Antioxidant and antifungal activities of Camellia sinensis (L. ) Kuntze leaves obtained by different forms of production / Atividade antioxidante e antifúngica das folhas de Camellia sinensis (L. ) Kuntze, obtidas por diferentes formas de produção

Abstract The antioxidant and anticandidal activities of leaves obtained from Camellia sinensis by non-fermentation (green and white teas), semi-fermentation (red tea) and fermentation method (black tea) were investigated. It was evaluated the total phenolic content by Folin-Ciocalteau assay; antioxidant capacities were evaluated in vitro using DPPH and ABTS radicals, hypochlorous acid and superoxide anion scavenger assays, induced hemolysis, lipid peroxidation by conjugated diene formation and myeloperoxidase activity. Anticandidal activity was performed on three strains of Candida spp. The results showed that non-fermented teas have a higher concentration of phenolic compounds, and then presented the best inhibitory activity of AAPH-induced hemolysis, the best inhibition of conjugated diene formation and more pronounced antioxidant activity in all tests. The highest anticandidal activity was obtained from fermented tea, followed by non-fermented tea. These results indicate that the antioxidant activity demonstrated has no direct relation with the anticandidal activity.(AU)

Resumo A atividade antioxidante e antifúngica das folhas obtidas da Camellia sinensis pelos métodos de não-fermentação (chás verde e branco), semi-fermentação (chá vermelho) e fermentação (chá preto) foram investigadas. Foi avaliado o conteúdo total de compostos fenólicos pelo método de Folin-Ciocalteau; a capacidade antioxidante foi avaliada in vitro usando os radicais artificiais DPPH e ABTS, o ácido hipocloroso, ensaios do ânion superóxido, hemólise induzida, peroxidação lipídica por formação de dienos conjugados e atividade da Mieloperoxidase. A atividade antifúngica foi obtida sobre três cepas de Candida spp. Os resultados obtidos mostram que os chás não fermentados apresentam a maior concentração de compostos fenólicos e também, apresentam a melhor atividade inibitória, sobre hemólise induzida por APPH, sobre a formação de dienos conjugados e a mais pronunciada atividade antioxidante sobre todos os testes. A maior atividade antifúngica foi obtida pelo chá fermentado, seguido pelo semi-fermentado e não-fermentados. Os resultados obtidos demonstram que a atividade antioxidante observada não apresenta relação com a atividade antifúngica.(AU)

A toxina urêmica ácido guanidinicoacético inibe o metabolismo oxidativo dos neutrófilos de cães / Uremic toxin guanidine acetic acid inhibits the oxidative metabolism of neutrophils in dogs

Among the uremic toxins proven to affect the neutrophil function in humans with chronic kidney disease(CKD), guanidine compounds stand out. To achieve a clearer understanding of the mechanisms thataffect the immunity of uremic patients, the hypothesis that guanidine acetic acid (GAA) contributesto the inhibition of oxidative metabolism and an increase in neutrophil apoptosis in healthy dogswas investigated in vitro. To this end, neutrophils isolated from ten healthy dogs were incubated inpure RPMI 1640 (control) and enriched with 5 mg/L of GAA. Capillary flow cytometry was usedto quantify superoxide production in neutrophils with the probe (hydroethidine), in the presenceand absence of phorbol-12-myristate-13-acetate (PMA), in order to assess oxidative metabolism.Apoptotic indices were quantified using the Annexin V-PE system, with and without the inductiveeffect of camptothecin. Neutrophils isolated and incubated in a GAA-enriched medium producedsmaller amounts of superoxide (p 0.001) when activated with PMA, however, this inhibition ofoxidative metabolism occurred without significantly altering their viability or rate of apoptosis. Thus, the results show guanidine compounds contribute to immunosuppression in dogs with CKD.

Dentre as toxinas urêmicas que comprovadamente afetam a função neutrofílica na doença renalcrônica (DRC) em humanos, destacam-se os compostos guanidínicos. A fim de melhor entenderos mecanismos que afetam a imunidade de pacientes urêmicos, no presente estudo foi investigadain vitro a hipótese de que o composto guanidínico ácido guanidinicoacético (AGA) contribui parainibição do metabolismo oxidativo, aumentando a apoptose dos neutrófilos de cães saudáveis. Paratal, neutrófilos isolados de dez cães saudáveis foram incubados em meio de cultura RPMI 1640puro (controle) e enriquecido com 5 mg/L de AGA. Utilizando-se citometria de fluxo capilar paraa avaliação do metabolismo oxidativo, quantificou-se a produção de superóxido dos neutrófilosempregando-se a sonda hidroetidina, com e sem a presença do estímulo com acetato miristato deforbol (PMA). O índice apoptótico foi quantificado utilizando-se o sistema Anexina V-PE, com e semo efeito indutor da camptotecina. Os neutrófilos isolados e incubados em meio enriquecido com AGA,quando ativados com PMA, produziram uma menor quantidade de superóxido (p 0,001), porém talinibição do metabolismo oxidativo ocorreu sem alterar significativamente a viabilidade e a taxa deapoptose. Assim, os resultados evidenciam que os compostos guanidínicos podem contribuir paraimunossupressão de cães com DRC.

A toxina urêmica ácido guanidinicoacético inibe o metabolismo oxidativo dos neutrófilos de cães / Uremic toxin guanidine acetic acid inhibits the oxidative metabolism of neutrophils in dogs

Among the uremic toxins proven to affect the neutrophil function in humans with chronic kidney disease(CKD), guanidine compounds stand out. To achieve a clearer understanding of the mechanisms thataffect the immunity of uremic patients, the hypothesis that guanidine acetic acid (GAA) contributesto the inhibition of oxidative metabolism and an increase in neutrophil apoptosis in healthy dogswas investigated in vitro. To this end, neutrophils isolated from ten healthy dogs were incubated inpure RPMI 1640 (control) and enriched with 5 mg/L of GAA. Capillary flow cytometry was usedto quantify superoxide production in neutrophils with the probe (hydroethidine), in the presenceand absence of phorbol-12-myristate-13-acetate (PMA), in order to assess oxidative metabolism.Apoptotic indices were quantified using the Annexin V-PE system, with and without the inductiveeffect of camptothecin. Neutrophils isolated and incubated in a GAA-enriched medium producedsmaller amounts of superoxide (p 0.001) when activated with PMA, however, this inhibition ofoxidative metabolism occurred without significantly altering their viability or rate of apoptosis. Thus, the results show guanidine compounds contribute to immunosuppression in dogs with CKD.(AU)

Dentre as toxinas urêmicas que comprovadamente afetam a função neutrofílica na doença renalcrônica (DRC) em humanos, destacam-se os compostos guanidínicos. A fim de melhor entenderos mecanismos que afetam a imunidade de pacientes urêmicos, no presente estudo foi investigadain vitro a hipótese de que o composto guanidínico ácido guanidinicoacético (AGA) contribui parainibição do metabolismo oxidativo, aumentando a apoptose dos neutrófilos de cães saudáveis. Paratal, neutrófilos isolados de dez cães saudáveis foram incubados em meio de cultura RPMI 1640puro (controle) e enriquecido com 5 mg/L de AGA. Utilizando-se citometria de fluxo capilar paraa avaliação do metabolismo oxidativo, quantificou-se a produção de superóxido dos neutrófilosempregando-se a sonda hidroetidina, com e sem a presença do estímulo com acetato miristato deforbol (PMA). O índice apoptótico foi quantificado utilizando-se o sistema Anexina V-PE, com e semo efeito indutor da camptotecina. Os neutrófilos isolados e incubados em meio enriquecido com AGA,quando ativados com PMA, produziram uma menor quantidade de superóxido (p 0,001), porém talinibição do metabolismo oxidativo ocorreu sem alterar significativamente a viabilidade e a taxa deapoptose. Assim, os resultados evidenciam que os compostos guanidínicos podem contribuir paraimunossupressão de cães com DRC.(AU)

EFEITO DE DIFERENTES DILUENTES NA QUALIDADE E FERTILIDADE DO SÊMEN REFRIGERADO DE JUMENTO PÊGA (Equus asinus)

Frente aos resultados menos expressivos no uso de sêmen refrigerado e o interesse no comércio de muares, o aprimoramento das biotecnologias é um passo importante para a espécie asinina. Dentre os principais fatores relacionados com o sucesso no uso do sêmen refrigerado destaca-se a presença do plasma seminal e a composição do diluente utilizado para garantir a viabilidade espermática durante o processo de fertilização. Os objetivos do presente estudo visam avaliar o efeito de três diluentes sobre a qualidade do sêmen asinino, com ou sem plasma seminal, bem como os efeitos da fertilidade in vivo. Foram utilizados 2 ejaculados de 6 jumentos da raça Pêga, entre 4 e 12 anos. Cada ejaculado foi diluído em meios comerciais a base de leite desnatado (BotuSêmen Special®), caseína (BotuSêmen Gold®) e gema de ovo (BotuCrio®) e as amostras processadas na presença e remoção de plasma seminal, conforme os 6 tratamentos: leite, caseína e gema de ovo com plasma na concentração de 50 milhões de espermatozoides/mL; leite, caseína e gema de ovo centrifugado e ressuspendido na concentração de 100 milhões de espermatozoides/mL. As amostras foram avaliadas a fresco (T0), 24 (T24) e 48 (T48) horas pós-refrigeração. Os parâmetros avaliados foram: cinética espermática pelo método computadorizado CASA e desestabilização da membrana, produção de espécies reativas ao oxigênio e atividade mitocondrial por citometria de fluxo. Para o teste de fertilidade foram utilizados 6 ciclos de 15 éguas em sistema crossover e um jumento Pêga com fertilidade comprovada. O diluente à base de leite apresentou resultados inferiores para motilidade total (MT), progressiva (MP) e rápidos (RAP) sem plasma seminal em todos os momentos avaliados e maior produção de ânion superóxido em T48, na presença do plasma seminal (P<0,05). Já o meio à base de caseína sem plasma seminal, apresentou resultados superiores para todos os parâmetros avaliados em todos os momentos (P<0.05), com exceção dos valores de desestabilização de membrana em T24 que não apresentou diferença significativa. Os resultados com meio à base de gema de ovo não sofreram efeito do plasma seminal e também mostraram-se superiores, com exceção de MP e RAP em T48 (P<0,05). A caseína e a gema de ovo apresentaram elevada taxa de fertilidade tanto com (73% vs 93%) quanto sem plasma seminal (93% vs 73%), respectivamente. Já o leite desnatado apresentou valores similares sem plasma seminal (60%), porém diferiu estatisticamente na presença de plasma (20%). Conclui-se que apesar de demonstrar resultados satisfatórios na refrigeração do sêmen equino, o leite desnatado apresenta pior interação com o sêmen asinino refrigerado. Já a gema de ovo e a caseína, demonstraram ser as melhores alternativas para a refrigeração de sêmen asinino por até 48 horas.

In view of the less expressive results using cooled semen and the interest in breeding mules, the improvement of biotechnologies is an important step for the donkey species. Among the main factors related to the successful use of cooled semen, the presence of seminal plasma and the composition of the extender used to guarantee sperm viability during the fertilization process stands out. The aims of this study were to evaluate the effect of three extenders on the quality of donkey semen, with or without seminal plasma, as well as the effects of in vivo fertility. Two ejaculates from 6 donkeys of the Pêga breed (4 -12y), were used. Each ejaculate was extended in commercial extender based on skimmed milk (BotuSemen Special®), casein (BotuSemen Gold®) and egg yolk (BotuCrio®) and the samples processed in the presence and removal of seminal plasma, according to the 6 treatments: milk , casein and egg yolk with plasma at a final concentration of 50 million sperm per mL; milk, casein and egg yolk centrifuged and resuspended at a final concentration of 100 million sperm per mL. The samples were evaluated fresh (T0), 24 (T24) and 48 (T48) hours after refrigeration. The parameters evaluated were: sperm kinetics by the CASA and membrane destabilization, reactive oxygen species production and mitochondrial activity by flow cytometry. For fertility test, 6 cycles of 15 mares were used in a crossover system and semen from a Pêga donkey with proven fertility. Milk-based extender had lower results for total (TM), progressive (PM) and rapid (RAP) motility without seminal plasma at all evaluated times and higher production of superoxide anion in T48, in the presence of seminal plasma (P < 0.05). Casein-based extender without seminal plasma had superior results for all parameters evaluated at all times (P <0.05), except for the values of membrane destabilization at T24, with no statistical difference. Results of egg yolk-based extender were not affected by seminal plasma and were also superior, with the exception of PM and RAP at T48 (P<0.05). Casein and egg yolk had a high fertility rate with (73% vs 93%) and without seminal plasma (93% vs 73%), respectively. On the other hand, skimmed milk had similar values without seminal plasma (60%), but it differed statistically in the presence of plasma (20%). In conclusion, despite satisfactory results for equine cooled semen, skimmed milk extender had a worse interaction with donkey cooled semen. Egg yolk and casein proved to be the best alternatives for cooling donkey semen for up to 48 hours.

Effect of serum from dogs with renal failure on apoptosis and oxidative metabolism of polymorphonuclear / Efeito do soro de cães portadores de insuficiência renal sobre a apoptose e o metabolismo oxidativo dos polimorfonucleares

In recent years, uremic toxins have been widely investigated as an immunosuppressive factor for nephropathic patients. This study aimed to test the hypothesis that, as it was similarly observed in humans, the rate of apoptosis and superoxide production in polymorphonuclear leukocytes are changed in dogs treated with uremic serum. The superoxide production of polymorphonuclear leukocytes and apoptotic index of 10 healthy dogs incubated with autologous and homologous serum from healthy and uremic dogs was compared. Thus, there was an effect of partial inhibition of oxidative metabolism in uremia without correlation with the acceleration of polymorphonuclear leukocytes apoptosis in dogs.

Nos últimos anos, as toxinas urêmicas têm sido amplamente investigadas como elemento imunossupressor em pacientes nefropatas. Este trabalho objetivou testar a hipótese de que, à semelhança do que ocorre em humanos, a taxa de apoptose e a produção de superóxido em leucócitos polimorfonucleares de cães tratados com soro urêmico se alteram. Foi comparada a produção de superóxido e o índice apoptótico de leucócitos polimorfonucleares de 10 cães sadios incubados com o soro autólogo e homólogo de indivíduos sadios e urêmicos. Com isso, verificou-se efeito parcial de inibição do metabolismo oxidativo na uremia sem correlação com a aceleração da apoptose dos leucócitos polimorfonucleares de cães.

Effect of serum from dogs with renal failure on apoptosis and oxidative metabolism of polymorphonuclear / Efeito do soro de cães portadores de insuficiência renal sobre a apoptose e o metabolismo oxidativo dos polimorfonucleares

In recent years, uremic toxins have been widely investigated as an immunosuppressive factor for nephropathic patients. This study aimed to test the hypothesis that, as it was similarly observed in humans, the rate of apoptosis and superoxide production in polymorphonuclear leukocytes are changed in dogs treated with uremic serum. The superoxide production of polymorphonuclear leukocytes and apoptotic index of 10 healthy dogs incubated with autologous and homologous serum from healthy and uremic dogs was compared. Thus, there was an effect of partial inhibition of oxidative metabolism in uremia without correlation with the acceleration of polymorphonuclear leukocytes apoptosis in dogs.(AU)

Nos últimos anos, as toxinas urêmicas têm sido amplamente investigadas como elemento imunossupressor em pacientes nefropatas. Este trabalho objetivou testar a hipótese de que, à semelhança do que ocorre em humanos, a taxa de apoptose e a produção de superóxido em leucócitos polimorfonucleares de cães tratados com soro urêmico se alteram. Foi comparada a produção de superóxido e o índice apoptótico de leucócitos polimorfonucleares de 10 cães sadios incubados com o soro autólogo e homólogo de indivíduos sadios e urêmicos. Com isso, verificou-se efeito parcial de inibição do metabolismo oxidativo na uremia sem correlação com a aceleração da apoptose dos leucócitos polimorfonucleares de cães.(AU)

INFLUÊNCIA DA CATALASE NO MEIO DE CONGELAÇÃO NAS CARACTERÍSTICAS DO SÊMEN CRIOPRESERVADO DE TOUROS DA RAÇA NELORE SUPLEMENTADOS OU NÃO COM GORDURA PROTEGIDA

Os ácidos graxos poliinsaturados (AGPs) são integrantes da membrana celular espermática, e embora favoreçam sua fluidez, são extremamente susceptíveis ao estresse oxidativo. Nesse contexto, o presente estudo objetivou avaliar a influência da catalase no meio de congelação para criopreservação do sêmen de machos da raça Nelore suplementados com gordura protegida, a fim de evitar a produção das espécies reativas de oxigênio (EROs). Foram utilizados 12 machos da raça Nelore mantidos em pastagem de capim-marandu em lotação contínua e taxa de lotação fixa. Os animais foram divididos em dois grupos: suplementados dos 14 aos 24 meses de idade (S+), ou não suplementados (S-). A colheita de sêmen foi realizada aos 24 meses, e as amostras de sêmen a fresco foram submetidas a analise computadorizada de cinética espermática (CASA). Posteriormente, as amostras foram divididas em duas frações e foram criopreservadas após a adição de meio de congelação, de igual composição, contendo catalase (C+) ou não (C-). Após o descongelamento do sêmen foram realizadas: avaliações de CASA; teste de termorresistência rápido (TTR); integridade das membranas plasmática e acrossomal; potencial mitocondrial, desestabilização da membrana e produção da ERO ânion superóxido (O2 -); produção da EROs; produção in vitro de embriões (PIVE) e quantificação intracitoplasmática de lipídio dos embriões. O delineamento experimental utilizado foi um esquema fatorial 2X2 (suplementação x catalase), totalizando 4 tratamentos (S+, S-, C+ e C-). A análise dos dados foi realizada utilizando o procedimento PROC MIXED do SAS. Os parâmetros de cinética espermática do sêmen a fresco foram maiores para o grupo S- (motilidade total e porcentagem de células rápidas) quando comparados com o grupo S+ (MT: 91,33 x 85,83%; RAP: 89,00 x 84,33% respectivamente) (P<0,05). Houve interação entre SUP*CAT para a frequência de batimento de cabeça (BCF) (P<0,05). O grupo S+, apresentou valores maiores, quando comparado com o grupo S- para: membrana plasmática e acrossomal lesadas (MPAL) (11,29 X 2,89% respectivamente); mediana da população total de células totais (5,66 x 4,41) (P<0,05); células lesadas (6,54 X 5,39 respectivamente) (P<0,05) e produção de O2- depois do TTR; (6,47 X 5,36 respectivamente) (P<0,05); quantificação lipídica intracitoplasmática, quando avaliado média/área de blastocistos (0,323 X 0,300 respectivamente) (P<0,05).O grupo S+ com catalase apresentou menores valores de MPAL após o TTR (10,11 X 17,69) (P<0,05). Não foram observadas diferenças entre os grupos para os valores de TTR na cinética espermática; produção de EROs e no desenvolvimento embrionário na PIVE. Os resultados do presente estudo sugerem que a dieta influenciou negativamente na qualidade seminal e possivelmente contribuiu para a peroxidação lipídica causada pelo O2-. Além disso, a dieta influenciou fortemente na quantificação lipídica intracitoplasmática. Por outro lado, a catalase no meio de congelação foi benéfica evidenciando que a suplementação com gordura protegida pode ser vantajosa se utilizada em associação com antioxidantes.

Polyunsaturated fatty acids (PUFA) comprise an important component of a sperm cell membrane. Although improving the membrane fluidity, they are extremely susceptible to oxidative stress. In this context, this study aimed to evaluate the catalase influence on extender for semens cryopreservation of Nellore Bulls supplemented with sources of PUFA in order to avoid reactive species of oxygen (ROS) production. Therefore, we have included twelve Nellore bulls kept in Marandu grass pasture in continuous stocking and fixed stocking rate. Bulls were divided in two groups: supplemented at 14 to 24 months old (S+), or non-supplemented (S-). The sperm collections were performed at 24 months old and fresh semen samples were analyzed by computer-assisted sperm analysis (CASA). Subsequently, we have divided these samples into two equal portions, which were both cryopreserved after same composition extender medium addition, containing catalase (C+) or not (C-). After thawing semen, computer-assisted sperm analysis (CASA); rapid test of thermo resistance (TTR); plasma membrane integrity, acrosomal membrane integrity; mitochondrial membrane potential, membrane destabilization; production of ROS superoxide anion (O2 -); ROS ; in vitro embryo production (IVEP) and intracellular lipid content of embryos were performed. The experimental design used was a 2X2 factorial (supplementation x catalase), with 4 treatments (SUPL, CONTR, C+ e C-). Data analysis was performed using SAS PROC MIXED procedure. Sperm kinetic parameters of fresh semen were higher for S- (total motility and percentage of rapid sperm) than S+ (MT: 91.33 x 85.83%; RAP: 89.00 x 84.33% respectively) (P<0.05). We have also observed an interaction between SUP*CAT for beat cross frequency (BCF) (P<0.05). The S+ group has presented higher values compared to S- for damage percentage of plasma and acrosomal membranes (DPAM) (11.29 X 2.89%, respectively); median for total population of total cells (5.66 x 4.41, respectively) (P<0.05); damaged cells (6.54 x 5.39, respectively) (P<0.05) and O2- production after TTR 96.47 x 5.36, respectively) (P<0.05); intracellular lipid content, when evaluated the mean/area of blastocysts (0.323 X 0.300 respectively) (P<0.05). The S+ group with catalase presented lower DPAM values after TTR (10.11 X 17.69 respectively) (P <0.05). No differences were observed between the groups for TTR values on spermatic kinetics, ROS production and on embryonic development in IVEP. Our results suggest that diet has negatively influenced seminal quality and possibly contributed to lipid peroxidation caused by O2-. In addition, diet strongly influenced intracytoplasmic lipid quantification. On the other hand, catalase in the extent was beneficial in showing that supplementation with protected fat may be advantageous if used in combination with antioxidants.

Estresse oxidativo seminal em cães: Estudo da susceptibilidade dos espermatozoides e possíveis terapias durante a criopreservação

Resumo: O desequilíbrio entre a capacidade antioxidante e a produção de espécies reativas de oxigênio (EROs), também conhecido como estresse oxidativo (EO), pode ser extremamente prejudicial aos espermatozoides. Essa célula é altamente susceptível ao EO devido ao seu citoplasma reduzido e consequente limitação na reserva antioxidante citoplasmática. Além disso, os espermatozoides exibem em sua membrana uma grande quantidade de ácidos graxos polinsaturados (PUFAs), facilmente oxidadas e vulneráveis a peroxidação lipídica. Por outro lado, esses ácidos graxos, conferem fluidez a membrana plasmática, desempenhando um importante papel nos processos de fertilização além de proteger os espermatozoides durante a criopreservação. Com base nessas afirmações, o tratamento com ácidos graxos polinsaturados durante a criopreservação parece ser uma terapia interessante. No entanto, parece plausível associar essa terapia com um tratamento antioxidante para prevenir a exacerbada peroxidação lipídica. Portanto, o objetivo deste estudo foi associar o tratamento antioxidante com suplementação de PUFA, o ácido docosaexaenoico (DHA), ao diluidor para a criopreservação de sêmen canino. Para isso, foram desenvolvidos dois experimentos visando a melhora da qualidade do sêmen criopreservado, utilizando-se em ambos, o sêmen de oito cães saudáveis e sexualmente maduros e avaliações das amostras para motilidade, membrana plasmática e integridade acrossomica, integridade do DNA, atividade e função mitocondrial e susceptibilidade da peroxidação lipídica. No primeiro estudo avaliou-se a susceptibilidade espermática a diferentes desafios de indução oxidativa (ânion superóxido [O2-], peróxido de hidrogênio [H2O2], radical hidroxil [OH-]e malondialdeído [MDA]) na presença ou ausência de plasma seminal (PS). Sêmen com PS teve função mitocondrial preservada contra EROs. No entanto, na ausência de PS, H2O2 reduziu o potencial da membrana mitocondrial. Além do mais, independentemente do PS, H2O2 foi deletério para a cinética espermática e para as membranas plasmática/acrossomal, e OH- reduziu a atividade mitocondrial e aumentou a fragmentação do DNA. No entanto, amostras com PS foram mais resistentes para a peroxidação lipídica. O segundo estudo foi feito testando o DHA em três concentrações diferentes, para isso foi dividido em quatro grupos: controle, 1M, 5M e 10M DHA. Foram adicionados ao diluidor de sêmen, congelados, descongelados e analisados. Foram constatadas diferenças significativas entre o grupo controle e 1M, com este último apresentando menores valores para motilidade progressiva e espermatozoides rápidos; o grupo 5M obteve maiores valores de espermatozoides lentos e menores para espermatozoides estáticos e; o grupo 10M maiores valores para espermatozoides estáticos. Desta forma, selecionamos a concentração de 5M DHA para associar com os antioxidantes catalase e vitamina E no diluidor (que combatem o radical OH- e o H2O2, respectivamente), baseando-se no primeiro estudo. Foram adicionados ao diluidor de sêmen e divididos em quatro grupos (todos contendo 5m DHA): controle, vitamina E, catalase e vitamina E mais catalase. As amostras foram congelados, descongelados e avaliadas. Os resultados mostraram que 5M DHA mais vitamina E teve efeitos benéficos nas características cinéticas espermáticas, como velocidade média de percurso (VAP), velocidade linear (VSL), motilidade, motilidade progressiva e espermatozoides rápidos; enquanto a suplementação de 5M DHA mais catalase (300U/mL) não mostrou o efeito benéfico potencializado esperado, indicando que esse antioxidante parece ter toxicidade para o espermatozoide na concentração utilizada em nosso experimento. Finalmente, 5M DHA associado a vitamina E (0,6mM) mais catalase (300U/mL), não aumentou a qualidade da cinética e estrutura espermáticas, mas melhorou a resistência ao estresse oxidativo.

Abstract: The imbalance between the antioxidant capacity and the production of reactive oxygen species (ROS), also known as oxidative stress (EO), can be extremely harmful to mammalian sperm. This cell is highly susceptible to EO due to its reduced cytoplasm and consequent limitation on the enzymatic antioxidant reserve. In addition, sperm exhibit a large amount of polyunsaturated fatty acids (PUFAs), which confer fluidity to the plasm membrane, playing an important role in the fertilization processes. Also, PUFAs are known to protect the sperm during the cryopreservation process. However, PUFAs are easily oxidized and vulnerable to lipid peroxidation. Based on these statements, treatment with polyunsaturated fatty acids during cryopreservation seems to be an interesting therapy. However, it seems plausible to associate this therapy with an antioxidant treatment to prevent exacerbated lipid peroxidation. Therefore, the objective of this study was to associate the antioxidant treatment with docosaexaenoic acid (DHA) supplementation to the cryopreservation extender of canine semen. Towards this aim, two experiments were developed aiming to improve the quality of cryopreserved semen. For both experiments, semen samples of eight healthy and sexually mature dogs were collected. Post-thaw semen evaluations consisted of motility, plasma and acrosome membrane integrity, DNA status, mitochondrial activity and function, and susceptibility of lipid peroxidation. In the first study, we aimed to assess which ROS is the most deleterious for canine semen in the absence of seminal plasma (condition required for the cryopreservation). This was performed in order to define the ideal antioxidant for semen cryopreservation. Therefore, semen samples were incubated with different oxidative induction challenges (superoxide anion [O2-], hydrogen peroxide [H2O2], hydroxyl radical [OH-] and malondialdehyde [MDA]) in the presence or absence of seminal plasma (PS). Semen with PS had a mitochondrial function preserved against ROS. However, in the absence of PS, H2O2 reduced the potential of the mitochondrial membrane. Moreover, regardless of the PS, H2O2 was deleterious for the sperm kinetics and for the plasmatic/acrossomal membranes, and OH- reduced mitochondrial activity and increased DNA fragmentation. However, PS samples were more resistant to lipid peroxidation. The second study was performed by testing DHA in three different concentrations. Ejaculates were divided into four groups: control, 1M, 5M and 10M DHA added to the semen extender. Samples were cryopreserved, thawed and analyzed. Significant differences were found between the control group and 1M, with the latter presenting lower values for progressive motility and rapid spermatozoa; the 5M group showed higher values of slow and lower percentage of static sperm; the group 10M presented higher values for static sperm. Therefore, we selected the concentration of 5M DHA to associate with the antioxidants catalase and vitamin E in the extender (specific for OH- and the H2O2, respectively), based on the first study. Antioxidants were added to the semen extender and divided into four groups (all containing 5M DHA): control, vitamin E, catalase and vitamin E plus catalase. Samples were cryopreserved, thawed and evaluated. The results showed that 5M of DHA plus vitamin E (0,6mM) had beneficial effects on the sperm kinetic characteristics, such as mean route velocity (VAP), linear velocity (VSL), motility, progressive motility and percentage of rapid sperm. On the other hand, 5M of DHA associated with vitamin E (0,6mM) plus catalase (300u/ML), did not increase the quality of the kinetics and spermatic structure, but improved the resistance to oxidative stress.

EFEITO DA PENTOXIFILINA NA FUNÇÃO TESTICULAR E PRODUÇÃO ESPERMÁTICA DE EQUINOS SUBMETIDOS A ESTRESSE TÉRMICO ESCROTAL

O presente estudo propõe avaliar o efeito do tratamento oral com pentoxifilina sobre a qualidade seminal, morfometria, histologia e expressão gênica testicular de garanhões submetidos ao estresse térmico escrotal. Além disso, objetiva testar a eficiência de novo método de aquecimento escrotal na espécie equina. Para isso 14 garanhões foram divididos em três grupos: Controle (CT, n=4), Degenerado (DG, n=5) e Degenerado Tratado (PTX, n=5). O insulto térmico escrotal foi realizada utilizando uma bolsa térmica acoplada a uma fonte de ar aquecido a 50º C, durante uma hora no início da manhã e uma hora no final da tarde, no D-1 e D0. Um dia após o insulto (D1), o tratamento com 17 mg/kg pentoxifilina oral, a cada 12 h, foi iniciado e conduzido por 30 dias. Os animais foram coletados duas vezes por semana do D-24 ao D60 e o sêmen avaliado quanto a cinética, morfologia espermática, integridade de membrana plasmática, geração do ânion superóxido intracelular e mitocondrial, índice de peroxidação lipídica e índice de caspases ativadas 3 e 7. No D30 e D60 biópsias testiculares foram realizadas e as amostras destinadas a histopatologia, e ao RT-qPCR, quanto a resposta a apoptose, choque térmico e estresse oxidativo. As medidas testiculares de comprimento, altura e largura foram mensuradas utilizando paquímetro, e o volume testicular relativo foi calculado, uma vez por semana do D-5 ao D60. Dentre os resultados obtidos, o método de estresse térmico escrotal utilizado se mostrou eficiente em induzir degeneração testicular em garanhões. O tratamento com a pentoxifilina apresentou efeito benéfico no sêmen quanto a motilidade total e porcentagem de espermatozoides rápidos. Além disso, minimizou a peroxidação lipídica, previniu a ativação de mecanismos de apoptose nos espermatozoides, e reduziu o número de defeitos espermáticos (defeitos totais, maiores, de cabeça, presença de células germinativas e formas teratológicas). Na avaliação histológica, o fármaco promoveu redução dos danos causados pelo calor no D60, como uma menor presença de ondulação da lâmina basal refletindo uma menor atrofia dos túbulos seminíferos no entanto, não foi eficiente em prevenir o aparecimento de lesões, como o edema intesticial, vacuolizaçao de células germinativas, ausência de espermatozoides e aumento da luz dos túbulos seminíferos. Os efeitos benéficos da pentoxifilina podem ser atribuídos à inibição da apoptose em células germinativas observada aos 30 e 60 dias pós-insulto térmico e à ativação de mecanismos de proteção celular em resposta ao choque térmico. No entanto, mais estudos, quanto a dose e tempo de uso da pentoxifilina, são necessários para se alcançar melhores respostas no tratamento da degeneração testicular em equinos.

The objectives of this study are to evaluate the effect of oral treatment with pentoxifylline on seminal quality, morphometry, histology, and gene expression in the testicle of stallions thermal-induced. In addition, it aims to investigate the efficiency of a new method of scrotal heating. For this, 14 stallions were divided into three groups: Control (CT, n = 4), Degenerate (DG, n = 5) and Degenerate Treated (PTX, n = 5). The scrotal heating was induced by a thermal bag attached to an air source at 50 ° C, for an hour in the early morning and an hour in the late afternoon, on D-1 and D0. One day after the insult (D1), treatment with oral pentoxifylline (17mg/Kg) every 12 hours was initiated and carried out for 30 days. Twice-a-week semen collections were performed from D24 to D60 and semen was evaluated for kinetics, morphology, plasma membrane integrity, generation of intracellular and mitochondrial superoxide anion, lipid peroxidation index and activated caspase 3 and 7 index. In D30 and D60 testicular biopsies were carried out and the samples destined to histopathology and to RT-qPCR, regarding the response to apoptosis, heat-shock and oxidative stress. Testicular length, height and width were measured, using a caliper, and the relative testicular volume were calculated once a week from D5 to D60. Among the results obtained, the scrotal thermal stress method used was efficient in inducing testicular degeneration in stallions. Treatment with pentoxifylline showed a beneficial effect on semen in terms of total motility and percentage of rapid sperm. In addition, it minimized the lipid peroxidation, the activation of apoptosis mechanisms in sperm and caused decreased number of sperm defects (total, major and head defects, the presence of germ cells and teratological forms). In the histological evaluation, the drug led to a reduction of heat damage in D60, as a lower presence of basal membrane undulation - reflecting less atrophy of the seminiferous tubules - however, the drug was not effective in preventing the onset of lesions such as interstitial edema, germ cell vacuolation, absence of sperm, and increased lumen of the seminiferous tubules. These effects can be related to the inhibition of apoptosis in germ cells at 30 and 60 days after thermal insult and the activation of the cellular protection mechanism in response to heat shock. However, more studies about the dose and time of the use of pentoxifylline are needed to achieve better responses in the treatment of testicular degeneration in horses.

ÓLEOS ESSENCIAIS DE PLANTAS COMO ALTERNATIVA AOS FÁRMACOS CONVENCIONAIS NA PRODUÇÃO DE PEIXES

Os óleos essenciais (OE) obtidos de plantas são uma grande fonte de novas moléculas e vêm sendo estudados como alternativas aos fármacos convencionais no controle de enfermidades, como moduladores da resposta imune e como novos agentes promotores de crescimento em peixes. O objetivo deste estudo foi avaliar o potencial de aplicação de diferentes OEs, provenientes das plantas Ocimum americanum (OA), Ocimum gratissimum (OG), Hesperozygis ringens (HR), Cymbopogon flexuosus (CF) e Melaleuca alternifolia (MA) no controle de doenças e como imunomoduladores e promotores de crescimento em peixes das espécies Rhamdia quelen e Sciaenops ocellatus. Os OEs de OA, OG e HR apresentaram atividade fraca a moderada in vitro contra a bactéria A. hydrophila, no entanto, inibiram significativamente a atividade hemolítica provocada pela bactéria em eritrócitos de peixes. O OE de OA também apresentou atividade antiparasitária in vitro e in vivo contra o parasito monogenético Gyrodactylussp. Invitro, os OEs de OA, CF e MA estimularam a produção de ânion superóxido (O2 -) em leucócitos de S. ocellatus(macrófagos renais e/ou leucócitos do sangue). O uso in vivo dos OEs de OA e HR promoveu a sobrevivência de R. quelen infectados por A.hydrophila, bem como, apresentou potencial modulador da resposta imune inata em ambas as espécies de peixes estudadas: após exposição por meio de banhos (R. quelen) ou adicionado à dieta (OA em S. ocellatus). Fitoterápicos tais como os OEs se mostram como alternativas seguras na produção de peixes por serem produtos naturais e biodegradáveis contribuindo na redução da utilização de fármacos convencionais e pesticidas.

The essential oils (EO) obtained from plants are a major source of new molecules and have been studied as alternatives to conventional drugs in the treatment of diseases, as immune response modulators and as new growth promoters in fish. The aim of this study was to evaluate the potential use of different EOs from the plants Ocimum americanum (OA), Ocimum gratissimum (OG), Hesperozygis ringens (HR), Cymbopogon flexuosus (CF) and Melaleuca alternifolia (MA) in the control of diseases, as immunomodulators and as growth promoters in the fish species Rhamdia quelen and Sciaenops ocellatus. The EOs from OA, OG and HR showed weak to moderate activity in vitro against the bacterium A. hydrophila, however, they significantly inhibited the hemolytic activity caused by this bacterium in fish erythrocytes. The EO of OA also presented antiparasitic activity in vitroand in vivoagainst the monogenean parasite Gyrodactylussp. The EOs from OA, CF and MA were capable of triggering (in vitro) superoxide anion (O2 -) production in S. ocellatusleukocytes (head-kidney macrophages and/or blood leukocytes). The use of the OA and HR EOs in vivo promoted survival of R. queleninfected with A. hydrophila, as well asshowed potential as modulator of the innate immune response in both studied fish species: after exposure through baths (R. quelen) or added to the diet (OA in S. ocellatus). Herbal products such as EOs appear as safe alternatives in fish production because they are natural and biodegradable products, contributing to the reduced use of conventional drugs and pesticides.

Degranulação de neutrófilos ex-vivo por ação do polímero de amido de mandioca

The neutrophils play an essential role in host defenses against infection. When stimulated it responds with an increase of consumption of oxygen known as 'respiratory burst', so generating a great quantity of superoxide anion and hydrogen peroxide, which play an important function antimicrobial, and subsequent degranulation of neutrophils. Polymers are materials largely used in veterinary medicine. Several studies have been carried out to find new polymers and their biocompatibility to medical use. One polymer of cassava's starch (Manihot esculenta crantz) was developed at the Paranaense University's Laboratory of Chemistry - Campus Umuarama City, aiming to analyze the neutrophils degranulation after exposition to this starch. The early results showed a bioinert action of the polymer of cassava's starch on different concentrations when it was in contact with neutrophils. Thus, this material is potentially indicated as biomaterial.

Os neutrófilos têm papel essencial na defesa do hospedeiro contra infecções. Quando estimulados respondem com aumento do consumo de oxigênio denominado "explosão respiratória", que gera grande quantidade de ânion superóxido e peróxido de hidrogênio, os quais desempenham importante função antimicrobiana, e subsequente degranulação de neutrófilos. Os polímeros são materiais amplamente utilizados em medicina veterinária. Vários estudos vêm sendo realizados na busca de novos polímeros e sua biocompatibilidade para uso médico. Um polímero de amido de mandioca (Manihot esculenta crantz) foi produzido no Laboratório de Química da Universidade Paranaense - Campus Umuarama, com objetivo de analisar a possibilidade de ocorrer degranulação de neutrófilos quando expostos ao amido. Os resultados iniciais mostraram uma ação bioinerte do polímero de amido de mandioca em diferentes concentrações quando colocado junto com neutrófilos. Dessa forma, este material tem aplicação potencial em biomateriais.

Degranulação de neutrófilos ex-vivo por ação do polímero de amido de mandioca

The neutrophils play an essential role in host defenses against infection. When stimulated it responds with an increase of consumption of oxygen known as 'respiratory burst', so generating a great quantity of superoxide anion and hydrogen peroxide, which play an important function antimicrobial, and subsequent degranulation of neutrophils. Polymers are materials largely used in veterinary medicine. Several studies have been carried out to find new polymers and their biocompatibility to medical use. One polymer of cassava's starch (Manihot esculenta crantz) was developed at the Paranaense University's Laboratory of Chemistry - Campus Umuarama City, aiming to analyze the neutrophils degranulation after exposition to this starch. The early results showed a bioinert action of the polymer of cassava's starch on different concentrations when it was in contact with neutrophils. Thus, this material is potentially indicated as biomaterial.

Os neutrófilos têm papel essencial na defesa do hospedeiro contra infecções. Quando estimulados respondem com aumento do consumo de oxigênio denominado "explosão respiratória", que gera grande quantidade de ânion superóxido e peróxido de hidrogênio, os quais desempenham importante função antimicrobiana, e subsequente degranulação de neutrófilos. Os polímeros são materiais amplamente utilizados em medicina veterinária. Vários estudos vêm sendo realizados na busca de novos polímeros e sua biocompatibilidade para uso médico. Um polímero de amido de mandioca (Manihot esculenta crantz) foi produzido no Laboratório de Química da Universidade Paranaense - Campus Umuarama, com objetivo de analisar a possibilidade de ocorrer degranulação de neutrófilos quando expostos ao amido. Os resultados iniciais mostraram uma ação bioinerte do polímero de amido de mandioca em diferentes concentrações quando colocado junto com neutrófilos. Dessa forma, este material tem aplicação potencial em biomateriais.

Degranulação de neutrófilos ex-vivo por ação do polímero de amido de mandioca

The neutrophils play an essential role in host defenses against infection. When stimulated it responds with an increase of consumption of oxygen known as 'respiratory burst', so generating a great quantity of superoxide anion and hydrogen peroxide, which play an important function antimicrobial, and subsequent degranulation of neutrophils. Polymers are materials largely used in veterinary medicine. Several studies have been carried out to find new polymers and their biocompatibility to medical use. One polymer of cassava's starch (Manihot esculenta crantz) was developed at the Paranaense University's Laboratory of Chemistry - Campus Umuarama City, aiming to analyze the neutrophils degranulation after exposition to this starch. The early results showed a bioinert action of the polymer of cassava's starch on different concentrations when it was in contact with neutrophils. Thus, this material is potentially indicated as biomaterial.

Os neutrófilos têm papel essencial na defesa do hospedeiro contra infecções. Quando estimulados respondem com aumento do consumo de oxigênio denominado "explosão respiratória", que gera grande quantidade de ânion superóxido e peróxido de hidrogênio, os quais desempenham importante função antimicrobiana, e subsequente degranulação de neutrófilos. Os polímeros são materiais amplamente utilizados em medicina veterinária. Vários estudos vêm sendo realizados na busca de novos polímeros e sua biocompatibilidade para uso médico. Um polímero de amido de mandioca (Manihot esculenta crantz) foi produzido no Laboratório de Química da Universidade Paranaense - Campus Umuarama, com objetivo de analisar a possibilidade de ocorrer degranulação de neutrófilos quando expostos ao amido. Os resultados iniciais mostraram uma ação bioinerte do polímero de amido de mandioca em diferentes concentrações quando colocado junto com neutrófilos. Dessa forma, este material tem aplicação potencial em biomateriais.

Atividade antioxidante de macrófagos alveolares em ratos endotoxêmicos / Anti-oxidative activity of alveolar macrophages in endotoxemic rats

Avaliou-se o efeito da endotoxemia sobre a atividade antioxidante de macrófagos alveolares em ratos da linhagem Wistar. Foram utilizados 24 ratos machos, com idade entre 90 e 120 dias, os quais foram divididos em dois grupos: controle e endotoxêmico. O grupo endotoxêmico foi submetido à injeção intraperitonial de lipopolissacarídio na dose de 1mg/kg de peso corporal. Após 24 h, coletou-se sangue para contagem total e diferencial de leucócitos; lavado broncoalveolar para contagem total e diferencial dos leucócitos e, a partir de macrófagos isolados deste lavado, foram realizadas as dosagens de superóxido e superóxido dismutase. A endotoxemia aumentou a contagem total de leucócitos e o número de neutrófilos no sangue periférico, no lavado broncoalveolar, e aumentou a produção de superóxido sem modificar a produção da superóxido dismutase. Esses resultados sugerem que a endotoxemia induz a uma resposta inflamatória no pulmão. Contudo, não altera a atividade antioxidante em ratos adultos. Tal fato potencializa a resposta contra agentes infecciosos pelo hospedeiro, mas também pode contribuir na patogênese de injúria pulmonar.(AU)

The effects of endotoxemia on the antioxidant activity in alveolar macrophages of Wistar rats were evaluated. Twenty-four male rats, 90-120 days of age, were separated into 2 groups: control and endotoxemic. To the endotoxemic animals was administered, intraperitoneally, a lipopolyssaccaride at dosage of 1mg/kg body weight. Twenty-four hours after this procedure, blood was collected for total and differential leukocytes counts. In addition, bronchoalveolar lavage was collected for total and differential leukocyte counting. From this lavage macrophages were isolated for the dosage of superoxide and superoxide dismutase. The endotoxemia increased the total leukocyte counts and the number of neutrophils in the peripheral blood and bronchoalveolar lavage of the rats. There was an increased superoxide production without changing the superoxide dismutase. Our findings indicate that endotoxemia induces lung inflammatory response. However, it does not alter the antioxidant activity in adult rats. This fact not only enhances host response against infectious agents, but might also contribute to the pathogenesis of pulmonary injury.(AU)

Avaliação da influência do meio ambiente do sistema de berçário na imunidade inata de Camarões Litopenaeus vannamei (Boone, 1931) / Evaluation of the influence of the environment of the nursery system in innate immunity of shrimps, Litopenaeus vannamei (Boone, 1931)

A aquicultura sofre diferentes pressões por um lado o impacto que as doenças causam na produção, e por outro a pressão por parte de grupos ambientalistas e do governo devido ao impacto ambiental. Diferentes soluções foram propostas para esses problemas como probióticos e imunoestimulantes para prevenir e controlar doenças com nenhum ou algum sucesso. Outra opção seria o biofloco para minimizar o impacto ambiental, com excelentes resultados zootécnicos. Porém não sabemos se o sistema de biofloco estimula ou inibe o sistema imune de camarões (Litopenaeus vannamei). Esse é o objetivo desse estudo, saber se o sistema de biofloco altera a contagem total e diferencial de hemócitos, os índices fagocíticos, utilizando ensaio de fagocitose in vitro com Sacaromises cerevisae e a produção de ânion superóxido pelo ensaio de Nitroblue tetrazolium (NBT). Na contagem total de hemócitos nos 2 primeiros meses os animais criados em água clara possuem uma contagem maior que os criados em biofloco enquanto que no 4° mês os animais de biofloco possuem uma contagem maior. Na contagem diferencial no 4°mês as células hialinas estão em maior porcentagem nos animais criados em biofloco enquanto que as granulares e simi-granulares estão em menor porcentagem nesses animais, quando comparamos com os animais criados em água clara. Os índices fagocíticos e a produção de ânion superóxido não apresentam diferença entre os animais criados em água clara e os criados em biofloco.

The aquaculture production suffers different pressure in one hand disease, and in the other its environment impact. Different solutions are offered to solve this problems such as probiotics and immunostimulant to prevent and control the diseases with some or no success. Another option is the biofloc to minimize its environmental impact, with excellent results to zootechincal characteristics. But it is not known whether biofloc stimulate or inhibits the shrimp (Litopenaeus vannamei) immune system. That is what our study aim to answer if the biofloc system affects or not the total and differential hemocytes count, the phagocityc indexes of in vitro phagocytosis with Sacaromises cerevisae and the production of superoxide anion with the Nitroblue Tetrazolium (NBT) assay. At the first 2 month the animal rare in clear water had a higher total hemocyte count, while it was higher in the animals rare in the biofloc at the 4th month. At the 4th month the hyalines cells had a higher concentration in animals rare at biofloc system, while the granular and semi-granular cells had a lower concentration in this animals when compared with the ones rare at the clear water system. The phagocityc indexes and the production of superoxide anion did not have any difference between animals rare at clear water system and biofloc system.

Avaliação da influência do meio ambiente do sistema de berçário na imunidade inata de Camarões Litopenaeus vannamei (Boone, 1931) / Evaluation of the influence of the environment of the nursery system in innate immunity of shrimps, Litopenaeus vannamei (Boone, 1931)

A aquicultura sofre diferentes pressões por um lado o impacto que as doenças causam na produção, e por outro a pressão por parte de grupos ambientalistas e do governo devido ao impacto ambiental. Diferentes soluções foram propostas para esses problemas como probióticos e imunoestimulantes para prevenir e controlar doenças com nenhum ou algum sucesso. Outra opção seria o biofloco para minimizar o impacto ambiental, com excelentes resultados zootécnicos. Porém não sabemos se o sistema de biofloco estimula ou inibe o sistema imune de camarões (Litopenaeus vannamei). Esse é o objetivo desse estudo, saber se o sistema de biofloco altera a contagem total e diferencial de hemócitos, os índices fagocíticos, utilizando ensaio de fagocitose in vitro com Sacaromises cerevisae e a produção de ânion superóxido pelo ensaio de Nitroblue tetrazolium (NBT). Na contagem total de hemócitos nos 2 primeiros meses os animais criados em água clara possuem uma contagem maior que os criados em biofloco enquanto que no 4° mês os animais de biofloco possuem uma contagem maior. Na contagem diferencial no 4°mês as células hialinas estão em maior porcentagem nos animais criados em biofloco enquanto que as granulares e simi-granulares estão em menor porcentagem nesses animais, quando comparamos com os animais criados em água clara. Os índices fagocíticos e a produção de ânion superóxido não apresentam diferença entre os animais criados em água clara e os criados em biofloco. (AU)

The aquaculture production suffers different pressure in one hand disease, and in the other its environment impact. Different solutions are offered to solve this problems such as probiotics and immunostimulant to prevent and control the diseases with some or no success. Another option is the biofloc to minimize its environmental impact, with excellent results to zootechincal characteristics. But it is not known whether biofloc stimulate or inhibits the shrimp (Litopenaeus vannamei) immune system. That is what our study aim to answer if the biofloc system affects or not the total and differential hemocytes count, the phagocityc indexes of in vitro phagocytosis with Sacaromises cerevisae and the production of superoxide anion with the Nitroblue Tetrazolium (NBT) assay. At the first 2 month the animal rare in clear water had a higher total hemocyte count, while it was higher in the animals rare in the biofloc at the 4th month. At the 4th month the hyalines cells had a higher concentration in animals rare at biofloc system, while the granular and semi-granular cells had a lower concentration in this animals when compared with the ones rare at the clear water system. The phagocityc indexes and the production of superoxide anion did not have any difference between animals rare at clear water system and biofloc system. (AU)

Efeito da adição de antioxidantes enzimáticos na criopreservação do sêmen caprino / Effect of enzymatic antioxidants on goat cryopreserved semen

A caprinocultura no Brasil vem crescendo consideravelmente nos últimos anos. No entanto, este crescimento é limitado pela qualidade espermática pós-descongelamento, o que inviabilizaria a utilização de biotecnologias aplicadas à reprodução (e.g., inseminação artificial e transferência de embriões). Um dos motivos para a queda na qualidade espermática pós-descongelação é o ataque das espécies reativas de oxigênio (ROS), que podem levar a danos em membrana, acrossomo, mitocôndria e DNA. Uma alternativa para a melhora na qualidade espermática de amostras criopreservadas de caprinos seria o tratamento do meio diluidor com a antioxidantes. No entanto, é fundamental identificar a espécie reativa de oxigênio mais deletéria ao sêmen de caprinos para determinar o antioxidante ideal. O objetivo do presente estudo foi identificar a ROS mais deletéria ao sêmen de caprinos e, com isso, tratar o diluidor com antioxidantes específicos para a destruição da mesma. No experimento 1, amostras espermáticas de 12 bodes foram submetidas á incubação com 3 sistemas de produção de ROS e um subproduto da peroxidação de lipídeos, conhecida por também levar a danos oxidativos. As amostras espermáticas foram submetidas a incubação com xantina (20mM) e xantina oxidase (ânion superóxido), sulfato de ferro (4mM) e ascorbato (20mM- Radical hidroxila), peróxido de hidrogênio (H2O2; 20 mM) e malondialdeído (20 mM). Após a incubação as amostras espermáticas foram avaliadas quanto a morfologia, motilidade, membrana (eosina/nigrosina), acrossomo (Rosa Bengala/ Fast Green), mitocôndria (3,3 diaminobenzidina) e substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS, avalia a susceptibilidade do espermatozóide ao estresse oxidativo). Os resultados do experimento 1 indicaram que a ROS mais deletéria ao espermatozóide caprino é o H2O2, que levou a danos de membrana plasmática e mitocôndria. Assim, no Experimento 2, o diluidor para a criopreservação do sêmen caprino foi suplementado com catalase e Glutationa Peroxidase (GPx), antioxidantes enzimáticos responsáveis pela destruição do H2O2. A análise estatística dos dois experimentos foi realizada através do SAS system for Windows. Os resultados do experimento 2 não revelaram efeitos benéficos para nenhuma das variáveis e com a utilização de ambos os antioxidantes. De fato, a catalase apreesntou efeitos deletérios à membrana plasmática das amostras criopreservadas com 240 UI/mL de catalase quando comparadas ao controle (13,42±2,96% e 25,08±4,80% de espermatozóides com membrana íntegra, respectivamente). De fato, estudos anteriores indicam que as concentrações de catalase em sêmen de caprinos são extremamente baixas, o que indicaria que o tratamento com as dosagens utilizadas de catalase pode ter sido excessivo. Além disto, diferentes antioxidantes aparentemente atuam em diferentes regiões do espermatozóide, sendo que, apenas a combinação de diferentes antioxidante poderia ser eficiente. Por outro lado, os resultados do Experimento 1 foram obtidos em amostras frescas, sendo que provavelmente, em amostras criopreservadas, a espécie reativa mais deletéria poderia ser outra

The goat production in Brazil has grown considerably in recent years. However, this growth is limited by the post-thaw sperm quality, which would impais the use of biotechnologies applied to reproduction (e.g., artificial insemination and embryo transfer). One reason for the decline in sperm quality after thawing is the attack of reactive oxygen species (ROS), which can lead to damage of membrane, acrosome, mitochondria and DNA. An alternative to improve the quality of cryoprerved goat sperm samples would be the treatment of the extender with antioxidants. However, it is crucial to identify the reactive oxygen species more deleterious to semen of goats to determine the ideal antioxidant. The aim of this study was to identify the ROS more deleterious to semen of goats and thereby to treat the extender with specific antioxidants for the destruction of this ROS. In experiment 1, sperm samples from 12 goats were incubated with 3 systems of production of ROS and a by-product of lipid peroxidation, known to also lead to oxidative damage. The sperm samples were subjected to incubation with xanthine (20 mM) and xanthine oxidase (superoxide anion), iron sulfate (4 mM) and ascorbate (20mM-hydroxyl radical), hydrogen peroxide (H2O2, 20 mM) and malondialdehyde (20 mM). After incubation the samples were evaluated for sperm morphology, motility, membrane (eosin / nigrosin), acrosome (Rose Bengal / Fast Green), mitochondria (3.3 diaminobenzidine) and thiobarbituric acid reactive substances (TBARS, assesses the susceptibility of sperm to oxidative stress). The results of experiment 1 indicated that ROS most deleterious to the goat sperm is the H2O2, especially due to damages to the plasma membrane and mitochondria. Thus, in Experiment 2, the extender for cryopreservation of goat semen was supplemented with catalase and glutathione peroxidase (GPx), enzymatic antioxidants responsible for the destruction of H2O2. Statistical analyses were performed using the SAS system for Windows. The results of experiment 2 revealed no beneficial effects of the use of neither catalase oor GPx. In fact, catalase showed deleterious effects on the plasma membrane of cryopreserved samples; Samples treated with 240 IU / mL of catalase showed a lower percentage of sperm with intact membrane when compared with controls (13.42 ± 2.96 ± 4.80% and 25.08%, respectively ). In fact, previous studies indicate that concentrations of catalase in semen of goats are very low, which indicates that catalase treatment with the dosages used in the present study may have been excessive. Apparently different antioxidants work in different regions of the sperm, and only the combination of different antioxidant could be effective. Moreover, the results of Experiment 1 were obtained in fresh samples, and probably, in cryopreserved samples, other ROS could be the most deleterious

Influência da suplementação com citamina E(dl-alfa tocoferol) nas funções de monócitos e polimorfonucleares de eqüinos da raça Árabe submetidos ao exercício físico

A alteração biológica mais evidente observada durante o exercício físico é o aumento da taxa metabólica, com elevada demanda de oxigênio, que pode aumentar a formação de espécies reativas de oxigênio (ROS) potencialmente danosas ao organismo, ocorrendo lipoperoxidação como conseqüência. Foi desenvolvido um método de isolamento simultâneo de células mononucleares e polimorfonucleares de sangue periférico eqüino, utilizando gradiente descontínuo de ficoll-hipaque d=1,077 e d=1,119. A separação de ambos os tipos celulares resultou em alto grau de pureza e viabilidade. Foram avaliadas funções de monócitos e polimorfonucleares em eqüinos da raça Árabe suplementados com vitamina E comparando-se com um grupo controle em duas provas de exercício progressivo em esteira de alta velocidade antes e depois de serem submetidos a um protocolo de treinamento. Os resultados indicam que o treinamento e a suplementação com vitamina E preservaram as funções dos monócitos eqüinos quanto à geração de anion superóxido (O2 -), peróxido de hidrogênio (H2O2), óxido nítrico (NO) e fator de necrose tumoral alfa (TNF-a) ao mesmo tempo em que preveniram a produção exacerbada dessas substâncias. Enquanto as produções de H2O2 e O2 - por polimorfonucleares pelo grupo de animais suplementados foram mais elevadas. Isso indica a exacerbação desta função dos polimorfonucleares dos eqüinos pela vitamina E antes e após a prova de exercício físico em esteira de alta velocidade. A vitamina E suplementar na dieta promoveu menor formação de malondialdeído (MDA), ou seja, ocorreu atenuação da lesão oxidativa

The clearest biological alteration observed during physical exercise is the increase of metabolic rate, with a high oxygen demand. It can increase the reactive oxygen species (ROS) formation potentially harmful to the organism, occurring lipoperoxidation as a result. It was developed a method of simultaneous separation of peripheral blood mononuclear and polymorphonuclear cells in horse utilizing discontinuous Ficoll-Hypaque gradients d=1,077 and d=1,119. Both cells types isolation resulted in high purity and viability degree. It was evaluated functions in monocytes and polymorphonuclear cells in Arabian horses supplemented with vitamin E by comparing a control group in two incremental treadmill exercises before and after been submitted to a training protocol. Results indicated that training and vitamin E supplementation preserved the monocyte functions regarding superoxide anion generation (O2 -), hydrogen peroxide (H2O2), nitric oxide (NO) and tumor necrosis factor alpha (TNF-a) at the same time that they prevented an excessive production of those substances. Whereas H2O2 e O2 - productions by polymorphonuclear cells in supplemented animals group were higher. It indicates an exacerbation of that horse polymorphonuclear cells function by vitamin E before and after incremental treadmill exercises. Supplementary vitamin E in the diet promoted a lower malondialdeide (MDA) formation, namely occurred attenuation in oxidative stress