1 × 1 × 0,5 mm) using a Tissue Slicer® (Thomas Scientific) under sterile conditions. Only those fragments with a considerable number of preantral follicles were considered and distributed randomly between the groups. Two fresh fragments were fixed in 4 % paraformaldehyde (PFA) for 2 hours at 37 °C and named as Fresh Control, while other two were in vitro cultured for 7 days and named Cultured Control. The remaining fragments (n = 8) were distributed in four different vitrification conditions (2 fragments/condition): 1) Vitrification with the addition of sucrose; 2) Vitrification with the addition of SuperCool X-1000 0.2 %; 3) SuperCool Z-1000 0.4 % or 4) PVP K-12 0.2 %, totaling four experimental treatments. All vitrification solutions included the antioxidant catalase. Cultured Control and vitrified treatments were destined for in vitro culture for 7 days. Morphologically, the treatment with SuperCool X-1000 showed no significant difference with the Fresh Control group and was superior to the other treatments. Regarding follicular development, all vitrified and in vitro cultured fragments maintained the percentage of developing follicles similar to the Fresh Control, except the one vitrified with SuperCool Z-1000 that showed a significant reduction in the follicular development percentages after 7 days of culture. Regarding the proliferation analysis, only the Fresh Control showed Ki-67-positive granulosa cells. The strongest AQP3 labels were found in the SuperCool X-1000 treatment in all follicular categories evaluated except for the oocyte compartment of the secondary follicles. Concerning the activated caspase-3 analysis, there were no statistically significant differences between treatments. ROS levels were the same for all the cultured treatments. In conclusion, we have demonstrated that the vitrification with the synthetic polymer SuperCool X-1000 maintained the follicular morphology similar to the observed in the fresh tissue, in other words, follicles vitrified with this synthetic polymer could resist better the stress suffered during this process. Also, the ROS results suggest that the interaction between SuperCool X-1000 and catalase could help reduce the oxidative stress that can lead to injuries to the follicles.

TRANSFECÇÃO DE FOLÍCULOS SECUNDÁRIOS OVINOS PARA A ATENUAÇÃO DA AQUAPORINA 3 POR RNAi E SEU EFEITO SOBRE O DESENVOLVIMENTO FOLICULAR IN VITRO

Relatos indicam que as aquaporinas (AQPs), em especial a AQP3, podem estar envolvidas no processo de formação do antro em folículos ovarianos, no entanto, essa informação ainda não foi completamente comprovada. Portanto, este trabalho teve como objetivo investigar a participação da AQP3 no desenvolvimento de folículos ovarianos ovinos cultivados in vitro, após o silenciamento gênico pós-transcricional (SGPT) ou knockdown para o mRNA dessa proteína. Inicialmente, foi desenvolvido um protocolo de transfecção utilizando o complexo de transfecção (CT) Lipofectamine® (volumes: 0,5; 0,75 ou 1,0 l) + o oligonucleotídio fluorescente BLOCK-iT (concentrações: 18,03; 27,12 ou 36,16 nM), por diferemtes tempos de incubação (12, 14, 16, 18 or 20 h). Os resultados mostraram que as melhores condições de transfecção foram 0,75 l de Lipofectamine® + 27,12 nM de BLOCK-iT incubando-se por 12 h. O knockdown da AQP3 foi realizado substituindo o BLOCK-iT pelo siRNA-AQP3 no CT. Folículos secundários foram distribuídos aleatoriamente em grupos: Controle não-transfectados (CD3 e CD6), transfectados com siRNA inespecífico (Negative Control Transfection - tNEG) ou com siRNA-AQP3 nos dias 0 (t0D3 ou t0D6), 3 (t3D6) ou 0 e 3 (t0/3D6) e então cultivados in vitro por 3 ou 6 dias. Após o cultivo, os folículos foram submetidos às avaliações: expressão gênica e proteica, integridade e extrusão e ainda o desenvolvimento folicular (crescimento, diâmetro e formação da cavidade antral). A AQP3 foi imunolocalizada em todas as estruturas foliculares, embora a expressão gênica em folículos transfectados e cultivados tenha sido menor que a de folículos antrais obtido in vivo. As taxas de folículos íntegros (t3D6 e t0/3D6) e formação de antro (t0/3D6) foram maiores em folículos transfectados do que a de folículos não transfectados. A taxa de folículos extrusos foi maior nos tratamentos CD6 e t0D6, enquanto que o tratamento t3D6 apresentou maior taxa de crescimento diário. Além disso, folículos dos tratamentos transfectados t3D6 e t0/3D6 apresentaram maior velocidade de crescimento folicular. Em conclusão, esse trabalho mostrou que é possível transfectar com sucesso, folículos secundários ovinos usando a técnica de siRNA e que essa técnica reduz a taxa de formação do antro em folículos secundários cultivados in vitro. Essa é maius uma evidência de que a AQP3 tem participação na formação da cavidade antral.

Reports indicate that aquaporins (AQPs), in particular AQP3 may be involved in the training event antral follicles cavity. However, the participation of this protein has not been fully elucidated. Techniques for post-transcriptional gene silencing (knockdown) are important tools and have been used to elucidate the function of proteins during folliculogenesis. Therefore, this study investigated the participation of AQP3 in the development of secondary follicles sheep after the knockdown in vitro culture. First transfection tests were performed with Lipofectamine® and BLOCK-iT fluorescent oligonucleotídio complex (transfection complex) in three different volumes (0.5, 0.75 or 1.0 l) and concentrations (18.03, 27.12 or 36.16 nM), respectively, and incubation times (12, 14, 16, 18 or 20 h). Tests showed that the best conditions for transfection were 0.75 l of Lipofectamine®, 27.12 nM BLOCK-iT and incubated for 12 h. The knockdown AQP3 occurred replacing the BLOCK-iT by siRNA-AQP3. Follicles side sheep were randomly allocated to non-transfected groups (CD3 and CD6) or transfected groups on days 0 (tNEG, t0D3, t0D6), 3 (t3D6) or 0 3 (t0/3D6) and cultured in vitro over 3 or 6 days. The follicles were evaluated by quantitative PCR techniques, immunohistochemistry, western blotting and the integrity analyzes, antrum formation and follicular growth. The test results showed that it is possible to successfully transfect secondary follicles sheep, and the transfection complex can cross the basement membrane barrier, granulosa cells and oocyte reach, according to the fluorescence emission by the follicles. The AQP3 was imunolocalized in all follicular structures although gene expression in transfected and cultured follicles was lower than the in vivo antral follicles. Protein expression was not detected in any treatment. The rates of intact follicles (t3D6 and t0/3D6) and antrum formation (t0/3D6) were higher in transfected follicles, the extruded follicles was higher in treatments (CD6 and t0D6) and t3D6 treatment showed the highest daily growth. In addition, treatments follicles transfected t3D6 and t0/3D6 showed a higher rate of follicular growth. In conclusion, this study showed more evidence that AQP3 possibly participates in the formation of antral cavity.

Expressão diferencial da aquaporina ScPIP2;1 em genótipos de cana-de-açúcar contrastantes para a tolerância à seca

As aquaporinas (AQP) são proteínas canais de água importantes e correlacionados a tolerância de plantas à seca. A busca por sequências homólogas de AQP junto ao banco de dados SUCEST (sugarcane EST Project) identificou 33 SAS (sugarcane assembed sequences), pertencentes a quatro classes, sendo a PIP (proteína intrínseca da membrana plasmática) subdividida em PIP1 e PIP2. A análise de expressão gênica para ScPIP2;1 em ensaios de estresse ao déficit hídrico in vitro e a campo demonstrou diferentes padrões de expressão para os genótipos IACSP94-2094 (tolerante) e IACSP97-7065 (sensível). No ensaio in vitro foi identificado no genótipo tolerante maior expressão em 48h após o déficit hídrico pelo tratamento com polietilenoglicol 15% (PEG). No sensível a expressão aumentou gradativamente sendo em 72h e 120h o maior nível de expressão após o déficit hídrico. O genótipo sensível apresentou elevado número de transcritos para ScPIP2;1. Os resultados demonstram que o genótipo sensível tanto a campo como in vitro expressa mais ScPIP2;1 que o tolerante, sendo este gene um candidato importante para o melhoramento genético de cana na identificação de genótipos superiores em relação à seca

Aquaporins (AQP) are important water channels proteins correlated to drought tolerance in plants. The search for sequences homologous to AQPs in SUCEST (sugarcane EST Project) database identified 33 SAS (sugarcane assembled sequences) from four classes, one of them being PIP (plasma membrane intrinsic protein), which is divided into two subgroups, PIP1 and PIP2. The analysis of gene expression for ScPIP2;1 in vitro and in field trails showed different expression patterns in genotypes IACSP94-2094 (tolerant) and IACSP97-7065 (sensitive). For the in vitro experiment, increased expression of ScPIP2;1 was observed for the tolerant genotype after 48 hours exposure to 15% polyethylene glycol (PEG) . The ScPIP2;1 transcript level for the sensitive genotype showed gradual increases after 72 and 120h exposure to PEG. The results indicate a higher expression of ScPIP2;1 in the sensitive genotype compared to the tolerant for both field and in vitro experiments, and this gene seems to be an important candidate for the identification of superior genotypes for sugarcane genetic breeding aiming drought tolerance