Influência do hepes na maturação in vitro de oócitos caninos obtidos de cadelas em diestro e anestro / Influence of hepes on in vitro maturation of canine oocytes in different stages of the estrous cycle

Diferentemente de outras espécies domésticas, a maturação in vitro (MIV) de oócitos caninos apresenta sucesso limitado. O objetivo deste estudo foi avaliar o efeito do HEPES na maturação in vitro de oócitos caninos obtidos de cadelas em diestro e anestro. Os ovários foram coletados, isolados assepticamente e transportados refrigerados a uma temperatura de 4 ºC. Os complexos cumulus-oócito (CCOs), provenientes das duas fases do ciclo estral, foram submetidos a dois tratamentos: meio TCM-199 com adição de 25 mM de HEPES (GT) e meio sem suplementação (GC). Depois de 72 horas de maturação, os CCOs foram desnudados, fixados e corados com HOESCHT 33342 para avaliação da maturação nuclear. Os oócitos obtidos da fase de anestro e diestro do GT demonstraram, em relação ao grupo GC, maior frequência de oócitos nos estágios de M-II (p<0,01). Comparando-se os diferentes status reprodutivos, observou-se que os oócitos obtidos da fase de diestro apresentaram índices maiores de QVG e M-II. Nossos resultados demonstraram que o HEPES preserva a viabilidade e morfologia oocitária, indispensáveis para a aquisição da competência meiótica, potencializando as taxas de M-II, e que os oócitos obtidos da fase de diestro estão mais aptos a completarem a maturação oocitária.

Unlike other domestic animals, in vitro maturation (IVM) of canine oocytes still has limited success. The aim of this study was to evaluate the effect of HEPES on the in vitro maturation of dog oocytes in anestrus and diestrus. Ovaries were collected, aseptically isolated and transported refrigerated at a temperature of 4ºC. Cumulus-oocyte complexe (COCs) from the two phases of estrous cycle were subjected to two treatments: medium TCM-199 with addition of 25 mM HEPES (TG) and medium without supplementation (CG). After 72 h of maturation, COCs were denuded, fixed and stained with Hoechst 33342 to assess nuclear maturation. The oocytes obtained from the anestrus and diestrus phases of the TG showed a higher frequency of oocytes in metaphase II (M-II) (p <0.01) stage.Comparing the different reproductive status, it was observed that the oocytes obtained from the diestrus phase presented higher rates of GVBD (germinal vesicle breakdown) and M-II. Our results showed that HEPES preserves the viability and oocyte morphology essential for the acquisition of meiotic competence, increasing the M-II rates and that the oocytes obtained from the diestrus phase are better able to complete oocyte maturation.

Influência do hepes na maturação in vitro de oócitos caninos obtidos de cadelas em diestro e anestro / Influence of hepes on in vitro maturation of canine oocytes in different stages of the estrous cycle

Diferentemente de outras espécies domésticas, a maturação in vitro (MIV) de oócitos caninos apresenta sucesso limitado. O objetivo deste estudo foi avaliar o efeito do HEPES na maturação in vitro de oócitos caninos obtidos de cadelas em diestro e anestro. Os ovários foram coletados, isolados assepticamente e transportados refrigerados a uma temperatura de 4 ºC. Os complexos cumulus-oócito (CCOs), provenientes das duas fases do ciclo estral, foram submetidos a dois tratamentos: meio TCM-199 com adição de 25 mM de HEPES (GT) e meio sem suplementação (GC). Depois de 72 horas de maturação, os CCOs foram desnudados, fixados e corados com HOESCHT 33342 para avaliação da maturação nuclear. Os oócitos obtidos da fase de anestro e diestro do GT demonstraram, em relação ao grupo GC, maior frequência de oócitos nos estágios de M-II (p<0,01). Comparando-se os diferentes status reprodutivos, observou-se que os oócitos obtidos da fase de diestro apresentaram índices maiores de QVG e M-II. Nossos resultados demonstraram que o HEPES preserva a viabilidade e morfologia oocitária, indispensáveis para a aquisição da competência meiótica, potencializando as taxas de M-II, e que os oócitos obtidos da fase de diestro estão mais aptos a completarem a maturação oocitária.(AU)

Unlike other domestic animals, in vitro maturation (IVM) of canine oocytes still has limited success. The aim of this study was to evaluate the effect of HEPES on the in vitro maturation of dog oocytes in anestrus and diestrus. Ovaries were collected, aseptically isolated and transported refrigerated at a temperature of 4ºC. Cumulus-oocyte complexe (COCs) from the two phases of estrous cycle were subjected to two treatments: medium TCM-199 with addition of 25 mM HEPES (TG) and medium without supplementation (CG). After 72 h of maturation, COCs were denuded, fixed and stained with Hoechst 33342 to assess nuclear maturation. The oocytes obtained from the anestrus and diestrus phases of the TG showed a higher frequency of oocytes in metaphase II (M-II) (p <0.01) stage.Comparing the different reproductive status, it was observed that the oocytes obtained from the diestrus phase presented higher rates of GVBD (germinal vesicle breakdown) and M-II. Our results showed that HEPES preserves the viability and oocyte morphology essential for the acquisition of meiotic competence, increasing the M-II rates and that the oocytes obtained from the diestrus phase are better able to complete oocyte maturation.(AU)

In vitro maturation of collared peccary (Pecari tajacu) oocytes after different incubation times / Maturação in vitro de oócitos de cateto (Pecari tajacu) após diferentes períodos de incubação

Oocyte in vitro maturation (IVM) is the first step of the in vitro reproductive technologies that enables mature oocytes to be generated ex vivo and after used for embryo production. In this sense, the establishment of culture environment, as oocyte incubation time, is essential for the success of the IVM. Therefore, the study was carried out to investigate the relationship between the meiotic potential and the IVM times of collared peccary oocytes, wild mammals of great commercial and ecological interest. Thus, ovaries were collected of females derived from captivity and transported to the laboratory within 1 hour of slaughtering. The oocytes derived from follicles (3-6mm in diameter) were recovered by aspirated and sliced. Good quality oocytes (evenly granulated cytoplasm with a least one layer of surrounding cumulus cells) were selected and subjected to culture in TCM 199 supplemented with 10µg/mL FSH, 10% FBS and 100µM cysteamine at 38.5°C, 5% CO2 and maximum humidity for 24 or 48 hours. After the incubation period, the nuclear status, the presence of first polar body and the expansion of cumulus cells of oocytes were assessed. The data obtained were analyzed by Fisher exact test (P<0.05). A total of four sessions (2-3 females per session) were performed, resulting in eighteen aspirated and sliced ovaries with normal morphological characteristics. An oocyte recovery rate of about 83.1% (59/71) was obtained with 3.3 oocytes/ovary and 2.3 viable oocytes/ovary. After different incubation times, differences (P<0.05) were observed in 24 and 48 hours for expansion of the cumulus cells (38.1% vs. 100%), presence of first polar body (52.4% vs. 90.5%) and nuclear status in second metaphase (19.0% vs. 76.2%), respectively. In conclusion, 48 hours is suitable time for the in vitro maturation of oocytes derived from collared peccaries when compared to the time of 24 hours, according to the meiotic potential observed. Additional studies should be conducted to improve the quality of the oocyte culture environment, as medium composition, aiming to obtain viable mature oocytes for other in vitro biotechnologies.(AU)

A maturação in vitro (MIV) oocitária é a primeira etapa das tecnologias reprodutivas in vitro que permite que oócitos maturados sejam gerados ex vivo e depois usados para a produção de embriões. Nesse sentido, o estabelecimento do ambiente de cultivo, como o período de incubação de oócitos, é essencial para o sucesso da MIV. Portanto, o estudo foi realizado para investigar a relação entre o potencial meiótico e os períodos de MIV de oócitos derivados de catetos, mamíferos silvestres de grande interesse comercial e ecológico. Para tanto, os ovários foram coletados de fêmeas derivadas de cativeiro e transportados ao laboratório dentro de 1 h após o abate. Os oócitos derivados de folículos (3-6mm de diâmetro) foram recuperados por aspiração e fatiados. Oócitos de boa qualidade (citoplasma uniformemente granulado com pelo menos uma camada circundante de células cumulus) foram selecionados e submetidos ao cultivo em TCM 199 suplementado com 10µg/mL de FSH, 10% de SFB e 100μM de cisteamina a 38,5°C, 5% de CO2 e umidade máxima por 24 e 48 h. Após o período de incubação, o estado nuclear, a presença do primeiro corpúsculo polar e a expansão das células do cumulus dos oócitos foi avaliada. Os dados obtidos foram analisados pelo teste exato de Fisher (P<0,05). Um total de quatro sessões (2-3 fêmeas por sessão) foi realizado, resultando em dezoito ovários aspirados e fatiados com características morfológicas normais. Uma taxa de recuperação oocitária de aproximadamente 83,1% (59/71) foi obtida com 3,3 oócitos/ovário e 2,3 oócitos viáveis/ovário. Após diferentes períodos de incubação, diferenças (P<0,05) foram observadas entre 24 e 48 h para a expansão das células cumulus (38,1% vs. 100%), presença de primeiro corpúsculo polar (52,4% vs. 90,5%) e estado nuclear na segunda metáfase (19,0% vs. 76,2%), respectivamente. Em conclusão, 48 h é o período adequado para a maturação in vitro de oócitos derivados de catetos quando comparado ao tempo de 24 h, de acordo com o potencial meiótico observado. Estudos adicionais devem ser conduzidos para melhorar a qualidade do ambiente de cultivo oocitário, como a composição de meio, objetivando obter oócitos maturados viáveis para outras biotecnologias in vitro.(AU)

In vitro maturation of collared peccary (Pecari tajacu) oocytes after different incubation times / Maturação in vitro de oócitos de cateto (Pecari tajacu) após diferentes períodos de incubação

Oocyte in vitro maturation (IVM) is the first step of the in vitro reproductive technologies that enables mature oocytes to be generated ex vivo and after used for embryo production. In this sense, the establishment of culture environment, as oocyte incubation time, is essential for the success of the IVM. Therefore, the study was carried out to investigate the relationship between the meiotic potential and the IVM times of collared peccary oocytes, wild mammals of great commercial and ecological interest. Thus, ovaries were collected of females derived from captivity and transported to the laboratory within 1 hour of slaughtering. The oocytes derived from follicles (3-6mm in diameter) were recovered by aspirated and sliced. Good quality oocytes (evenly granulated cytoplasm with a least one layer of surrounding cumulus cells) were selected and subjected to culture in TCM 199 supplemented with 10µg/mL FSH, 10% FBS and 100µM cysteamine at 38.5°C, 5% CO2 and maximum humidity for 24 or 48 hours. After the incubation period, the nuclear status, the presence of first polar body and the expansion of cumulus cells of oocytes were assessed. The data obtained were analyzed by Fisher exact test (P<0.05). A total of four sessions (2-3 females per session) were performed, resulting in eighteen aspirated and sliced ovaries with normal morphological characteristics. An oocyte recovery rate of about 83.1% (59/71) was obtained with 3.3 oocytes/ovary and 2.3 viable oocytes/ovary. After different incubation times, differences (P<0.05) were observed in 24 and 48 hours for expansion of the cumulus cells (38.1% vs. 100%), presence of first polar body (52.4% vs. 90.5%) and nuclear status in second metaphase (19.0% vs. 76.2%), respectively. In conclusion, 48 hours is suitable time for the in vitro maturation of oocytes derived from collared peccaries when compared to the time of 24 hours, according to the meiotic potential observed. Additional studies should be conducted to improve the quality of the oocyte culture environment, as medium composition, aiming to obtain viable mature oocytes for other in vitro biotechnologies.(AU)

A maturação in vitro (MIV) oocitária é a primeira etapa das tecnologias reprodutivas in vitro que permite que oócitos maturados sejam gerados ex vivo e depois usados para a produção de embriões. Nesse sentido, o estabelecimento do ambiente de cultivo, como o período de incubação de oócitos, é essencial para o sucesso da MIV. Portanto, o estudo foi realizado para investigar a relação entre o potencial meiótico e os períodos de MIV de oócitos derivados de catetos, mamíferos silvestres de grande interesse comercial e ecológico. Para tanto, os ovários foram coletados de fêmeas derivadas de cativeiro e transportados ao laboratório dentro de 1 h após o abate. Os oócitos derivados de folículos (3-6mm de diâmetro) foram recuperados por aspiração e fatiados. Oócitos de boa qualidade (citoplasma uniformemente granulado com pelo menos uma camada circundante de células cumulus) foram selecionados e submetidos ao cultivo em TCM 199 suplementado com 10µg/mL de FSH, 10% de SFB e 100μM de cisteamina a 38,5°C, 5% de CO2 e umidade máxima por 24 e 48 h. Após o período de incubação, o estado nuclear, a presença do primeiro corpúsculo polar e a expansão das células do cumulus dos oócitos foi avaliada. Os dados obtidos foram analisados pelo teste exato de Fisher (P<0,05). Um total de quatro sessões (2-3 fêmeas por sessão) foi realizado, resultando em dezoito ovários aspirados e fatiados com características morfológicas normais. Uma taxa de recuperação oocitária de aproximadamente 83,1% (59/71) foi obtida com 3,3 oócitos/ovário e 2,3 oócitos viáveis/ovário. Após diferentes períodos de incubação, diferenças (P<0,05) foram observadas entre 24 e 48 h para a expansão das células cumulus (38,1% vs. 100%), presença de primeiro corpúsculo polar (52,4% vs. 90,5%) e estado nuclear na segunda metáfase (19,0% vs. 76,2%), respectivamente. Em conclusão, 48 h é o período adequado para a maturação in vitro de oócitos derivados de catetos quando comparado ao tempo de 24 h, de acordo com o potencial meiótico observado. Estudos adicionais devem ser conduzidos para melhorar a qualidade do ambiente de cultivo oocitário, como a composição de meio, objetivando obter oócitos maturados viáveis para outras biotecnologias in vitro.(AU)

Only VEGF is necessary to stimulate the meiotic competence of caprine oocytes during in vitro maturation / Apenas VEGF é necessário para estimular a competência meiótica de oócitos caprinos durante a maturação in vitro

Para o sucesso da maturação in vitro (MIV), faz-se necessário uma sincronização entre as maturação nuclear e citoplasmática. Desta forma, o presente estudo teve por objetivo comparar o efeito do fator de crescimento do endotélio vascular (VEGF) como fator de crescimento na maturação in vitro (MIV) de oócitos caprinos com os fatores de crescimento epidermal (EGF) e semelhante à insulina I (IGF-I) adicionados juntos. Complexos cúmulos oócito (CCOs) foram isolados por slicing de ovários caprinos (n=40) utilizando bisturi cirúrgico. Apenas oócitos ≥110 μm com citoplasma homogêneo circundado por pelo menos uma camada compacta e coesiva de células do cúmulus foram selecionados para MIV. O meio de cultivo de base foi o TCM199 suplementado com 1% de BSA, 5 g/mL de hormônio luteinizante (LH), 0,5 g/mL de hormônio folículo estimulante recombinante (rFSH®), 0,911 mMol/L de piruvato,1μg/mL de estradiol, e 100 μM de cisteamina, o qual foi denominado TCM199+. OsCCOs selecionados foram distribuídos aleatoriamente nos seguintes tratamentos: 1) EGF e IGF-I, TCM199+ Suplementado com 10 ng/mL de EGF e 50 ng/mL de IGF-I; 2) VEGF, TCM199+ suplementado com 100 ng/mL de VEGF. Após a MIV, foram utilizados marcadores fluorescentes para avaliar a configuração da cromatina (Hoechst) e a viabilidade oocitária (calceína-AM e etídio homodímero). De uma maneira geral, ambos os tratamentos VEGF (80.2 e 35.7%) e EGF e IGF-I (70.5 e 29.9%) apresentaram resultados similares de quebra da vesícula germinativa (GVBD) e metáfase II rates (MII), respectivamente, sendo o tratamento VEGF numericamente superior ao EGF e IGF-I. Desta forma, conclui-se que o VEGF atua de forma similar ao EGF e IGF-I na competência oocitária para retomar ameiose.

For successful IVM, oocytes must undergo synchronically nuclear and cytoplasmic maturation. Thus, the aim of the present study was to compare vascular endothelial growth factor (VEGF) as a growth factor to the in vitro maturarion (IVM) to caprine oocytes instead of epidermal growth factor (EGF) plus insulin like growth factor I (IGF-I).Then, cumulus oocyte complexes (COCs) were pooled from slicing of caprine ovaries (n=40) using a surgical blade. Only oocytes ≥110 μm with homogeneous cytoplasm and surrounded by at least one compact layer of shiny and cohesive cumulus cells were selected to the IVM. The basic culture medium consisted of TCM199 supplemented with 1% of BSA, 5 g/mL of luteinizing hormone (LH), 0.5 g/mL of recombinant follicle-stimulanting hormone (rFSH®), 0.911 mMol/L pyruvate,1 μg/mL estradiol, and 100 μM cysteamine named TCM199+. The selected COCs were randomly distributed in the following treatments: 1) EGF plus IGF-I, TCM199+supplemented with 10 ng/ml of EGF and 50 ng/mL of IGF-I; 2) VEGF, TCM199+supplemented only with 100ng/mL of recombinant VEGF-A. After the IVM, oocytes were stained with fluorescent markers for the assessment of chromatin configuration (Hoechst) and to evaluate oocyte viability (calcein-AM and ethidium homodimer). Overall, both VEGF (80.2 and 35.7%) and EGF plus IGF-I (70.5 and 29.9%) treatments presented similar results of germinal vesicle breakdown (GVBD) and metaphase II rates (MII), respectively, being VEGF numerically greater than EGF plus IGF-I. Thus, we can infer that VEGF may act similar to EGF plus IGF-I in in vitro oocyte competence to resumes meiosis.

Only VEGF is necessary to stimulate the meiotic competence of caprine oocytes during in vitro maturation / Apenas VEGF é necessário para estimular a competência meiótica de oócitos caprinos durante a maturação in vitro

Para o sucesso da maturação in vitro (MIV), faz-se necessário uma sincronização entre as maturação nuclear e citoplasmática. Desta forma, o presente estudo teve por objetivo comparar o efeito do fator de crescimento do endotélio vascular (VEGF) como fator de crescimento na maturação in vitro (MIV) de oócitos caprinos com os fatores de crescimento epidermal (EGF) e semelhante à insulina I (IGF-I) adicionados juntos. Complexos cúmulos oócito (CCOs) foram isolados por slicing de ovários caprinos (n=40) utilizando bisturi cirúrgico. Apenas oócitos ≥110 μm com citoplasma homogêneo circundado por pelo menos uma camada compacta e coesiva de células do cúmulus foram selecionados para MIV. O meio de cultivo de base foi o TCM199 suplementado com 1% de BSA, 5 g/mL de hormônio luteinizante (LH), 0,5 g/mL de hormônio folículo estimulante recombinante (rFSH®), 0,911 mMol/L de piruvato,1μg/mL de estradiol, e 100 μM de cisteamina, o qual foi denominado TCM199+. OsCCOs selecionados foram distribuídos aleatoriamente nos seguintes tratamentos: 1) EGF e IGF-I, TCM199+ Suplementado com 10 ng/mL de EGF e 50 ng/mL de IGF-I; 2) VEGF, TCM199+ suplementado com 100 ng/mL de VEGF. Após a MIV, foram utilizados marcadores fluorescentes para avaliar a configuração da cromatina (Hoechst) e a viabilidade oocitária (calceína-AM e etídio homodímero). De uma maneira geral, ambos os tratamentos VEGF (80.2 e 35.7%) e EGF e IGF-I (70.5 e 29.9%) apresentaram resultados similares de quebra da vesícula germinativa (GVBD) e metáfase II rates (MII), respectivamente, sendo o tratamento VEGF numericamente superior ao EGF e IGF-I. Desta forma, conclui-se que o VEGF atua de forma similar ao EGF e IGF-I na competência oocitária para retomar ameiose.(AU)

For successful IVM, oocytes must undergo synchronically nuclear and cytoplasmic maturation. Thus, the aim of the present study was to compare vascular endothelial growth factor (VEGF) as a growth factor to the in vitro maturarion (IVM) to caprine oocytes instead of epidermal growth factor (EGF) plus insulin like growth factor I (IGF-I).Then, cumulus oocyte complexes (COCs) were pooled from slicing of caprine ovaries (n=40) using a surgical blade. Only oocytes ≥110 μm with homogeneous cytoplasm and surrounded by at least one compact layer of shiny and cohesive cumulus cells were selected to the IVM. The basic culture medium consisted of TCM199 supplemented with 1% of BSA, 5 g/mL of luteinizing hormone (LH), 0.5 g/mL of recombinant follicle-stimulanting hormone (rFSH®), 0.911 mMol/L pyruvate,1 μg/mL estradiol, and 100 μM cysteamine named TCM199+. The selected COCs were randomly distributed in the following treatments: 1) EGF plus IGF-I, TCM199+supplemented with 10 ng/ml of EGF and 50 ng/mL of IGF-I; 2) VEGF, TCM199+supplemented only with 100ng/mL of recombinant VEGF-A. After the IVM, oocytes were stained with fluorescent markers for the assessment of chromatin configuration (Hoechst) and to evaluate oocyte viability (calcein-AM and ethidium homodimer). Overall, both VEGF (80.2 and 35.7%) and EGF plus IGF-I (70.5 and 29.9%) treatments presented similar results of germinal vesicle breakdown (GVBD) and metaphase II rates (MII), respectively, being VEGF numerically greater than EGF plus IGF-I. Thus, we can infer that VEGF may act similar to EGF plus IGF-I in in vitro oocyte competence to resumes meiosis.(AU)

Influence of epidermal growth factor (EGF) supplementation at different times of in vitro maturation of canine oocytes / Influência da suplementação do fator de crescimento epidermal (EGF) em diferentes momentos da maturação in vitro de oócitos caninos

The aim of this study was to evaluate the influence of epidermal growth factor (EGF) on in vitro maturation of canine oocytes at different times of the process. Ovaries were collected from 55 bitches considered healthy and aseptically isolated, immersed in physiological solution (0.9% NaCl) and transported under refrigeration. Grade 1 cumulus-oocyte complexes (COCs) were selected and divided into two groups: control group (CG) and treatment group (TG). In CG 698 grade I COCs were placed in 4-well plates containing TCM-199 medium supplemented with 25 mM HEPES, 100 IU/mL penicillin, 100 mg/mL streptomycin, 26 mM sodium bicarbonate, 1.5 mM sodium pyruvate, 2.9 mM sodium lactate pentahydrate, 0.6 mM cysteine, 0.03 IU/mL hCG, 0.5 µg/mL FSH, 20 µg/mL estrogen at 38.5ºC in a humidified atmosphere of 5% CO2 in times of 24 h, 48 h, and 72 h. In TG 547 COCs received the same maturation medium plus 10 ηg/mL EGF. Logistic regression models (SAS, 2011) were constructed in order to estimate the chances of oocytes being observed at nuclear maturation stages in different culture times (24 h, 48 h, and 72 h). Based on the results found EGF-supplemented medium showed 2.56 times more chances of having an oocyte at metaphase I (M-I) than medium without EGF (p < 0.0001). The results of this study demonstrated that the time of 72 h showed 5.88 times more chances of having an oocyte at metaphase II (M-II) compared to time of 24 h (p = 0.0001) and 7.69 times more chance than time of 48 h (p = 0.0001). The chances of finding an oocyte at M-II were also 9.09 times higher in medium supplemented with EGF than in medium without EGF (p = 0.0001). Thus, these results demonstrated the essential importance of EGF at different moments of oocyte maturation, being a key component for the acquisition of meiotic competence in bitches, increasing the M-I and M-II rates.(AU)

O objetivo deste estudo foi avaliar a influência do fator de crescimento epidermal (EGF) em diferentes momentos da maturação in vitro de oócitos caninos. Os ovários foram coletados de 55 cadelas consideradas sadias e isolados assepticamente, imersos em solução fisiológica e transportados refrigerados. Os complexos cumulus-oócito (COCs) grau 1 foram selecionados e divididos em dois grupos, denominados grupo controle (GC) e grupo tratamento (GT). No GC, 698 COCs grau I foram cultivados em placas de quatro poços contendo meio TCM-199 suplementado com 25 mM de HEPES, 100 UI/mL de penicilina, 100 mg/mL de estreptomicina, 26 mM de bicarbonato de sódio, 1,5 mM de piruvato de sódio, 2,9 mM de lactato de sódio penta hidratado, 0,6 mM de cisteína, 0,03 UI/mL de hCG, 0,5 µg/mL de FSH, 20 µg/mL de estrógeno em estufa úmida a 38ºC, 5% de CO2 nos períodos de 24h, 48 h e 72 h . Já no GT, 547 COCs receberam o mesmo meio de maturação acrescido de 10 ηg/mL do EGF. Modelos de regressão logística foram elaborados para estimar as chances do oócito ser observado nos estágios de maturação nuclear em diferentes tempos de cultivo. Com base nos resultados encontrados, o meio suplementado com EGF demonstrou 2,56 vezes mais chances de ter um oócito no estágio de metáfase I (M-I) do que o meio sem EGF (p < 0,0001). Os resultados desse estudo demonstraram também que o tempo de 72 h mostrou 5,88 vezes mais chances de ter um oócito no estágio de metáfase II (M-II) do que o tempo de 2 h (p = 0,0001) e 7,69 vezes mais chance do que o tempo de 48h (p = 0,0001). As chances de se encontrar um oócito em M-II também foram 9,09 vezes maiores no meio suplementado com EGF do que no meio sem EGF (p = 0,0001). Dessa forma, estes resultados demonstraram a importância essencial do EGF em diferentes momentos da maturação oocitária, sendo componente chave para a aquisição da competência meiótica nas cadelas, aumentando os índices de M-I e M-II.(AU)

Influence of epidermal growth factor (EGF) supplementation at different times of in vitro maturation of canine oocytes / Influência da suplementação do fator de crescimento epidermal (EGF) em diferentes momentos da maturação in vitro de oócitos caninos

The aim of this study was to evaluate the influence of epidermal growth factor (EGF) on in vitro maturation of canine oocytes at different times of the process. Ovaries were collected from 55 bitches considered healthy and aseptically isolated, immersed in physiological solution (0.9% NaCl) and transported under refrigeration. Grade 1 cumulus-oocyte complexes (COCs) were selected and divided into two groups: control group (CG) and treatment group (TG). In CG 698 grade I COCs were placed in 4-well plates containing TCM-199 medium supplemented with 25 mM HEPES, 100 IU/mL penicillin, 100 mg/mL streptomycin, 26 mM sodium bicarbonate, 1.5 mM sodium pyruvate, 2.9 mM sodium lactate pentahydrate, 0.6 mM cysteine, 0.03 IU/mL hCG, 0.5 µg/mL FSH, 20 µg/mL estrogen at 38.5ºC in a humidified atmosphere of 5% CO2 in times of 24 h, 48 h, and 72 h. In TG 547 COCs received the same maturation medium plus 10 ηg/mL EGF. Logistic regression models (SAS, 2011) were constructed in order to estimate the chances of oocytes being observed at nuclear maturation stages in different culture times (24 h, 48 h, and 72 h). Based on the results found EGF-supplemented medium showed 2.56 times more chances of having an oocyte at metaphase I (M-I) than medium without EGF (p < 0.0001). The results of this study demonstrated that the time of 72 h showed 5.88 times more chances of having an oocyte at metaphase II (M-II) compared to time of 24 h (p = 0.0001) and 7.69 times more chance than time of 48 h (p = 0.0001). The chances of finding an oocyte at M-II were also 9.09 times higher in medium supplemented with EGF than in medium without EGF (p = 0.0001). Thus, these results demonstrated the essential importance of EGF at different moments of oocyte maturation, being a key component for the acquisition of meiotic competence in bitches, increasing the M-I and M-II rates.(AU)

O objetivo deste estudo foi avaliar a influência do fator de crescimento epidermal (EGF) em diferentes momentos da maturação in vitro de oócitos caninos. Os ovários foram coletados de 55 cadelas consideradas sadias e isolados assepticamente, imersos em solução fisiológica e transportados refrigerados. Os complexos cumulus-oócito (COCs) grau 1 foram selecionados e divididos em dois grupos, denominados grupo controle (GC) e grupo tratamento (GT). No GC, 698 COCs grau I foram cultivados em placas de quatro poços contendo meio TCM-199 suplementado com 25 mM de HEPES, 100 UI/mL de penicilina, 100 mg/mL de estreptomicina, 26 mM de bicarbonato de sódio, 1,5 mM de piruvato de sódio, 2,9 mM de lactato de sódio penta hidratado, 0,6 mM de cisteína, 0,03 UI/mL de hCG, 0,5 µg/mL de FSH, 20 µg/mL de estrógeno em estufa úmida a 38ºC, 5% de CO2 nos períodos de 24h, 48 h e 72 h . Já no GT, 547 COCs receberam o mesmo meio de maturação acrescido de 10 ηg/mL do EGF. Modelos de regressão logística foram elaborados para estimar as chances do oócito ser observado nos estágios de maturação nuclear em diferentes tempos de cultivo. Com base nos resultados encontrados, o meio suplementado com EGF demonstrou 2,56 vezes mais chances de ter um oócito no estágio de metáfase I (M-I) do que o meio sem EGF (p < 0,0001). Os resultados desse estudo demonstraram também que o tempo de 72 h mostrou 5,88 vezes mais chances de ter um oócito no estágio de metáfase II (M-II) do que o tempo de 2 h (p = 0,0001) e 7,69 vezes mais chance do que o tempo de 48h (p = 0,0001). As chances de se encontrar um oócito em M-II também foram 9,09 vezes maiores no meio suplementado com EGF do que no meio sem EGF (p = 0,0001). Dessa forma, estes resultados demonstraram a importância essencial do EGF em diferentes momentos da maturação oocitária, sendo componente chave para a aquisição da competência meiótica nas cadelas, aumentando os índices de M-I e M-II.(AU)

Influence of anestrus and diestrus stages of oocyte on meiotic competence in bitches / Influência das fases de anestro e diestro na competência meiótica oocitária de cadelas

The bitch has reproductive peculiarities that differentiate it from other species. Several experiments have been conducted to establish efficient protocols for maturation; however, the results appear to be unsatisfactory. In this respect, the reproductive female donor should be considered, since it can be a factor of variability of findings in this species. The objective of this study was to evaluate the relationship between the estrous cycle phases phase diestrus and anestrus on canine oocyte in vitro maturation (IVM). The ovaries were transported in sodium chloride 0.9% solution, and were cut into phosphate-buffered saline (PBS) and the cumulus-oocyte complexes (COCs) selected in tissue culture medium (TCM), supplemented with 199 HEPES. A total of 469 grade 1 oocytes were collected from bitches in anestrus and diestrus. These selected oocytes were transferred to the maturation medium for a period of 72 hours, then subjected to hyaluronidase solution and stained with Hoechst 33342 to assess nuclear configuration. The comparison of anestrus and diestrus phase showed no differences (p > 0.05) between the nuclear maturation stages. Thus, the phase of the estrous cycle did not influence the in vitro maturation of canine oocytes, increasing the rates of M-II in this species.(AU)

A cadela apresenta particularidades reprodutivas que a diferencia de outras espécies. Diversos experimentos têm sido realizados visando estabelecer protocolos eficientes para a maturação, entretanto os resultados mostram-se insatisfatórios. Nesse aspecto, a fase reprodutiva da fêmea doadora deve ser considerada, já que pode ser um fator de variabilidade dos achados ate então presenciados nessa espécie. O objetivo deste estudo foi avaliar a influencia das fases do ciclo estral (anestro e diestro) na maturação in vitro (MIV) de cadelas. Os ovários foram transportados em solução de cloreto de sódio 0,9% e seccionados em solução salina fosfato tamponado (PBS) e os complexos cumulus-oócito (COCs) selecionados em meio de cultura de tecidos (TCM) 199 suplementado com HEPES. Foram obtidos 469 oócitos grau 1 de cadelas em anestro e diestro. Esses oócitos selecionados foram transferidos para o meio de maturação por um período de 72 horas, sendo posteriormente submetidos a solução de hialuronidase e corados com HOESCHT 33342 para avaliação da configuração nuclear. A comparação das fases de anestro e diestro não revelou diferença (p > 0,05) entre os estágios de maturação nuclear. Dessa maneira, a fase do ciclo estral não influenciou na maturação in vitro de oócitos caninos, incrementando os índices de M-II nesta espécie.(AU)

DINÂMICA DA MATURAÇÃO NUCLEAR E CITOPLASMÁTICA DE OÓCITOS BOVINOS CULTIVADOS IN VITRO EM MEIO SUPLEMENTADO COM FULEROL

A eficiência da maturação in vitro (MIV) de oócitos está intimamente relacionada com a competência bioquímica, intrínseca ao desenvolvimento do oócito e sua posterior fecundação. Os meios de MIV tem sido suplementados e testados afim de melhorar o potencial oocitário para a produção in vitro de embriões (PIVE). No presente estudo objetivou-se avaliar, in vitro, a dinâmica da maturação nuclear e citoplasmática de oócitos bovinos cultivados em meio MIV suplementado com fulerol. O fulerol é uma nanomolécula derivada da polihidroxilação do fulereno, é estável e formado exclusivamente por átomos de carbono, e tem sido utilizado em algumas áreas biológicas devido sua atividade antioxidante, quando em concentrações mais baixas. Nesse trabalho objetivou-se avaliar se o fulerol é capaz de bloquear a retomada da meiose de oócitos bovinos maturados in vitro. Foram utilizados dois meios de MIV: no tratamento controle (TC), meio utilizado foi o TCM 199 bicarbonato; e o segundo tratamento, com meio TCM 199 bicarbonato suplementado com 50nM de fulerol (MF50). Os oócitos foram maturados por 24 horas em estufa a 38,5ºC, 5% de CO2 e 95% de umidade. A avaliação da maturação nuclear do TC (n=300) e MF50 (n=270) foi realizada a cada 6 horas, durante 36 horas, por meio da coloração dos oócitos com Hoechst 33342. Foram identificados os seguintes estádios: vesícula germinativa (VG), quebra da vesícula germinativa (QVG), metáfase I (MI) e metáfase II (MII). Na maturação citoplasmática avaliou-se oócitos do TC (n=197) e MF50 (n=159) a cada 12 horas, durante 36 horas, corados com Mitotracker Orange (Life® Technologies, Carlsbad, CA, USA), de acordo com a distribuição citoplasmática das mitocôndrias. Durante a experimentação verificou-se dificuldade de desnudamento dos oócitos expostos ao fulerol 50nM como uma informação observacional. De maneira descritiva, a partir de 6 horas, observou-se retardo na maturação nuclear dos oócitos do grupo MF50. Às 6 horas, oócitos do TC (19%) se encontravam em MI, enquanto no MF50 estavam em VG ou QVG, o que também ocorreu com 12 horas. Já às 18 horas, enquanto 46,3% dos oócitos já estavam maturados no TC (oócito em estádio MII), em MF50 o percentual foi de 20%. Com 24 horas de maturação, verificou-se 43,9% de maturação no grupo MF50, quando comparado com 63,8% no controle. Às 30 e 36 horas, o padrão de maturação foi estável, contudo, foi identificado início de degeneração dos oócitos. Com relação à maturação citoplasmática, houve retardo da mesma com 36 horas de maturação (P<0,05) no grupo MF50 (53,9%), comparado ao tratamento controle (69,8% de gametas maduros). E em relação aos oócitos com citoplasma imaturo, foram encontrados 10,4% e 31,7% para o TC e MF50 (P<0,05), respectivamente. Conclui-se que a adição de 50nM de fulerol ao meio de maturação in vitro possivelmente interferiu no mecanismo de expansão das células do cumulus oophorus, bem como retardou a progressão meiótica e a maturação citoplasmática dos oócitos

The efficiency of in vitro maturation (IVM) of oocytes is closely related to biochemical competence, intrinsic to the development of the oocyte and subsequent fertilization. IVM medium is supplemented in order to test and improve the oocyte potential for in vitro embryo production (IVEP). This study aimed to evaluate, in vitro, the dynamics of nuclear and cytoplasmic maturation of bovine oocytes cultured in IVM medium supplemented with fullerol. Fullerol is a nanomolecule derived from fullerene polyhydroxylation, it is stable and formed exclusively by carbon atoms. It is being used in some biological areas due to its antioxidant activity at lower concentrations. This study aimed to evaluate whether fullerol is able to block the resumption of meiosis in bovine oocytes matured in vitro. Two MIV media were used: the control treatment (CT), TCM 199 bicarbonate medium; and treatment with TCM 199 bicarbonate medium supplemented with 50nM fullerol (MF50). The oocytes were matured for 24 hours in a incubator at 38.5ºC, 5% CO2 and 95% humidity. The evaluation of nuclear maturation of CT (n = 300) and MF50 (n = 270) was performed every 6 hours, for 36 hours, by staining the oocytes with Hoechst 33342 and identifying the following stages: germinal vesicle (GV), breakdown of the germinal vesicle (GVB), metaphase I (MI) and metaphase II (MII). At cytoplasmic maturation, oocytes from CT (n = 197) and MF50 (n = 159) were evaluated every 12 hours, for 36 hours, stained with Mitotracker Orange (Life® Technologies, Carlsbad, CA, USA), according to cytoplasmic distribution of mitochondria. During the experimentation, there was difficulty in stripping the oocytes exposed to 50nM fulerol, as an observational information. Descriptively, after 6 hours of incubation, a delay in the nuclear maturation of the oocytes of the MF50 group was observed. At 6 hours of maturation, oocytes of the CT (19%) were in MI, while the MF50 were in GV or GVB, which also occurred with 12 hours. At 18 hours, while 46.3% of oocytes were matured on CT (oocyte in stage MII), on MF50 the percentage was 20%. Within 24 hours of maturation, it was observed 43.9% and 63.8% of matured oocytes for MF50 and CT groups, respectively. At 30 and 36 hours, the pattern of maturation was stable, but degenerate oocytes were identified. Regarding cytoplasmic maturation, there was a delay of 36 hours of maturation (P<0.05) in the MF50 group (53.9%) compared to the control group (69.8% of mature gametes). In relation to cytoplasmic immature oocytes, they were 10.4% for CT and 31.7% for MF50 (P<0.05). It is concluded that the addition of 50nM fullerol to the in vitro maturation medium possibly interfered in the expansion mechanism of cumulus oophorus cells, as well as delayed meiotic progression and cytoplasmic maturation of oocytes.

Influência do ciclo estral no diâmetro oocitário em cadelas / Influence of the estrous cycle bitches in diameter oocyte / Influence del ciclo estral en diámetro de los ovocitos en hembras

A baixa competência meiótica de oócitos caninos quando submetidos às condições artificiais de cultivo é considerada um grande obstáculo para o desenvolvimento de biotecnologias reprodutivas nessa espécie. As baixas taxas de MIV podem estar associadas ao tamanho dos oócitos recuperados das diferentes fases do ciclo estral. Assim, o objetivo desse trabalho é avaliar a relação entre as fases do ciclo estral - fase luteal e anestro, com o diâmetro oocitário de cadelas. Foram utilizadas 41 fêmeas caninas, com idades entre 6 meses e 7 anos, submetidas à ovariosalpingohisterectomia eletiva no Ambulatório de Reprodução de Pequenos Animais do Departamento de Reprodução Animal e Radiologia Veterinária, da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da UNESP, Botucatu. Os ovários foram fatiados e selecionados apenas os COCs grau I, sendo submetidos à solução de hialuronidase a 2% para a retirada das células do cumulus. Após esse processo, os oócitos foram corados com 10 ug/ml de Hoechst 33342 para avaliação do diâmetro oocitário, sem a zona pelúcida. Os resultados não demonstraram diferença estatisticamente significativa entre os oócitos obtidos das fases de anestro e luteal (77.62 µm x 78.64 µm). Dessa forma, há a necessidade de novos estudos para que seja possível uma compreensão adequada de quais os fatores que possam estar interferindo na competência oocitária, não devendo-se considerar apenas um fator determinante já que a ação coordenada de diversos fatores contribui para o crescimento e desenvolvimento do oócito.

The low meiotic competence of canine oocytes when subjected to conditions of artificial cultive is considered a major obstacle to the development of reproductive biotechnologies in this species. Low rates of IVM may be linked to the size of oocytes recovered from different phases of the estrous cycle. The objective of this study is to evaluate the relationship between the phases of the estrous cycle - luteal phase and anestrus, with oocyte diameter of bitches. A total of 41 female dogs, aged 6 months to 7 years, subject to ovariosalpingohisterectomy elective in the Clinic of Small Animal Reproduction, Department of Animal Reproduction and Veterinary Radiology, School of Veterinary Medicine and Animal Science, UNESP, Botucatu. Ovaries were sliced and selected only those COCs grade I, being subjected to the, solution of 2% hyaluronidase to remove cumulus cells. After this process, the oocytes were stained with 10 ml of Hoechst 33342 for assessment of oocyte diameter without the zona pellucida. The results showed no statistically significant difference between the oocytes from anestrous and luteal phases (77.62 um x 78.64 µm). Thus, there is a need for further studies to be able to have a proper understanding of the factors that may be interfering with oocyte competence and should not be considered only a determining factor since the coordinated action of several factors contributing to the growth and developing oocyte.

La baja competencia meiótica de ovocitos caninos cuando se someten a condiciones de cultivo artificial se considera un obstáculo importante para el desarrollo de biotecnologías reproductivas de esta especie. Las bajas tasas de IVM puede estar relacionado con el tamaño de los ovocitos recuperados de las diferentes fases del ciclo estral. El objetivo de este estudio es evaluar la relación entre las fases del ciclo estral - fase lútea y anestro, con un diámetro de ovocitos de hembras. Un total de 41 hembras, con edades entre 6 meses a 7 años, conforme a ovariosalpingohisterectomy el trabajo electiva en la Clínica de Reproducción de Pequeños Animales, Departamento de Reproducción Animal y Radiología Veterinaria, Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia, UNESP, Botucatu. Los ovarios fueron cortados y seleccionar sólo aquellos COCs grado I, se someten a la solución de 2% de hialuronidasa para eliminar las células del cumulus. Después de este proceso, los ovocitos se tiñeron con 10 g/ml de Hoechst 33342 para evaluar diámetro de los ovocitos sin zona de los ovarios pelúcida. Os rodajas y se selecciona sólo aquellos AOC grado I, siendo sometidos a solución de hialuronidasa de 2% para la retirada de los células del cumulus. Después de este proceso, los ovocitos se tiñeron con 10 g/ml de Hoechst 33342 para la evaluación del diámetro del ovocito sin la zona pelúcida. Los resultados no mostraron diferencias estadísticamente significativas entre los ovocitos de las fases lútea y en anestro (77,62 x 78,64 mm microM). Por lo tanto, hay una necesidad de más estudios para ser capaz de tener una adecuada comprensión de los factores que pueden interferir con la competencia de ovocitos y no debe considerarse simplemente un factor determinante ya que la acción coordinada de varios factores que contribuyen al crecimiento y desarrollo de los ovocitos.

Biotecnologia da reprodução: uso do ACP®-407 na criopreservação e do ACP®-414 na maturação de oócitos durante o processo de produção in vitro de embriões partenogenéticos caprinos

As Biotecnologias da reprodução são ferramentas capazes de aumentar a eficiência reprodutiva e produtiva do animal, assim como, superar alguns obstáculos envolvidos na reprodução animal. A proposta adotada neste presente trabalho foi avaliar o Uso do ACP®- 407 na criopreservação e do ACP®- 414 na maturação de oócitos durante o processo de produção in vitro de embriões partenogenéticos caprinos. Para este fim, os complexos cumulus-oócitos aspirados de folículos ovárianos de cabras púberes foram classificados morfologicamente e divididos em três (3) grupos. O grupo1- oócitos submetidos ao método de vitrificação (Cryotech®), grupo 2 - congelação lenta (1,5 M de EG (Etilenoglicol) /ACP®- 407) e o grupo 3 - oócitos frescos. Após descongelação e reaquecimento dos oócitos cripreservados, os classificados como viáveis foram maturados em meio de maturação in vitro convencional com e sem ACP®- 414 (10%) de acordo com fabricante a 38 C e 5% CO2 por 24 h e então ativados com exposição a Ionomicina (5 µM) por 5 minutos e incubados com 6-Dimethylaminopurina (6-DMAP) e Cicloheximida por 4h. Estas células ativadas foram cultivadas em meio para cultivo de embriões G1 e G2 (Vitrolife) por oito dias e então aferidos os blastócitos e corados com Hoechst 33342 (5µ/mL). Na avalição dos métodos de criopreservação o número de oócitos degenerados foi maior nos oócitos criopreservado em congelação lenta quando comparado com os vitrificados (p < 0,05). Baixas taxas de maturação indicando diferença significativa entre os métodos de vitrificação e congelação lenta com controle. Não houve clivagens e formação de blastocistos, demonstrando diferença significativa da incompetência meiótica quando comparado com o controle. No estudo do grupo de oócitos frescos não houve diferença significativa nas taxas de maturação dos oóctitos com e sem ACP (66,2% e 69,2%), respectivamente. Houve melhores taxas de clivagens no grupo de maturado sem ACP quando comparado com o grupo de maturados com ACP (p < 0,05). Ocorreu diferença significativa nas taxas de blastocistos no grupo de maturados sem ACP (10,8%) com relação ao grupo de maturados com ACP (0%). O uso do ACP®- 407/414 não apresentou resultados efetivos na competência oocitária dos oócitos criopreservados, mas no grupo dos oócitos frescos apresentaram resultados similares nas taxas de maturação dos oócitos frescos sem ACP, indicando ser uma boa opção de substituição de algum componente presente no meio de maturação para espécie caprina.

As Biotecnologias da reprodução são ferramentas capazes de aumentar a eficiência reprodutiva e produtiva do animal, assim como, superar alguns obstáculos envolvidos na reprodução animal. A proposta adotada neste presente trabalho foi avaliar o Uso do ACP®- 407 na criopreservação e do ACP®- 414 na maturação de oócitos durante o processo de produção in vitro de embriões partenogenéticos caprinos. Para este fim, os complexos cumulus-oócitos aspirados de folículos ovárianos de cabras púberes foram classificados morfologicamente e divididos em três (3) grupos. O grupo1- oócitos submetidos ao método de vitrificação (Cryotech®), grupo 2 - congelação lenta (1,5 M de EG (Etilenoglicol) /ACP®- 407) e o grupo 3 - oócitos frescos. Após descongelação e reaquecimento dos oócitos cripreservados, os classificados como viáveis foram maturados em meio de maturação in vitro convencional com e sem ACP®- 414 (10%) de acordo com fabricante a 38 C e 5% CO2 por 24 h e então ativados com exposição a Ionomicina (5 µM) por 5 minutos e incubados com 6-Dimethylaminopurina (6-DMAP) e Cicloheximida por 4h. Estas células ativadas foram cultivadas em meio para cultivo de embriões G1 e G2 (Vitrolife) por oito dias e então aferidos os blastócitos e corados com Hoechst 33342 (5µ/mL). Na avalição dos métodos de criopreservação o número de oócitos degenerados foi maior nos oócitos criopreservado em congelação lenta quando comparado com os vitrificados (p < 0,05). Baixas taxas de maturação indicando diferença significativa entre os métodos de vitrificação e congelação lenta com controle. Não houve clivagens e formação de blastocistos, demonstrando diferença significativa da incompetência meiótica quando comparado com o controle. No estudo do grupo de oócitos frescos não houve diferença significativa nas taxas de maturação dos oóctitos com e sem ACP (66,2% e 69,2%), respectivamente. Houve melhores taxas de clivagens no grupo de maturado sem ACP quando comparado com o grupo de maturados com ACP (p < 0,05). Ocorreu diferença significativa nas taxas de blastocistos no grupo de maturados sem ACP (10,8%) com relação ao grupo de maturados com ACP (0%). O uso do ACP®- 407/414 não apresentou resultados efetivos na competência oocitária dos oócitos criopreservados, mas no grupo dos oócitos frescos apresentaram resultados similares nas taxas de maturação dos oócitos frescos sem ACP, indicando ser uma boa opção de substituição de algum componente presente no meio de maturação para espécie caprina.

Mitofusinas em oócitos murinos: seus papéis na fertilidade e na herança mitocondrial

Durante a oogênese o oócito sofre intensas mudanças quanto a morfologia mitocondrial e número de organelas. Uma vez que a fusão e fissão mitocondrial atuam diretamente na dinâmica mitocondrial, tais processos devem ser determinantes para o desenvolvimento oocitário. O formato arredondado e pequeno das mitocôndrias oocitárias sugere que essas organelas sejam incompetentes para a fusão. É possível que tal realidade favoreça a segregação de moléculas de DNA mitocondrial (mtDNA) mutantes. Assim, este projeto teve como objetivo investigar o papel da fusão mitocondrial no oócito e suas consequências tanto para fertilidade quanto para a herança mitocondrial. Para tal, genes-chave para a fusão mitocondrial (Mfn1 e Mfn2) foram nocauteados exclusivamente nos oócitos de camundongos portadores de dois haplótipos mitocondriais, mtDNA C57BL/6 (B6) e NZB/BINJ (NZB). Oócitos selvagens (WT) ou nocautes para Mfn1 (Mfn1 cKO), Mfn2 (Mfn2 cKO) ou ambos (Mfn1&2 cKO) foram comparados quanto a competência de desenvolvimento, função mitocondrial e herança do mtDNA NZB. O acasalamento de fêmeas contendo oócitos Mfn1 cKO com machos WT não resultou em nascimento. Tal infertilidade associou-se à falha na ovulação, acúmulo de folículos e bloqueio da progressão meiótica quando do cultivo in vitro. Oócitos Mfn1 cKO também apresentaram menor diâmetro e menor nível de mtDNA e agregação mitocondrial. Já os oócitos Mfn2 cKO, não foram afetados quanto ao nível de mtDNA. Como resultado, o número de nascimentos não diferiu entre fêmeas Mfn2 cKO e WT. Surpreendentemente, o duplo nocaute resultou em efeito menos severo que o nocaute do Mfn1, sendo que o desenvolvimento folicular não foi comprometido e oócitos Mfn1&2 cKO apresentaram nível intermediário de mtDNA (comparado com oócitos WT e Mfn1 cKO), agregação mitocondrial e do retículo endoplasmático. Apesar de ovulados, os oócitos Mfn1&2 cKO apresentaram bloqueio da maturação meiótica. Como resultado, esses oócitos se mostraram incompetentes em suportarem o desenvolvimento a termo. No que se refere a herança mitocondrial, primeiramente observamos que quanto maior o nível de mtDNA NZB da fêmea doadora, maior a eliminação de mtDNA NZB nos oócitos, pois fêmeas com 60-80% de mtDNA NZB apresentaram oócitos com redução de 13,1% ± 1,99 do mtDNA NZB (NZB). Assim, utilizamos fêmeas de maior quantidade de mtDNA NZB para melhor observar o comportamento de herança. O nível de mtDNA NZB diminuiu em oócitos WT e Mfn1 cKO em comparação com as fêmeas doadoras, sugerindo uma seleção contra o mtDNA mutante. Contudo, tal seleção foi ao menos 50% menos eficaz em oócitos maturos Mfn2 cKO e Mfn1&2 cKO, evidenciando um possível papel desempenhado pelo Mfn2 na eliminação do mtDNA NZB. A mesma análise, quando feita em oócitos imaturos, cauda, fígado e baço, apresentou os mesmos comportamentos reportados em cada grupo. Não foi observada diferença entre as gerações de uma mesma fêmea. Em suma, este trabalho indica que o Mfn1 é essencial para promover oócitos com competência de desenvolvimento, enquanto que o Mfn2 participa da eliminação de mtDNA mutante no oócito. Esses achados dão suporte ao papel-chave das mitofusinas na modulação da dinâmica mitocondrial visando o atendimento às exigências dos oócitos e prevenção da herança de mutações no mtDNA.

During oogenesis the oocyte undergoes intense changes in mitochondrial morphology and number of organelles. Since mitochondrial fusion and fission act directly on mitochondrial dynamics, such processes must be determinant for oocyte development. The small and rounded shape of the oocyte mitochondria suggests that these organelles are incompetent for fusion. This could favor the segregation of mitochondrial DNA molecules (mtDNA) mutants. Thus, this project aimed to investigate the role of mitochondrial fusion in the oocyte and its consequences both for fertility and for mitochondrial inheritance. To that end, key genes for mitochondrial fusion (Mfn1 and Mfn2) were knocked out exclusively in the oocytes of mice bearing two mitochondrial haplotypes, mtDNA C57BL / 6 (B6) and NZB / BINJ (NZB). Wild oocytes (WT) or knockouts for Mfn1 (Mfn1 cKO), Mfn2 (Mfn2 cKO) or both (Mfn1&2 cKO) were compared for developmental competence, mitochondrial function and NZB mtDNA inheritance. The mating of females containing Mfn1 cKO oocytes with WT males did not result in birth. Such infertility was associated with ovulation failure, follicle accumulation, and blockage of meiotic progression during in vitro culture. Mfn1 cKO oocytes also showed smaller diameter and lower level of mtDNA and mitochondrial aggregation. However, the Mfn2 cKO oocytes were not affected in the mtDNA levels. As a result, the number of births did not differ between Mfn2 cKO and WT females. Surprisingly, the double knockout resulted in a less severe effect than the Mfn1 cKO, with follicular development not compromised and Mfn1&2 cKO oocytes had intermediate mtDNA levels (compared to WT and Mfn1 cKO oocytes), mitochondrial and reticulum aggregation endoplasmic. Despite ovulation, the Mfn1&2 cKO oocytes showed blockage of meiotic maturation. As a result, these oocytes proved to be incompetent in supporting full-term development. Regarding mitochondrial inheritance, we first observed that the higher the level of NZB mtDNA of the female donor, the greater is the elimination of NZB mtDNA in the oocytes, since females with 60-80% of mtDNA NZB presented oocytes with a reduction of 13.1% ± 1.99 of NZB mtDNA (NZB). Thus, we used females with higher amounts of NZB mtDNA to better observe the inheritance behavior. The NZB mtDNA level decreased in WT and in Mfn1 cKO oocytes compared to donor females, suggesting a selection against mutant mtDNA. However, this selection was at least 50% less effective in mature oocytes Mfn2 cKO and Mfn1&2 cKO, evidencing a possible role played by Mfn2 in the elimination of mtDNA NZB. The same analysis, when performed on immature oocytes, tail, liver and spleen, presented the same behaviors reported in each group. No difference was observed between the generations of the same female. In summary, this work indicates that Mfn1 is essential for promoting oocytes with developmental competence, whereas Mfn2 participates in the elimination of mutant mtDNA in the oocyte. These findings support the key role of mitofusins in modulating mitochondrial dynamics in order to meet oocyte requirements and prevent inheritance of mtDNA mutations.

Influence of stages anestrous and diestrus in chromatin configuration in germinal vesicle of canine oocytes / Influência das fases de anestro e diestro sobre a configuração da cromatina em vesícula germinativa de oócitos caninos

In canine specie, oocyte maturation rates are low and the percentage of oocytes that remain in the stage of germinal vesicle (GV) regardless of culture conditions is high. During maturation oocyte undergoes modification and the GV chromatin remodeling manifested by changes in the configuration and positioning. The objective of this work is to evaluate the configuration and positioning of chromatin of oocytes in GV stage during anestrus and diestrus bitches. The ovaries of 33 females (20 bitches in anestrous and 13 in diestrus) were isolated, sliced and only cumulus-oocyte complexes (COCs) grade 1 were subjected to solution of 0.2% hyaluronidase for release in cumulus cells. After this process, the selected oocytes were stained and evaluated. From a total of 920 oocytes, 566 were classified as grade 1 and the stages of chromatin configuration identified as GV-1, GV-2, GV-3 and GV-4. The observed changes in chromatin configuration been characterized as a transition dispersed chromatin (GV-1, GV-2) for partially condensed (GV-3) until it reaches a fully condensed stage (GV-4). The data analyzed from the chromatin configuration showed a significant difference between the stages with a higher proportion of GV-1 and GV-2 for the anoestrus and GV-3 and GV-4 during diestrus. There is need for further studies to be able to have a proper understanding of the influence of chromatin configuration of oocytes in GV stage in resumption of meiosis and consequently in oocyte meiotic competence(AU)

Na espécie canina as taxas de maturação oocitária são baixas e a porcentagem de oócitos que permanecem em estagio de vesícula germinativa (VG), independente das condições de cultivo, e alta. Durante a maturação oocitária, a VG sofre modificação e remodelamento da cromatina, que se manifesta por alterações na sua configuração e posicionamento. Assim, o objetivo deste trabalho e avaliar a configuração e o posicionamento da cromatina de oócitos em estagio de VG durante o anestro e diestro de cadelas. Os ovários de 33 fêmeas (20 cadelas em anestro e 13 em diestro) foram isolados, fatiados e os complexos cumulus-oócitos (COCs) foram submetidos à solução de hialuronidase 0,2% para a liberação das células do cumulus. Apos esse processo, os oócitos selecionados foram corados, avaliados e apenas COCs grau 1 foram utilizados. De um total de 920 oócitos, 566 foram classificados como grau 1 e os estágios de configuração da cromatina identificados como VG-1, VG-2, VG-3 e VG-4. As alterações observadas na configuração da cromatina foram caracterizadas como transição de uma cromatina dispersa (VG-1, VG-2) para parcialmente condensada (VG-3) ate atingir um estagio totalmente condensado (VG-4). Os dados analisados da configuração da cromatina mostraram uma diferença significativa entre as fases de anestro e diestro, com maior proporção de VG-1 e VG-2 durante o anestro e de VG-3 e VG-4 durante o diestro. Ha necessidade de novos estudos para uma compreensão adequada da influencia da configuração da cromatina de oócitos no estagio de VG na retomada da meiose e na competência meiótica do oócito(AU)

Efeitos do EGF sobre a maturação e expressão proteíca de oócitos caninos

Em cadelas, os índices de metáfase I e metáfase II são muito baixos e a porcentagem de oócitos que permanecem no estágio de vesícula germinativa é alta. A identificação das vias de sinalização do ciclo celular assim como das proteínas que fazem parte deste processo é fundamental para entender como ocorre a regulação da meiose nesta espécie. Dessa forma, o trabalho se propôs a padronizar e desenvolver pela primeira vez a técnica da proteômica para oócitos caninos com o objetivo de identificar a expressão de proteínas-chave na aquisição da competência oocitária durante o ciclo celular e avaliar a influência da suplementação do EGF nas vias de sinalização que regulam a meiose. A técnica da imunofluorescência também foi realizada para avaliar a expressão e localização das proteínas MAPK, MPF e p34cdc2 durante a maturação in vitro. Foram utilizadas 205 cadelas e os oócitos obtidos foram divididos em grupos cultivados com e sem adição de EGF por 24h, 48h e 72h, que após maturação, foram elaborados seus respectivos extratos de oócitos que foram utilizados para identificação das proteínas neles contidas. Em seguida, foram liofilizados e encaminhados para análise no espectrômetro de massa, que identificou 312 proteínas. No grupo de oócitos sem adição de EGF, detectou-se 92 proteínas diferencialmente expressas enquanto a adição de EGF esteve associada à variação quantitativa de 88 proteínas, nos tempos de cultivo analisados. No grupo sem suplementação de EGF foram observadas algumas proteínas que podem influenciar negativamente a progressão da meiose, como a proteína PSMC3 que regula de forma negativa a transição da fase G2 para fase M e a proteína MVP que está associada com um inibidor das proteínas quinases dependentes de ciclinas essenciais para o reinício da meiose. No meio com EGF foram observadas proteínas associadas com à progressão do ciclo celular, que atuaram positivamente na aquisição da competência meiótica, o que pode ser comprovado pelas chances 9 vezes maiores de obtenção de oócitos em M-II nesse grupo quando comparado ao grupo sem EGF. A metodologia aplicada neste experimento foi eficiente em determinar a presença de biomarcadores alvo na competência oocitária durante o ciclo celular de oócitos caninos. Entretanto, novos estudos complementares ainda são necessários já que o conhecimento acerca das funções dos genes e proteínas ainda é pouco elucidado na cadela.

In bitches, the metaphase I and metaphase II indexes are very low and the percentage of oocytes remaining in VG is high. The identification of the cell cycle signaling pathways as well as of proteins that are part of this process is fundamental to understand how meiosis regulation occurs in this species. The aim of this study was to standardize and develop the proteomics technique for canine oocytes for the first time in order to identify the expression of key proteins in the acquisition of oocyte competence during cell cycle and to evaluate the influence of EGF supplementation on the signaling pathways that regulate meiosis. The immunofluorescence technique was also performed to evaluate the expression and location of MAPK, MPF and p34cdc2 proteins during in vitro maturation. Two-hundred and five bitches were used and the oocytes obtained were divided into groups cultured with and without the addition of EGF for 24h, 48h and 72h, which after maturation, their respective oocyte extracts that were used to identify the proteins contained in them were elaborated. Then, they were lyophilized and sent for analysis in mass spectrometer, which identified 312 proteins. In the group of oocytes without EGF supplementation, 92 differentially expressed proteins were detected, while the addition of EGF was associated to the quantitative variation of 88 proteins at the culture times analyzed. The group without EGF supplementation showed some proteins that may negatively influence the progression of meiosis, such as PSMC3 protein, which negatively regulates the transition from G2 phase to the M phase, and MVP protein, which is associated with an inhibitor of kinases proteins dependent on cyclins essential for the resumption of meiosis. Proteins associated with cell cycle progression were observed in the EGF medium, which had a positive effect on meiotic competence acquisition, which can be evidenced by the 9-fold increased chances of obtaining M-II oocytes in this group when compared to the group without EGF supplementation. The methodology applied in this experiment was efficient in determining the presence of target biomarkers in the oocyte competence during canine oocyte cell cycle. However, further studies are still necessary, since the knowledge about the functions of genes and proteins is still scarce in bitches. ¨¨

Efeito das células do cumulus e cisteamina durante o cultivo de maturação in vitro de oócitos bovinos sobre a maturação nuclear e aquisição da competência para desenvolvimento embrionário / Effects of cumulus cells and cysteamine during bovine oocyte in vitro maturation on meiosis progression and acquisition of developmental competence

Complexos cumulus-oócito (COC), oócitos desnudos (DO) e DO cocultivados com células do cumulus em suspensão (DO+CC) foram maturados in vitro (MIV) na presença ou ausência de cisteamina (50mM). Observou-se efeito benéfico da cisteamina durante o cultivo de MIV, pois a maturação nuclear no grupo COC cisteamina foi maior do que a do COC controle (P<0,05). No grupo sem a adição de cisteamina, foi observado que a ausência de CC durante o cultivo de MIV prejudicou a maturação nuclear em DO, em relação ao COC (P<0,05), todavia a cisteamina restaurou a capacidade de progressão da meiose em DO, tornando-os semelhantes aos COC (P>0,05). O acoplamento entre oócitos e CC durante MIV demonstrou ser essencial para aquisição da competência do oócito para suportar o desenvolvimento embrionário inicial, pois COC apresentaram maior porcentagem de blastocistos e eclosão quando comparados a DO e DO+CC (P<0,05). A inclusão de cisteamina no cultivo de MIV não restaurou a aquisição da competência em DO e DO+CC, que permaneceram semelhantes aos do grupo-controle (P>0,05). Conclui-se que a cisteamina no meio de MIV melhora as taxas de maturação nuclear em COC e restaura a capacidade de progressão da meiose em DO. Todavia, na concentração utilizada neste estudo, não promove efeito benéfico no desenvolvimento embrionário.(AU)

Cumulus-oocyte complexes (COC), denuded oocytes (DO) and DO co-cultured with cumulus cells in suspension (DO+CC) were in vitro matured (IVM) in the presence or absence of cysteamine (50mM). A beneficial effect of cysteamine was observed during IVM, because the nuclear maturation in the COC cysteamine group was higher than in COC control (P<0.05). In the control group, the absence of CC during IVM impaired nuclear maturation in DO when compared to COC (P<0.05), but cysteamine restored the ability of meiosis progression in DO, making them similar to COC (P>0.05). The coupling between oocytes and CC during IVM proved to be essential for the acquisition of oocyte competence to support early embryonic development, as COC had higher percentages of blastocyst and hatching when compared to DO and DO+DC (P<0.05). However, the inclusion of cysteamine in the IVM culture did not restore the acquisition of competence in DO and DO+DC, which remained similar to the control group (P>0.05). It is concluded that cysteamine in the IVM culture improves the nuclear maturation in COC and restores the progression ability of meiosis in DO. However, in the concentration used in this study, cysteamine does not promote a beneficial effect on embryo development.(AU)

Efeito da melatonina sobre a viabilidade e expressão gênica de oócitos suínos e células do cumulus maturados in vitro

A melatonina é um antioxidante muito eficaz e protege as células contra o estresse oxidativo causado pelas espécies reativas, e indiretamente, modula a expressão de genes associados ao ciclo celular, metabolismo oxidativo e apoptose celular. Deste modo, a suplementação da melatonina ao meio de maturação in vitro, a torna uma alternativa para promover melhorias na viabilidade das células germinativas e embrionárias. O estudo 1 avaliou o efeito da adição de melatonina ao meio de maturação por meio da maturação nuclear (progressão meiótica) e citoplasmática (migração de grânulos corticais) e dos níveis de ROS em oócitos suínos maturados in vitro. A suplementação do meio de maturação com melatonina estimulou a progressão da meiose, a migração de grânulos corticais e reduziu os níveis intracelulares de ROS nos oócitos. O estudo 2 avaliou o efeito da melatonina na expressão de genes antioxidantes (Catalase, SOD1, SOD2 e GPX) envolvidos na proteção celular de oócitos e células do cumulus. A adição da melatonina ao meio de maturação influenciou positivamente a expressão dos genes antioxidantes nos oócitos e células do cumulus. O estudo 3 avaliou o efeito da melatonina nos processos biológicos por meio do perfil de trascriptomas, via RNA-Seq, em células do cumulus oriundas de oócitos suínos maturados in vitro. A partir da análise de expressão diferencial foi possível identificar que a adição da melatonina ao meio de maturação influenciou 80 genes associados a nove processos biológicos (ciclo celular; proteólise; organização de citoesqueleto; via energética; adesão e transporte celular; via de sinalização; fator de transcrição; metabolismo oxidativo e apoptose; e componente celular). A suplementação do meio de maturação com melatonina potencialmente influencia a viabilidade e o funcionamento celular, uma vez que modulou a expressão de genes associados à processos fisiológicos essenciais, tais como: divisão celular, metabolismo energético e oxidativo, vias de sinalização e apoptose. O estudo 4, avaliou o efeito da melatonina sobre os genes associados à viabilidade oocitária e o subsequente desenvolvimento embrionário por meio do perfil de trascriptomas, via RNA-Seq, de células do cumulus oriundas de oócitos suínos. A adição da melatonina ao meio de maturação influenciou 59 genes associados a nove funções biológicas (expansão do cumulus, comunicação em COCs, maturação nuclear, maturação citoplasmática, reparo e integridade do DNA, viabilidade oocitária, esteroidogênese, fertilização e embriogênese). Em conclusão, a suplementação do meio de maturação com melatonina influencia positivamente a maturação oócitária, reduz os níveis intracelulares de ROS, aumenta a expressão de genes antioxidantes, em adição, interfere no transcriptoma de um número expressivo de genes associados à aquisição da competência oócitária, da viabilidade embrionária e desenvolvimento subsequente.

Melatonin is a very effective antioxidant and protects cells against oxidative stress caused by reactive species, and indirectly modulates expression of genes associated with cell cycle, oxidative metabolism, and apoptosis. Thus, melatonin supplementation to in vitro maturation media becomes an alternative to improve the viability of germ and embryonic cells. The first study assessed the effects of adding melatonin to the maturation medium on nuclear (meiotic progression) and cytoplasmic (cortical granules migration) maturation and ROS levels in in vitro matured porcine cumulus-oocyte complexes (COCs). Melatonin supplementation stimulated meiosis progression and cortical granules migration, and reduced intracellular ROS levels in oocytes. The second study evaluated the effects of melatonin on the expression of antioxidant genes (Catalase, SOD1, SOD2, and GPX) involved in cellular protection in oocytes and cumulus cells. The addition of melatonin to the maturation medium positivity influence the expression of antioxidant genes in oocytes and cumulus cells. The third study evaluated the effect of melatonin on genes associated with biological processes through transcriptomic profile via RNA-Seq in cumulus cells derived from porcine COCs in vitro matured. Melatonin addition to maturation medium differentially affected expression of 80 genes associated with nine biological processes (cell cycle, proteolysis, cytoskeletal organization, energy pathaway, cell adhesion and transport, signalling pathway, transcription factor, oxidative metabolism and apoptosis, and cell components). The fourth study assessed the effect of melatonin on genes associated with oocyte viability and subsequent embryo development through transcriptomic profile via RNA-Seq in cumulus cells derived from porcine COCs. Melatonin in the maturation medium affected 59 genes associated with nine biological functions related with oocyte viability and embryo development (cumulus expansion, communication between cumulus cells and oocytes, nuclear maturation, cytoplasmic maturation, DNA repair and integrity, oocyte viability, steroidogenesis, fertilization and embryogenesis). In conclusion, supplementation of melatonin to maturation environment influences oocyte nuclear and cytoplasmic maturation, reduces intracellular ROS levels, positivity influence the expression of antioxidant and also interferes in the transcriptome of a significant number of genes associated with oocyte competence acquisition, embryo viability and subsequent development.

EXPRESSÃO DE ÁCIDO HIALURÔNICO SINTASE-2, RECEPTORES GONADOTRÓFICOS E CONEXINA 43 EM CÉLULAS DO CUMULUS DE OÓCITOS CAPRINOS

A maturação oocitária é uma importante etapa da produção in vitro de embriões, sendo dependente da qualidade do oócito, a qual determina sua competência ao desenvolvimento. A estimulação hormonal ovariana com gonadotrofinas pode influenciar a expressão gênica nas células cumulus (CCs) de complexos cumulus-oócito (CCOs) e, consequentemente, a qualidade oocitária. Adicionalmente, a maturação in vitro (MIV) dos CCOs envolve a síntese de ácido hialurônico para que haja a expansão do cumulus. Nesse evento, também ocorre a regulação da expressão de conexinas, as quais compõem as junções gap existentes entre o cumulus e o oócito. Assim, no presente trabalho, em paralelo à classificação morfológica (GI/II ou GIII) e avaliação da taxa de MIV, investigou-se a expressão dos genes que codificam a enzima ácido hialurônico sintase-2 (HAS2), os receptores gonadotróficos do hormônio folículo estimulante (FSHR) e do luteinizante (LHR) e a conexina 43 em CCs oriundas de CCOs caprinos obtidos após estimulação hormonal ovariana com múltiplas doses de FSH (MD) ou única dose de FSH/eCG (Oneshot - OS). Adicionalmente, CCOs bovinos oriundos de abatedouro foram utilizados como grupo controle. O tratamento MD produziu maior número de folículos grandes (>4 mm), CCOs com melhor aspecto morfológico (GI/II) e melhor taxa de MIV que OS. O tratamento OS produziu CCOs com CCs que apresentaram maior nível de transcritos para todos os genes analisados. Esta maior expressão gênica também foi observada em CCs de CCOs com aspecto morfológico inferior (GIII). Por outro lado, os níveis de RNAm tornaram-se mais semelhantes entre os grupos após a MIV, principalmente com o decréscimo dos transcritos para FSHR e LHR. Alguns eventos que ocorreram durante a MIV bovina, como a expansão das células, o aumento de HAS2 e decréscimo de Cx43, foram menos evidentes ou não observados na MIV caprina. Em conclusão, o tratamento OS produziu CCOs com maior nível de transcritos para HAS2, receptores gonadotróficos e conexina 43, comparado a MD. Contudo, esse maior nível de transcritos não conferiu maior competência meiótica aos oócitos e pode estar relacionado a uma regulação deficiente da expressão gênica por oócitos de menor qualidade. Finalmente, a expansão, o aumento da expressão de HAS2 e o decréscimo da síntese de Cx43, parecem ser eventos mais evidentes nas CCs de CCOs durante a MIV bovina que na caprina. Estudos adicionais são ainda necessários para investigar a importância de outras isoformas de HAS ou de conexinas em CCOs caprinos.

The oocyte maturation is an important step of in vitro embryo production, being dependent on oocyte quality, which determines their competence development. Ovarian stimulation with gonadotropins can influence gene expression in the cumulus cells (CCs) of cumulus-oocyte complexes (COCs) and, consequently, the oocyte quality. Additionally, in vitro maturation (IVM) of COCs involves hyaluronic acid synthesis for cumulus expansion. In this event, there is also the regulation of connexin expression, which make up the gap junctions existing between the cumulus and oocyte. In the present work, in parallel with the morphological classification (GI/II or GIII) and evaluation of IVM rate, we investigated the expression of genes encoding the enzyme hyaluronic acid synthase-2 (HAS2), the gonadotropic receptors of follicle stimulating hormone (FSHR) and luteinizing hormone (LHR) and connexin 43 in CCs derived from COCs goats obtained after ovarian hormonal stimulation with multiple doses of FSH (MD) or a single dose of FSH/eCG (OS). The MD treatment produced higher number of large follicles, COCs with great morphological aspects and IVM rate than OS. Additionally, bovine COCs originating from slaughterhouse were used as control group. The MD treatment produced higher number of large follicles (>4 mm), COCs with great morphological aspects and IVM rate than OS. The OS treatment produced COCs with more HAS2, FSHR, LHR and Cx43 transcripts. This gene expression pattern was also observed in CCs of COCs showing poor morphological characteristics. On the other hand, the mRNA levels becomes more similar between groups after IVM, mainly decreasing FSHR and LHR transcripts. Some events that occurred during the bovine IVM, such as the expansion of the cells, the increase of HAS2 and decrease of Cx43 were less apparent or not observed in goat IVM. In conclusion, the OS treatment produced COCs with a higher level of transcripts for HAS2, gonadotropic receptors and connexin 43, compared to MD. However, increasing in HAS2, FSHR, LHR and Cx43 expressions in goat COCs do not confer more meiotic competence to oocytes. Instead, it may be resulted from a poor regulation of gene expression in CCs by lower quality oocytes. Finally, cumulus expansion together with HAS2 upregulation and Cx43 downregulation seems to be more important IVM events for bovine than for goat COCs. Further studies are needed to investigate the importance of other HAS isoforms or connexins in goat COCs.

Sistemas de cultivo in vitro para o desenvolvimento de oócitos imaturos de mamíferos / Systems in vitro development of immature oocytes of mammalians

O ovário mamífero possui um grande estoque de folículos primordiais, que é uma fonte potencial de oócitos para a produção in vitro de embriões. Sendo assim, o desenvolvimento de sistemas de cultivo in vitro que explorem o grande número de oócitos imaturos oriundos de folículos pré-antrais de ovários mamíferos torna-se importante para maximizar o potencial reprodutivo das fêmeas. A presente revisão aborda os aspectos relacionados aos sistemas de cultivo in vitro para desenvolvimento de oócitos imaturos oriundos de folículos pré-antrais, bem como às técnicas para analisar sua eficiência. (AU)

The mammalian ovary has a large population of primordial follicles, which is a potential source of oocytes useful for embryo in vitro production. Due to this potential, the development of in vitro culture systems to exploit the large number of immature oocytes from the preantral follicles in the mammalian ovary becomes very important to maximize the female reproductive potential. The present review approaches related aspects of in vitro culture systems for the development of immature oocytes originated from the preantral follicles, as well the techniques to analyze their efficiency.(AU)

Sistemas de cultivo in vitro para o desenvolvimento de oócitos imaturos de mamíferos / Systems in vitro development of immature oocytes of mammalians

O ovário mamífero possui um grande estoque de folículos primordiais, que é uma fonte potencial de oócitos para a produção in vitro de embriões. Sendo assim, o desenvolvimento de sistemas de cultivo in vitro que explorem o grande número de oócitos imaturos oriundos de folículos pré-antrais de ovários mamíferos torna-se importante para maximizar o potencial reprodutivo das fêmeas. A presente revisão aborda os aspectos relacionados aos sistemas de cultivo in vitro para desenvolvimento de oócitos imaturos oriundos de folículos pré-antrais, bem como às técnicas para analisar sua eficiência.

The mammalian ovary has a large population of primordial follicles, which is a potential source of oocytes useful for embryo in vitro production. Due to this potential, the development of in vitro culture systems to exploit the large number of immature oocytes from the preantral follicles in the mammalian ovary becomes very important to maximize the female reproductive potential. The present review approaches related aspects of in vitro culture systems for the development of immature oocytes originated from the preantral follicles, as well the techniques to analyze their efficiency.