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Tese em Português | VETTESES | ID: vtt-216622

Resumo

Resumo: O desequilíbrio entre a capacidade antioxidante e a produção de espécies reativas de oxigênio (EROs), também conhecido como estresse oxidativo (EO), pode ser extremamente prejudicial aos espermatozoides. Essa célula é altamente susceptível ao EO devido ao seu citoplasma reduzido e consequente limitação na reserva antioxidante citoplasmática. Além disso, os espermatozoides exibem em sua membrana uma grande quantidade de ácidos graxos polinsaturados (PUFAs), facilmente oxidadas e vulneráveis a peroxidação lipídica. Por outro lado, esses ácidos graxos, conferem fluidez a membrana plasmática, desempenhando um importante papel nos processos de fertilização além de proteger os espermatozoides durante a criopreservação. Com base nessas afirmações, o tratamento com ácidos graxos polinsaturados durante a criopreservação parece ser uma terapia interessante. No entanto, parece plausível associar essa terapia com um tratamento antioxidante para prevenir a exacerbada peroxidação lipídica. Portanto, o objetivo deste estudo foi associar o tratamento antioxidante com suplementação de PUFA, o ácido docosaexaenoico (DHA), ao diluidor para a criopreservação de sêmen canino. Para isso, foram desenvolvidos dois experimentos visando a melhora da qualidade do sêmen criopreservado, utilizando-se em ambos, o sêmen de oito cães saudáveis e sexualmente maduros e avaliações das amostras para motilidade, membrana plasmática e integridade acrossomica, integridade do DNA, atividade e função mitocondrial e susceptibilidade da peroxidação lipídica. No primeiro estudo avaliou-se a susceptibilidade espermática a diferentes desafios de indução oxidativa (ânion superóxido [O2-], peróxido de hidrogênio [H2O2], radical hidroxil [OH-]e malondialdeído [MDA]) na presença ou ausência de plasma seminal (PS). Sêmen com PS teve função mitocondrial preservada contra EROs. No entanto, na ausência de PS, H2O2 reduziu o potencial da membrana mitocondrial. Além do mais, independentemente do PS, H2O2 foi deletério para a cinética espermática e para as membranas plasmática/acrossomal, e OH- reduziu a atividade mitocondrial e aumentou a fragmentação do DNA. No entanto, amostras com PS foram mais resistentes para a peroxidação lipídica. O segundo estudo foi feito testando o DHA em três concentrações diferentes, para isso foi dividido em quatro grupos: controle, 1M, 5M e 10M DHA. Foram adicionados ao diluidor de sêmen, congelados, descongelados e analisados. Foram constatadas diferenças significativas entre o grupo controle e 1M, com este último apresentando menores valores para motilidade progressiva e espermatozoides rápidos; o grupo 5M obteve maiores valores de espermatozoides lentos e menores para espermatozoides estáticos e; o grupo 10M maiores valores para espermatozoides estáticos. Desta forma, selecionamos a concentração de 5M DHA para associar com os antioxidantes catalase e vitamina E no diluidor (que combatem o radical OH- e o H2O2, respectivamente), baseando-se no primeiro estudo. Foram adicionados ao diluidor de sêmen e divididos em quatro grupos (todos contendo 5m DHA): controle, vitamina E, catalase e vitamina E mais catalase. As amostras foram congelados, descongelados e avaliadas. Os resultados mostraram que 5M DHA mais vitamina E teve efeitos benéficos nas características cinéticas espermáticas, como velocidade média de percurso (VAP), velocidade linear (VSL), motilidade, motilidade progressiva e espermatozoides rápidos; enquanto a suplementação de 5M DHA mais catalase (300U/mL) não mostrou o efeito benéfico potencializado esperado, indicando que esse antioxidante parece ter toxicidade para o espermatozoide na concentração utilizada em nosso experimento. Finalmente, 5M DHA associado a vitamina E (0,6mM) mais catalase (300U/mL), não aumentou a qualidade da cinética e estrutura espermáticas, mas melhorou a resistência ao estresse oxidativo.

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Abstract: The imbalance between the antioxidant capacity and the production of reactive oxygen species (ROS), also known as oxidative stress (EO), can be extremely harmful to mammalian sperm. This cell is highly susceptible to EO due to its reduced cytoplasm and consequent limitation on the enzymatic antioxidant reserve. In addition, sperm exhibit a large amount of polyunsaturated fatty acids (PUFAs), which confer fluidity to the plasm membrane, playing an important role in the fertilization processes. Also, PUFAs are known to protect the sperm during the cryopreservation process. However, PUFAs are easily oxidized and vulnerable to lipid peroxidation. Based on these statements, treatment with polyunsaturated fatty acids during cryopreservation seems to be an interesting therapy. However, it seems plausible to associate this therapy with an antioxidant treatment to prevent exacerbated lipid peroxidation. Therefore, the objective of this study was to associate the antioxidant treatment with docosaexaenoic acid (DHA) supplementation to the cryopreservation extender of canine semen. Towards this aim, two experiments were developed aiming to improve the quality of cryopreserved semen. For both experiments, semen samples of eight healthy and sexually mature dogs were collected. Post-thaw semen evaluations consisted of motility, plasma and acrosome membrane integrity, DNA status, mitochondrial activity and function, and susceptibility of lipid peroxidation. In the first study, we aimed to assess which ROS is the most deleterious for canine semen in the absence of seminal plasma (condition required for the cryopreservation). This was performed in order to define the ideal antioxidant for semen cryopreservation. Therefore, semen samples were incubated with different oxidative induction challenges (superoxide anion [O2-], hydrogen peroxide [H2O2], hydroxyl radical [OH-] and malondialdehyde [MDA]) in the presence or absence of seminal plasma (PS). Semen with PS had a mitochondrial function preserved against ROS. However, in the absence of PS, H2O2 reduced the potential of the mitochondrial membrane. Moreover, regardless of the PS, H2O2 was deleterious for the sperm kinetics and for the plasmatic/acrossomal membranes, and OH- reduced mitochondrial activity and increased DNA fragmentation. However, PS samples were more resistant to lipid peroxidation. The second study was performed by testing DHA in three different concentrations. Ejaculates were divided into four groups: control, 1M, 5M and 10M DHA added to the semen extender. Samples were cryopreserved, thawed and analyzed. Significant differences were found between the control group and 1M, with the latter presenting lower values for progressive motility and rapid spermatozoa; the 5M group showed higher values of slow and lower percentage of static sperm; the group 10M presented higher values for static sperm. Therefore, we selected the concentration of 5M DHA to associate with the antioxidants catalase and vitamin E in the extender (specific for OH- and the H2O2, respectively), based on the first study. Antioxidants were added to the semen extender and divided into four groups (all containing 5M DHA): control, vitamin E, catalase and vitamin E plus catalase. Samples were cryopreserved, thawed and evaluated. The results showed that 5M of DHA plus vitamin E (0,6mM) had beneficial effects on the sperm kinetic characteristics, such as mean route velocity (VAP), linear velocity (VSL), motility, progressive motility and percentage of rapid sperm. On the other hand, 5M of DHA associated with vitamin E (0,6mM) plus catalase (300u/ML), did not increase the quality of the kinetics and spermatic structure, but improved the resistance to oxidative stress.

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