Alternative strategies for nuclear reprogramming in Somatic Cell Nuclear transfer (SCNT)

Twenty Years passed by since the production of Dolly the sheep, but despite significant technical progress has been achieved in the manipulation procedures, the proportion of offspring following transfer of SCNT embryos has remained almost unchanged in farm animals. Remarkable progress has been obtained instead in laboratory animals, particularly by Japanese Groups, in the mouse. However, the nuclear reprogramming strategies tested in mouse do not always work in farm animals, and others are difficult to be implemented, for require complicated molecular biology tools unavailable yet in large animals. In this review we put in contest the previous work done in farm and laboratory animals with recent achievements obtained in our laboratory, and we also indicate a road map to increase the reliability of SCNT procedures.

Alternative strategies for nuclear reprogramming in Somatic Cell Nuclear transfer (SCNT)

Twenty Years passed by since the production of Dolly the sheep, but despite significant technical progress has been achieved in the manipulation procedures, the proportion of offspring following transfer of SCNT embryos has remained almost unchanged in farm animals. Remarkable progress has been obtained instead in laboratory animals, particularly by Japanese Groups, in the mouse. However, the nuclear reprogramming strategies tested in mouse do not always work in farm animals, and others are difficult to be implemented, for require complicated molecular biology tools unavailable yet in large animals. In this review we put in contest the previous work done in farm and laboratory animals with recent achievements obtained in our laboratory, and we also indicate a road map to increase the reliability of SCNT procedures.(AU)

Determinação da Protamina 1 e Protamina 2 em touros de alta e de baixa fertilidade a campo

Os touros que são utilizados nas centrais de reprodução são considerados como normospérmicos, mas o rendimento a campo entre eles pode diferir em até 40%. Sugere-se que análises convencionais de sêmen não sejam capazes de predizer a capacidade fecundante real dos gametas, criando a necessidade de avaliar outros parâmetros que permitam identificar a fertilidade real dos touros. O status da cromatina espermática é relevante para a manutenção da fertilidade do espermatozoide, pois este carrega a informação genética paterna necessária para uma correta fertilização e o desenvolvimento embrionário subsequente. A cromatina espermática trata-se de uma estrutura composta por DNA ligada fortemente à PRM1 e PRM2. Entre os mamíferos, existe uma relação ideal (PRM1:PRM2) para uma adequada compactação do DNA espermático, caso contrário a fertilidade é comprometida. Em espermatozoides humanos e murinos, a expressão da PRM1 e PRM2 é relacionada com o nível de fertilidade. A protaminação dos espermatozoides bovinos era atribuída somente à Protamina 1 até a recente identificação da Protamina 2 em espermatozoides maduros. Portanto, este trabalho objetivou determinar as possíveis relações entre PRM1 e PRM2 em touros Nelore e Angus de diferente fertilidade a campo. Cada unidade experimental (touro) foi representada por um pool de 4 partidas diferentes e submetida ao ensaio de suscetibilidade da cromatina espermática (SCSA modificado), teste de Cromomicina A3 (CMA3) e quantificação absoluta dos transcritos para os genes PRM1, PRM2 e TNP1 por meio de qPCR. Os resultados demonstraram que não houve diferença significante entre os grupos de alta e baixa fertilidade para nenhuma das raças para as análises consideradas. Dentro do grupo dos Nelore, a quantificação absoluta do número de cópias dos transcritos da PRM1 e PRM2 permitiu estabelecer uma relação PRM1:PRM2 de 1: 0,079 para o grupo de alta fertilidade e 1: 0,007 para os de baixa fertilidade. Nos Angus, foi observado uma relação 1: 0,27 para os touros de alta fertilidade e 1: 0,016 para os de baixa. Na sequência, foi realizada uma análise de interação entre raças, na qual os ejaculados dos touros Nelore apresentaram maior número de cópias de transcritos de PRM1 (Nelore=0,986±0,39; Angus=0,052±0,012) e de células com deficiência de protaminação (Nelore=0,259 ±0,033; Angus= 0,078 ±0,019). Contraditoriamente, os ejaculados dos touros Angus apresentaram maior quantidade de espermatozoides com suscetibilidade à fragmentação (Nelore=0,338±0,292; Angus= 1,7505±0,185). Foi observada uma relação entre PRM1:PRM2 de 1: 0,074 para os ejaculados dos touros Nelore e 1: 0,23 para os Angus. Os resultados observados neste trabalho não permitiram explicar a diferença de fertilidade entre touros de diferentes raças agrupados por fertilidade; no entanto, foram observadas diferenças na relação de transcritos de protamina (PRM1 e 2) nos espermatozoides de touros Nelore e Angus, que podem refletir no aparecimento de células com deficiência de protaminação e mais susceptíveis à fragmentação de DNA.

Bulls that are used in breeding centers are considered normospermic, despite the fertility rates can differ up to 40%. It is suggested that conventional semen analyzes are not able to predict the real fertilizing capacity of the spermatozoa, creating the need to evaluate other parameters that allow the identification of fertile bulls. The status of sperm chromatin is relevant for the maintenance of sperm fertility, as it carries the paternal genetic information, which is necessary for correct fertilization and subsequent embryonic development. Sperm chromatin is a structure composed of DNA tightly bound to PRM1 and PRM2. Among mammals, there is an ideal ratio (PRM1:PRM2) for an adequate compaction of sperm DNA, otherwise fertility is compromised. In human and murine sperm, the expression of PRM1 and PRM2 is related to the level of fertility. Protamine in bovine sperm was attributed only to Protamine 1 until the recent identification of Protamine 2 in mature sperm. Therefore, this work aimed to determine the possible relationships between PRM1 and PRM2 in Nellore and Angus bulls of different sire conception rates (SCR). Each experimental unit (bull) was represented by a "pool" of 4 different batches and submitted to the sperm chromatin susceptibility test (SCSA adapted), Chromomycin A3 analysis (CMA3) and absolute quantification of transcripts for PRM1, PRM2 and TNP1 genes through qPCR. High and low fertility groups were similar (p> 0,05) for all analysis considered, regardless of breed. Within the Nellore group, the absolute quantification of the copy number of the PRM1 and PRM2 transcripts allowed us to establish a PRM1:PRM2 ratio of 1:0.079 for the high fertility group and 1:0.007 for the low fertility group. In Angus, a ratio of 1:0.27 was observed for bulls with high fertility and 1:0.016 for the low fertility. Also, an interaction analysis between breeds was performed, in which the ejaculates of Nellore bulls had a higher number of copies of PRM1 transcripts (Nellore=0.986±0.396; Angus=0.052±0.012) and more cells with protamine deficiency (Nellore =0.259 ±0.033; Angus=0.078 ±0.019). In contrast, the ejaculates of Angus bulls had a greater amount of sperm with susceptibility to fragmentation (Nellore=0.338 ±0.292; Angus= 1.7505±0.185). A relationship between PRM1:PRM2 of 1:0.074 for the ejaculates from Nellore bulls and 1:0.23 from Angus bulls was observed. The results from this work could not explain the difference in fertility between bulls of different breeds grouped by fertility rate; however, we observed differences in the ratio of protamine transcripts (PRM1 and 2) in spermatozoa from Nellore and Angus bulls, which could reflect in the appearance of cells with protamine deficiency and more susceptible to DNA fragmentation.

Impaired protamination and sperm DNA damage in a Nellore bull with high percentages of morphological sperm defects in comparison to normospermic bulls / Deficiências de protaminação e danos de DNA no sêmen de um touro Nelore com elevada porcentagem de patologias espermáticas em comparação a touros normospérmicos

The routine semen evaluation assessing sperm concentration, motility and morphology, does not identify subtle defects in sperm chromatin architecture. Bulls appear to have stable chromatin, with low levels of DNA fragmentation. However, the nature of fragmentation and its impact on fertility remain unclear and there are no detailed reports characterizing the DNA organization and damage in this species. The intensive genetic selection, the use of artificial insemination and in vitro embryo production associated to the cryopreservation process can contribute to the chromatin damage and highlights the importance of sperm DNA integrity for the success of these technologies. Frozen-thawed semen samples from three ejaculates from a Nellore bull showed high levels of morphological sperm abnormalities (55.8±5.1%), and were selected for complementary tests. Damage of acrosomal (76.9±8.9%) and plasma membranes (75.7±9.3%) as well as sperm DNA strand breaks (13.8±9.5%) and protamination deficiency (3.7±0.6%) were significantly higher compared to the values measured in the semen of five Nellore bulls with normospermia (24.3±3.3%; 24.5±6.1%; 0.6±0.5%; 0.4±0.6% for acrosome, plasma membrane, DNA breaks and protamine deficiency, respectively) (P<0.05). Motility and percentage of spermatozoa with low mitochondrial potential showed no differences between groups. This study shows how routine semen analyses (in this case morphology) may point to the length and complexity of sperm cell damage emphasizing the importance of sperm function testing.(AU)

O exame de rotina de sêmen, o qual avalia a concentração de espermatozoides, a motilidade e a morfologia, pode não identificar defeitos sutis na arquitetura da cromatina de espermatozoides. Os touros parecem ter cromatina estável com baixos níveis de fragmentação do DNA. No entanto, a natureza da fragmentação e o seu impacto sobre a fertilidade ainda não estão claros e não há relatos que caracterizam a organização do DNA e os danos nessa espécie com mais detalhes. A seleção genética intensiva e o uso da inseminação artificial e da produção in vitro de embriões, além do processo de criopreservação, podem contribuir para o dano da cromatina, e sabe-se a importância da integridade do DNA espermático para o sucesso dessas tecnologias. Amostras de sêmen de três ejaculados de um touro Nelore com altos níveis de alterações morfológicas (55,8±5,1%) foram selecionadas para realização de exames complementares. Os danos de acrossoma (76,9±8,9%) e das membranas plasmáticas (75,7±9,3%), bem como quebras de fita de DNA de espermatozoides (13,8±9,5) e deficiência de protamina (3,7±0,6) foram significativamente maiores em comparação aos valores avaliados no sêmen de cinco touros Nelore com normospermia (24,3±3,3%; 24,5±6,1%; 0,6±0,5%; 0,4±0,6% para acrossoma, membrana plasmática, quebras de DNA e deficiência de protamina, respectivamente) (p<0,05). Motilidade e porcentagem de espermatozoides com baixo potencial mitocondrial não diferiram estatisticamente. Essas avaliações mostram que análises de sêmen de rotina (neste caso, morfologia) podem apontar para a extensão e a complexidade dos danos na célula espermática, o que indica que a deficiência de protamina e os danos no DNA podem ocorrer simultaneamente a defeitos morfológicos. Tal ocorrência enfatiza a importância das análises de sêmen clássicas e dos testes complementares.(AU)

Impaired protamination and sperm DNA damage in a Nellore bull with high percentages of morphological sperm defects in comparison to normospermic bulls / Deficiências de protaminação e danos de DNA no sêmen de um touro Nelore com elevada porcentagem de patologias espermáticas em comparação a touros normospérmicos

The routine semen evaluation assessing sperm concentration, motility and morphology, does not identify subtle defects in sperm chromatin architecture. Bulls appear to have stable chromatin, with low levels of DNA fragmentation. However, the nature of fragmentation and its impact on fertility remain unclear and there are no detailed reports characterizing the DNA organization and damage in this species. The intensive genetic selection, the use of artificial insemination and in vitro embryo production associated to the cryopreservation process can contribute to the chromatin damage and highlights the importance of sperm DNA integrity for the success of these technologies. Frozen-thawed semen samples from three ejaculates from a Nellore bull showed high levels of morphological sperm abnormalities (55.8±5.1%), and were selected for complementary tests. Damage of acrosomal (76.9±8.9%) and plasma membranes (75.7±9.3%) as well as sperm DNA strand breaks (13.8±9.5%) and protamination deficiency (3.7±0.6%) were significantly higher compared to the values measured in the semen of five Nellore bulls with normospermia (24.3±3.3%; 24.5±6.1%; 0.6±0.5%; 0.4±0.6% for acrosome, plasma membrane, DNA breaks and protamine deficiency, respectively) (P<0.05). Motility and percentage of spermatozoa with low mitochondrial potential showed no differences between groups. This study shows how routine semen analyses (in this case morphology) may point to the length and complexity of sperm cell damage emphasizing the importance of sperm function testing.(AU)

O exame de rotina de sêmen, o qual avalia a concentração de espermatozoides, a motilidade e a morfologia, pode não identificar defeitos sutis na arquitetura da cromatina de espermatozoides. Os touros parecem ter cromatina estável com baixos níveis de fragmentação do DNA. No entanto, a natureza da fragmentação e o seu impacto sobre a fertilidade ainda não estão claros e não há relatos que caracterizam a organização do DNA e os danos nessa espécie com mais detalhes. A seleção genética intensiva e o uso da inseminação artificial e da produção in vitro de embriões, além do processo de criopreservação, podem contribuir para o dano da cromatina, e sabe-se a importância da integridade do DNA espermático para o sucesso dessas tecnologias. Amostras de sêmen de três ejaculados de um touro Nelore com altos níveis de alterações morfológicas (55,8±5,1%) foram selecionadas para realização de exames complementares. Os danos de acrossoma (76,9±8,9%) e das membranas plasmáticas (75,7±9,3%), bem como quebras de fita de DNA de espermatozoides (13,8±9,5) e deficiência de protamina (3,7±0,6) foram significativamente maiores em comparação aos valores avaliados no sêmen de cinco touros Nelore com normospermia (24,3±3,3%; 24,5±6,1%; 0,6±0,5%; 0,4±0,6% para acrossoma, membrana plasmática, quebras de DNA e deficiência de protamina, respectivamente) (p<0,05). Motilidade e porcentagem de espermatozoides com baixo potencial mitocondrial não diferiram estatisticamente. Essas avaliações mostram que análises de sêmen de rotina (neste caso, morfologia) podem apontar para a extensão e a complexidade dos danos na célula espermática, o que indica que a deficiência de protamina e os danos no DNA podem ocorrer simultaneamente a defeitos morfológicos. Tal ocorrência enfatiza a importância das análises de sêmen clássicas e dos testes complementares.(AU)

CARACTERÍSTICAS DE CONDENSAÇÃO DA CROMATINA E MORFOMETRIA ESPERMÁTICA DE TOUROS DA RAÇA GIR

O objetivo deste estudo foi avaliar a qualidade espermática, compactação/integridade e deficiência de protamina da cromatina de espermatozoides, somado às características reprodutivas de acordo com a idade. Procurou-se avaliar a interferência da idade nas variáveis analisadas e a evolução das mesmas ao longo de quatro coletas mensais. Foram selecionados 43 touros de elite Bos taurus indicus da raça Gir com idades iniciais entre 18 e 42 meses e divididos em três grupos: jovens (18,5-24,7 meses de idade, n=15), jovens adultos (25,2-28,6 meses de idade, n=16) e adultos (29,1-42,0 meses de idade, n=12). Nessa primeira avaliação as características reprodutivas foram incluídas (Fertilidade, Classificação Andrológica por Pontos e Índice de Classificação de Touros). Em seguida 38 dos 43 touros foram divididos em 3 grupos (mesmas faixas etárias): jovens (n=12), jovens adultos (n=13) e adultos (n=13). Após descongelamento, as amostras foram submetidas às técnicas de coloração do azul de toluidina, para avaliar concomitantemente condensação/integridade da cromatina e morfometria da cabeça espermática, e coloração pela cromomicina A3 (CMA3), para investigar deficiência de protamina espermática. Animais do grupo jovem apresentaram espermatozoides com maior heterogeneidade da compactação da cromatina (CV) (2,52±0,31%) que animais do grupo jovem adulto (1,75±0,10 %). Além disso, o grupo jovem apresentou alteração de cromatina em todas as coletas (Dif > 2 e/ou CV > 5%). O grupo jovem adulto apresentou maior índice de fertilidade (87,27±2,05) (exame andrológico, qualidade espermática a fresco e pós-descongelamento, circunferência escrotal e libido) e melhor nota de classificação andrológica por pontos (83,64±3,92) que animais do grupo adulto (77,60±2,74; 76,82±3,16, respectivamente) (P<0,05). No teste do CMA3, espermatozoides de touros jovens apresentaram maior deficiência de protamina na primeira e quarta coletas (C1= 5.111±619; C4= 4.3880±171; (P<0,05)), possivelmente devido a influência de estresse, tanto do transporte e adaptação a novo manejo quanto estresse térmico. Resultados de morfometria não diferiram ao longo das coletas (P>0,05). Como conclusão, os resultados desse estudo mostram que a idade teve influência quanto as avaliações da cromatina, tendo os animais do grupo jovem apresentado-se imaturos nessas análises. Testes de investigação apresentaram perfil dinâmico de acordo com as diferentes faixas etárias, indicando não existir teste único para avaliar capacidade reprodutiva.

The aim of this study was to evaluate sperm quality, condensation/integrity and protamine deficiency of sperms chromatin packaging, as well as the behavior of reproductive characteristics according to age. For that, two approaches were done: 1st) evaluate how age would interfere in the analyzed variables, 2nd) evaluate how the variables would evolve along four monthly collections. On the 1st approach, 43 elite Gir bulls (Bos taurus indicus) with initial ages between 18 and 42 months were divided into three groups: young (18.5-24.7 months, n=15), young adult (25.2-28.6 months, n=16) and adult (29.1-42.0 months, n=12). Results of reproductive characteristics evaluation (Fertility, Andrological Classification by Points and Bull Classification Index) were included in this first approach. For the 2nd approach, 38 of the 43 bulls were divided into three groups (using the same criteria described before): young (n=12), young adult (n=13) and adult (n=13). After thawing, semen samples were evaluated trough the toluidine blue method, for chromatin condensation/integrity and sperm head morphometry assessment and chromomicin A3 (CMA3) to analyze protamine deficiency. Animals from the young group presented spermatozoa with higher heterogeneity of chromatin compaction (CV) (2.52±0.31 %) than animals from the young adult group (1.75±0.10 %). Young bulls also presented chromatin alteration in all the four collections ((Dif > 2 and/or CV > 5%). The young adult group showed higher fertility index (andrological examination, fresh and thawed sperm quality, scrotal circumference and libido) (87.27±2.05) and better score at bull soundness evaluation (83.64±3.92) than animals from the adult group (77.60±2.74; 76.82±3.16, respectively) (P < 0.05). Young bulls CMA3 results showed higher protamine deficiency in the first and fourth collections (C1= 5.111±619; C4= 4.388±171; (P<0,05)), possibly due to stress of transportation and adaptation to the new environment as well as heat stress. Results of morphometry and compaction evaluated trough the toluidine blue method didn`t differ along collections (P > 0,05). From our results, it can be concluded that age had an influence in chromatin evaluations, as bulls from the young group showed immaturity in these analyses. Investigative tests presented a dynamic profile according to the different age groups, indicating that there is not a single test for reproductive capacity.

PROTEOMA NUCLEAR E MICRO-RNAS DE ESPERMATOZOIDES DE BOVINOS FÉRTEIS E SUBFÉRTEIS

A compreensão da composição e fisiologia do espermatozoide é importante para compreender a subfertilidade transitória ou permanente em touros. Assim, objetivou-se com este trabalho avaliar as proteínas nucleares e micro-RNAs de espermatozoides de bovinos férteis e subférteis, na tentativa de se identificar marcadores moleculares de fertilidade e subfertilidade em touros. Para a avaliação de micro-RNAs foi utilizada a metodologia de RNA-seq e para as proteínas nucleares foi utilizada a espectrometria de massas avançada de amostras de sêmen de touros férteis e subférteis. Foram identificados 1306 micro-RNAs nas amostras de sêmen avaliadas. Identificou-se por análises computacionais os genes bta-miR- 380-5p, bta-miR-155, bta-miR-122, bta-miR-30c e bta-miR-34a como sendo diferencialmente expressos em touros férteis e subférteis, indicando que estes podem configurar possíveis marcadores de fertilidade. No entanto, ficou claro que não existe um micro-RNA único que marque diferentes tipos e causas de subfertilidade. Quanto às proteínas nucleares, foi possível verificar que espermatozoides de touro possuem na constituição de sua cromatina protamina 1 e 2, assim como as variações de histona subH2Bv, H2A.J, H2A.2C, H4, H2B.1, H1.2, H2A.Z, H3.1, H3.3C, H3.3C-like, H1.3, H3.3, H3.2. Dentre proteínas nucleares, contaminantes de outros compartimentos do espermatozoide e do plasma seminal, identificou-se a proteína Acil-tioesterase 1 (APT-1), o fator beta de crescimento do nervo (Beta-NGF), a proteína do plasma seminal A3 (BSP-3), a Histona H2A.J, a proteína FAM71D, as proteínas ribossomais 40S-S8 e a 60S-L9, o inibidor de serina protease plasmática (Protein C inhibitor) (PCI) (Serpin A5) e a subunidade alfa catalítica da proteína quinase dependente de cAMP como tendo potencial para serem utilizadas como marcadoras de fertilidade. Já a proteína ATPase do reticulo endoplasmático transicional, a subunidade 5 da NADH desidrogenase (ubiquinona) do subcomplexo 1 alfa, a proteína de choque térmico beta-9, as proteínas ribossomais 60S-L12 e 40S-S7 e a proteína acetiltransferase do acetil-CoA apresentaram potencial para serem utilizadas como marcadoras de subfertilidade.

Understanding the composition and physiology of spermatozoa is important to understand transient or permanent subfertility in bulls. Thus, the objective of this work was to evaluate the nuclear and micro-RNA spermatozoa of fertile and subfertile cattle, in an attempt to identify molecular markers of fertility and subfertility in bulls. For the evaluation of micro- RNAs the RNA-seq methodology was used and for nuclear proteins the advanced mass spectrometry of semen samples from fertile and subfertile bulls was used. A total of 1306 micro-RNAs were identified in the semen samples evaluated. The bta-miR-380-5p, bta-miR- 155, bta-miR-122, bta-miR-30c and bta-miR-34a genes were identified by computational analysis as being differentially expressed in fertile and subfertile bulls, indicating that they can set up possible fertility markers. However, it was clear that there is no single micro-RNA that marks different types and causes of subfertility. As for the nuclear proteins, it was possible to verify that spermatozoa of bull have in the constitution of their protamine chromatin 1 and 2, as well as the histone variations subH2Bv, H2A.J, H2A.2C, H4, H2B.1, H1.2, H2A .Z, H3.1, H3.3C, H3.3C-like, H1.3, H3.3, H3.2. Among nuclear proteins and contaminants from other sperm and seminal plasma compartments, the acyl thioesterase 1 protein (APT-1), nerve growth factor beta (Beta-NGF), seminal plasma protein A3 ( BSP-3), Histone H2A.J, FAM71D protein, 40S-S8 and 60S-L9 ribosomal proteins, the plasma serine protease inhibitor (Protein C inhibitor) (Serpin A5) and the catalytic alpha subunit of the cAMP-dependent protein kinase as having potential to be used as a fertility marker. On the other hand, the ATPase protein of the transitional endoplasmic reticulum, subunit 5 of NADH dehydrogenase (ubiquinone) of subcomplex 1 alpha, beta-9 heat shock protein, ribosomal proteins 60S-L12 and 40S-S7 and acetyl-CoA protein acetyltransferase presented potential to be used as subfertility markers.

PERFIL DE EXPRESSÃO DOS GENES PRM-1, TNP-2, 17-HSD3, LHR, MHC-I, MIC-B, NC1 E NC3 NA ESPERMATOGÊNESE BOVINA

A espermatogênese consiste em um processo de modificações morfológicas, fisiológicas e bioquímicas complexas que ocorrem nos testículos, baseado em uma série de divisões (mitóticas e meióticas), que resultam na formação de espermatozoides nos túbulos seminíferos. Qualquer alteração ao longo desse processo pode determinar distúrbios reprodutivos variados que determinam subfertilidade até a infertilidade. O objetivo desta pesquisa foi analisar a expressão dos genes Protamina tipo 1 (PRM-1), Proteína de Transição Nuclear do tipo 2 (TNP-2), enzima 17-Hidroxiesteróide Desidrogenase tipo 3 (17-HSD3), Receptor do Hormônio Luteinizante (LHR), Complexo de Histocompatibilidade Principal de classe I (MHC-I), MIC-B, NC1 e NC3 na espermatogênese de bovinos, correlacionando os resultados ao nível de maturação histológica do epitélio seminífero. Foram utilizados testículos de 36 bovinos, sem padrão racial e independente da idade. À luz do nosso conhecimento, este é o primeiro estudo em bovinos que utiliza os critérios de Johnsen para correlacionar os escores médios à expressão diferencial dos genes envolvidos no processo de espermatogênese. O RNA extraído do parênquima testicular foi submetido ao RT-PCR em tempo real, sendo os genes (PRM-1, TNP-2, 17-HSD3, LHR, MHC-I, MIC-B, NC1, NC3) avaliados com base na análise histológica. Constatou-se que os indivíduos avaliados pertenciam aos escores médios: seis, sete e oito, e que não houve diferença estatística significativa (p>0,05) nos escores da espermatogênese entre os testículos direito e esquerdo de cada animal. Os resultados obtidos da análise do qRT-PCR demonstraram que todos os genes avaliados foram expressos no testículo bovino nos diferentes escores estudados, embora a magnitude de expressão de cada gene tenha sido extremamente variável dentro do mesmo escore e somente para alguns genes quando comparados entre os escores. Houve diferença estatística significativa (p0,05) quando comparado entre eles. Não houve diferença estatística significativa (p>0,05) na expressão dos genes MHC-I genérico e o MHC-Ib (MIC-B, NC1 e NC3) quando comparada as médias dos três escores avaliados, podendo-se sugerir que estas moléculas tem ação indireta na espermatogênese bovina. Houve correlação positiva significativa

The spermatogenesis consists of a number of divisions (mitotic and meiotic) and morphological, physiological and biochemical complex, resulting in the formation of sperm cells in the seminiferous tubules, and any changes in the process can lead to reproductive disorders such as infertility. The objective of this research was to analyze the expression of genes protamine type 1 (PRM-1), transition protein nuclear type 2 (TNP-2), 17- hydroxysteroid enzyme dehydrogenase type 3 (17HSD-3), luteinizing hormone receptor (LHR), Major Histocompatibility Complex class I (MHC-I), MIC-B, NC1 and NC3 spermatogenesis cattle, correlating the results to histological maturation level of the seminiferous epithelium. Testis of 36 cattles without racial standard and independent of age were used. In the light of our knowledge, this is the first study in cattle using the criteria of Johnsen to correlate the average scores for differential expression of genes involved in spermatogenesis process. The RNA extracted from the testicular parenchyma was subjected to RT-PCR in real time, and genes (PRM-1, TNP-2, 17-HSD3, LHR, MHC-Ib, MIC-B, NC1, NC3) evaluated based on histological analysis. It was found that the evaluated individuals belonged to the mean scores: six, seven and eight, and that there was no significant statistical difference (p>0.05) in the spermatogenesis scores between the right and left testicles of each animal. The results obtained from the qRT-PCR analysis demonstrated that all the evaluated genes were expressed in the bovine testis in the different scores studied, although the magnitude of expression of each gene was extremely variable within the same score and only for some genes when compared between the scores. There was a significant statistical difference (p0.05) when compared between them. There was no statistically significant difference (p>0.05) in the expression of the generic MHC-I and MHC-Ib genes (MIC-B, NC1 and NC3) when compared to the means of the three evaluated scores, suggesting that these molecules have an indirect effect on bovine spermatogenesis.

PROTEÔMICA DA MATRIZ NUCLEAR ESPERMÁTICA SUÍNA

Objetivou-se com este estudo realizar o isolamento e identificação das proteínas da matriz nuclear espermática de um reprodutor suíno. Foi utilizado sêmen de suíno pré-diluído resfriado, obtido de um reprodutor aparentemente saudável, com testes de morfologia e de condensação de cromatina normais, da linha comercial landrace X large White X pietran, com 22 semanas de idade, utilizado normalmente em uma central de inseminação artificial de suínos localizada em Uberlândia, Minas Gerais. O sêmen foi processado para separação das cabeças dos espermatozoides, extração da cromatina e matriz nuclear, quantificação de proteínas e análise por espectrometria de massas (Aparelho LTQ-Orbitrap Elite). A família de proteínas mais abundantes correspondeu às ribossomais (18%), seguida pelas não caracterizadas (15,6%), citoesqueleto (11,4%), histonas (3,8%), subunidades proteossomais (2,8%) e heat shock (1,9%). As outras proteínas foram agrupadas em outras famílias e corresponderam a 46,5% do total de proteínas descritas. Foram identificadas 211 proteínas diferentes na amostra, e destas 149 (70,7%) foram previamente descritas como presentes no núcleo espermático ou somático de outras espécies, 29 (13,7%) não têm presença nuclear previamente descrita e 33 (15,6%) foram não caracterizadas. A protamina 2 foi identificada pela primeira vez na espécie suína, no entanto a protamina 1 não foi descrita. Conclui-se que o isolamento das proteínas da matriz nuclear de espermatozoides suíno foi satisfatório, demonstrando que o protocolo utilizado foi eficiente. Algumas famílias de proteínas foram identificadas e descritas. Contudo não foi possível identificar algumas estruturas proteicas. Desta forma este estudo vem contribuir com um catálogo de estruturas proteicas que podem ser úteis em futuros estudos proteômicos.

The objective of this study was to perform the isolation and identification of proteins of sperm nuclear matrix of a pig breeder. It was used pre-chilled diluted boar semen obtained from an apparently healthy breeder boar, with normal morphology and chromatin condensation tests, from a commercial line landrace X large white X pietran, with 22 weeks of age, usually used in an artificial insemination central, located in Uberlândia, Minas Gerais. The semen was processed to separate the sperm heads, extraction of chromatin and nuclear matrix, protein quantification and analysis by mass spectrometry (Equipment LTQ-Orbitrap Elite). The most abundant family corresponded of ribosomal proteins (18%), followed by uncharacterized (15,6%), cytoskeleton (11,4%), histones (3,8%), proteasome subunits (2,8% ) and heat shock (1,9%). The other proteins were grouped into other families and corresponded to 46,5% of total proteins described. Were identified 211 different proteins in the sample and 149 of these (70,7%) have been described previously as present in the somatic or sperm nucleus of other species, 29 (13,7%) did not have nuclear presence previously described and 33 (15,6%) have not been characterized. Protamine 2 was first identified in swine, however protamine 1 has not been described. It follows that the proteins isolation of the nuclear matrix of swine spermatozoid was satisfactory, showing that the protocol used was efficient. Some protein families have been identified and described. However it was not possible to identify some protein structures. Therefore this study contributes to a catalog of protein structures that may be useful in future proteomics studies.

Qualidade espermática e danos de DNA em espermatozóides criopreservados de touros Nelore jovens, adultos e senis

Os objetivos deste projeto de pesquisa foram testar se a qualidade espermática, e a integridade da cromatina são diferentes em um grupo de touros Nelore jovens, adultos e senis. Três ejaculados, de 40 touros Nelore foram subdivididos em três faixas etárias: de 1,8 a 2 anos ? Grupo Jovens, de 3,5 a 7 anos ? Grupo Adultos e de 8 a 14,3 anos ? Grupo Senis. As amostras foram avaliadas quanto à motilidade, o vigor, teste de termoresistência lento (TTL), análise computadorizada do movimento espermático (CASA), avaliação simultânea da integridade da membrana plasmática e do acrossoma, potencial mitocondrial, protaminação espermática, danos de DNA causados por radicais livres, suscetibilidade a denaturação da cromatina, pelos testes ?Sperm Cromatin Structure Assay? (SCSA) e laranja de acridina (AOT), e danos na cromatina com a técnica TUNEL. Os animais jovens apresentaram valores superiores de motilidade e vigor antes e após o TTL, e maior porcentagem de células com alterações morfológicas, assim como maior porcentagem de espermatozóides com membrana e acrossoma íntegros e com alto potencial mitocondrial, estes parâmetros tiveram os menores índices nos animais senis (P<0,05). Nas avaliações da integridade do DNA, os touros jovens apresentaram maior porcentagem de deficiência de protaminação, enquanto os senis danos por oxidação. No teste SCSA os touros mais jovens e mais idosos apresentaram maiores índices de danos na cromatina, diferindo dos demais (P<0,05). O teste de TUNEL não apresentou resultados satisfatórios. Estes resultados permitem concluir que touros jovens apresentam qualidade espermática superior, seguidos pelo grupo de animais adultos, e finalmente um declínio na qualidade nos diversos parâmetros estudados para o grupo de animais senis. Quanto à integridade... (Complete abstract click electronic access below)

The aims of this study were to test if sperm quality and chromatin integrity are different in young, adult and senile Nelore Bull cryopreserved semen samples. Three ejaculates from 40 Nelore bulls were divided by age in three groups: 1,8 to 2 years ? Young Bulls, from 3,5 to 7 years ? Adult Bulls and from 8 to 14,3 years ? Senile Bulls. Samples were evaluated for: motility, vigor, slow termoresistance test (TTL), computadorized sperm movment analyses (CASA), simultaneous evaluation of plasmatic membrane and acrosome integrity, mitochondrial potential, sperm protamination, DNA oxidation damages, Sperm Cromatin Structure Assay (SCSA) and acridine orange test (AOT), and TUNEL. Young animals presented better values for motility and vigor before and after TTR , intact membrane and acrosome and high mitochondrial potential, but higher values for sperm defects, (P<0.05). On DNA integrity evaluations, Young Bulls presented more protamination problems while senile bulls guanine oxidation defects, both groups were more susceptible to DNA denaturation on SCSA (P<0.05). TUNEL results were not satisfatory. The results indicates that Young bulls may have a high quality sperm sample after freezing, followed by the adults and finally there is a decrease in quality on senile bulls group, nevertheless the results would probably not compromised the samples approval for commercial use. Regarding DNA integrity, Young and senile bulls are more susceptible to DNA damage, nevertheless the etiology of the damage seems to be different, by protamine deficiency in Young bulls and by oxidation in senile animals

Influência do glicerol e etilenoglicol e da criopreservação sobre o complexo DNA-Proteina de espermatozóides em garanhões / Glycerol, ethyleneglycol and cryopreservation influences on semen an sperm DNA-Protein complex in stallion

O processo de criopreservação causa estresse físico e químico aos espermatozóides, acarretando alterações bioquímicas, diminuição irreverssível da motilidade espermática, aumento da degeneração do DNA e liberação intracelular de enzimas e lipídeos. No presente estudo, foram estudadas a influência das estações não reprodutiva e reprodutiva, dos crioprotetores glicerol e etilenoglicol e do processo de congelação e descongelação sobre o complexo DNA-proteína de espermatozóides em garanhões. Foi comparados o sêmen puro, o sêmen puro e congelado sem crioprotetores, o sêmen diluído e exposto aos crioprotetores sem congelação e o sêmen diluído e congelado com crioprotetores. Foram utilizados seis garanhões, colhendo 12 ejaculados cada. A patologia do complexo DNA-Proteína foi avaliada em espermatozóides fixados com etanol-ácido-acético glacial 3: 1 (v/ v), tratados com HCL 4N a 25°C e corados com azul de toluidina a 0,025% em tampão McIlvaine, empregando microscopia óptica com aumento de 1000x. Os resultados mostraram que a anomalia do complexo DNA-Proteína dos espermatozóides diferem entre os grupos congelados e não congelados (P<0,05). O sêmen congelado sem crioprotetor não apresentou aumento significativo de patologia do complexo DNA-Proteína em relação ao sêmen congelado com crioprotetores, mas ambos mostraram aumento em relação ao sêmen puro ou diluído e exposto aos crioprotetores. A influência da estação reprodutiva mostrou diferença significativa (P<0,05) somente no sêmen puro e no sêmen puro e congelado sem crioprotetor. Conclui-se que o processo de congelação exerce influência negativa sobre o complexo DNA-Proteína de espermatozóides em garanhões.(AU)

The cryopreservation process cause stress physical and chemical to the spermatozoa, causing biochemistry alteration, irreversible reduction of the spermatic motility, increase of the DNA degeneration and intracellular enzyme and lipids release. The aim of this study was to evaluate the influence of non-breeding and breeding seasons, glycerol and ethylene glycol, cryopreservation and thawing processes on stallion spermatozoa DN A -protein complexo It was compared fresh semen, diluted semen frozen without cryoprotectants, diluted semen exposured to cryoprotectants but not frozen and d) diluted semen frozen with cryoprotectants. Six stallions had 12 semen collections each. DNA-protein complex pathology was assessed by optical microscopy (1000x) using spermatozoa treated with ethanol-acetic acid 3:1 (v/v), HCl 4N at room temperature and toluidin blue 0,025% in McIlavaine buffer. Results showed that DNA-protein complex were different between frozen and not frozen spermatozoa groups (P<0,05). Frozen semen without cryoprotectants had no increasing of DNA-protein complex pathology compared to semen cryopreserved with cryoprotectant, but both showed increasing in relation to fresh and diluted semen exposured to cryoprotectants. The influence of non breeding and breeding season showed significant difference (P<0,05) in the fresh semen and fresh semen frozen without cryoprotectants. Cryopreservation process had negative influence on spermatozoa DNA-protein complex.(AU)

Influência da fragmentação de DNA espermático na produção in vitro de embriões bovinos / Sperm DNA fragmentation influence on bovine in vitro embryo production

A integridade da cromatina espermática é fundamental para a transmissão das informações genéticas paternas, sendo que alterações de DNA podem levar a falhas no processo reprodutivo. Danos na cromatina espermática podem ocorrer por diversos motivos, sendo que os mais importantes são a apoptose, a deficiência de protamina e os danos causados pelas espécies reativas de oxigênio (EROs). Os danos de DNA espermático não impedem que o espermatozóide fecunde o oócito, entretanto podem causar perda embrionária por apoptose. A importância da integridade da cromatina espermática no desenvolvimento embrionário já foi descrita em humanos, sendo que pode ser atribuída como uma das causas de infertilidade masculina, quando está alterada. Contudo, as informações sobre a influência da integridade do DNA espermático no processo de fecundação e do desenvolvimento embrionário na espécie bovina são muito escassas. Devido à falta de informação sobre a relação da fragmentação de DNA e conseqüente alteração nos índices de desenvolvimento embrionário nessa espécie, este trabalho teve como objetivo avaliar o índice de fragmentação de DNA espermático em uma população de touros e verificar a influência dos possíveis danos de DNA espermático na produção in vitro (PIV) de embriões. Para isto, o sêmen congelado de 221 touros foi avaliado pelo ensaio de estrutura de cromatina espermática (SCSA). Após o ensaio, os animais foram divididos em seis grupos experimentais de acordo com o índice de fragmentação de DNA apresentado, sendo sete animais de cada grupo, escolhidos aleatoriamente para as avaliações espermáticas: motilidade, fragmentação de DNA espermático pelos ensaios SCSA e Cometa Alcalino e estresse oxidativo pelo ensaio de substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS). Posteriormente foi realizada a PIV de embriões, sendo avaliados os índices de clivagem e de blastocisto e realizado o ensaio de TUNEL para a avaliação da apoptose dos blastocistos produzidos. Em relação à motilidade espermática, o grupo 1 apresentou menor motilidade em relação ao grupo 4 (p<0,05). Não foi verificada diferença significativa da motilidade entre os outros grupos experimentais. O ensaio SCSA revelou que o grupo 1 apresentou menor susceptibilidade à fragmentação de DNA espermático quando comparado com o grupo 5 (p< 0,05). O grupo 2 apresentou susceptibilidade à fragmentação de DNA espermático inferior, quando comparado aos grupos 3, 4, 5 e 6 (p<0,05). Em relação ao ensaio Cometa Alcalino, a avaliação do estresse oxidativo e a PIV de embriões, não houve diferença significativa entre os grupos experimentais. Além disso, foi observada correlação negativa entre a intensidade média do Cometa e o índice de blastocisto produzido in vitro. O índice de blastocisto também apresentou correlação negativa com a intensidade média da cabeça do Cometa e ao ensaio TBARS. O ensaio TBARS apresentou correlação negativa com o índice de clivagem dos embriões PIV. Por outro lado, o ensaio TBARS apresentou correlação positiva com os ensaios SCSA e TUNEL. Considerando as condições experimentais, a fragmentação de DNA espermático não influenciou a PIV de embriões bovinos

Sperm chromatin integrity is essential for the transmission of paternal genetic information. Changes in sperm DNA can lead to failures in the reproductive process. Loss of chromatin integrity may occur for several reasons, and the most important are apoptosis, protamine deficiency and damages caused by reactive oxygen species (ROS). The sperm DNA damage does not prevent the sperm to fertilize the oocyte, however it can cause embryonic loss by apoptosis. The importance of sperm chromatin integrity in embryonic development has been described in humans, and can be considered a cause of male infertility when it is disrupted. However, information on the influence of sperm DNA integrity in the process of fertilization and embryonic development in cattle are very scarce. Due to the lack of information on the relationship between DNA fragmentation and its consequence on embryonic development rates in this species, this study aimed to evaluate the sperm DNA fragmentation rate in a population of bulls and the influence of possible sperm DNA damage on in vitro production (IVP). For this, frozen semen from 221 bulls was evaluated by sperm chromatin structure assay (SCSA). After that, animals were divided into six groups, according to the DNA fragmentation rate observed. Then seven animals from each group were randomly chosen for sperm evaluation: motility, sperm DNA fragmentation by the SCSA and Alkaline Comet assay and oxidative stress by tiobarbituric acid reactive substances (TBARS). After sperm evaluations embryo IVP was performed. Cleavage and blastocyst rates were assessed and the obtained blastocysts were submitted to TUNEL assay for apoptosis evaluation. Regarding sperm motility, group 1 had lower motility compared to group 4 (p <0.05). There was no significant difference in motility between the other experimental groups. The SCSA revealed that group 1 showed lower susceptibility to sperm DNA fragmentation when compared to group 5 (p <0.05). Group 2 was less susceptible to sperm DNA fragmentation, when compared to groups 3, 4, 5 and 6 (p <0.05). For the alkaline comet assay, the assessment of oxidative stress and embryo IVP, no significant difference was shown between en experimental groups. Moreover, there was a negative correlation between the comet mean intensity and the blastocyst rate. The blastocyst rate also negatively correlated to the comet head mean intensity and TBARS. The TBARS was negatively correlated to cleavage rate. In addition, TBARS correlated positively to TUNEL assay and SCSA. Considering the experimental conditions, the sperm DNA fragmentation did not influence the IVP of bovine embryos