Bioengenharia: transplante de células-tronco espermatogoniais em mamíferos / Bioengineering: spermatogonial stem cells transplantation in mammals

O transplante de espermatogônias tronco (SSCs, do inglês Spermatogonial Stem Cell) é uma biotecnologia que consiste na transferência de células tronco testiculares de um doador fértil para um receptor cuja espermatogênese endógena foi suprimida. Essa técnica pode ser aplicada para a produção de machos que gerem uma progênie com características genotípicas do doador selecionado. Especialmente na bovinocultura, tanto de leite como de corte, o transplante de SSCs tem o potencial de substituir a inseminação artificial (IA). Pode-se também, colocar SSCs de um mesmo doador (de genética superior) em mais de um receptor o que aumentaria o número de filhos desse doador. Além disso, possui outras aplicações como a restauração da fertilidade em homens após o tratamento de câncer, conservação de espécies ameaçadas de extinção e tratamento de causas específicas de infertilidade. Assim, com esta revisão tem-se como propósito discorrer acerca de uma biotecnologia da reprodução que permitirá a propagação do valor genético de doadores de sêmen considerados de alto valor zootécnico.

Spermatogonial Stem Cell (SSCs) transplantation is a biotechnology that consists in the transfer of testicular stem cells from a fertile donor to a recipient whose endogenous spermatogenesis has been depleted. This technique can be applied to the production of males that generate a progeny with genotypic characteristics of the selected donor. Especially in beef and dairy cattle, SSCs transplantation has the potential to replace artificial insemination (AI). In addition, it has other applications such as restoring fertility in human species after cancer treatment, conserving endangered species and treating specific causes of infertility. Thus, this aim of this review is to discuss the perspectives of reproductive biotechnology that allows the propagation of the genetic material of high pedigree males.

The role of Rho-associated kinase inhibitor, Y-27632 on primary culture of ovine spermatogonial stem cells

The access to sufficient numbers of spermatogonial stem cells (SSCs) is a prerequisite for the study of their regulation and further biomanipulation. Rho kinase (ROCK) belongs to a family of serine/threonine kinases and involves in a wide range of fundamental cellular functions. The aim of the present study was to study the effect of ROCK inhibitor, Y-27632 (0.1-40 µM), during the primary culture of ovine SSCs. SSCs were collected from 3-5-month-olds lamb testes. The viability of SSCs, the apoptosis assay of SSCs, the intracellular reactive oxygen species (ROS) analysis, and the SSCs markers and apoptosis-related gene expressions were detected by MTT reduction assay, Annexin V–FITC/ Propidium Iodide (PI) dual staining, flow cytometry and real-time-PCR studies, respectively. Morphological analyses indicated that the 5-10 µM Y-27632 had an optimal effect on the number of presumptive SSCs colonies and the area covered by them after a 10 days culture. The cell viability, apoptosis and necrosis of SSCs after 10 days culture were not affected in comparison with the control group, and the 20 µM of Y-27632 resulted in significantly decreased cell viability (P<0.05) and an increased necrosis of cells. On day 10 after culture, the expression of P53 was decreased with an increase from 0 to 10 µM in the Y-27632 dose. In the 20 µM Y-27632 group, the expressions of P53 and Bax were higher and the Bcl-2 was lower than other groups and these values were significantly different from 5 and 10 µM Y-27632 groups (P<0.05). The level of intracellular ROS was decreased with an increase in the Y-27632 dose from 5 to 20 µM in comparison with the control group. In conclusion, the present study demonstrated that Y-27632 at a concentration of 5-10 µM provided optimal culture conditions for the primary culture of ovine SSCs.(AU)

Bioengenharia: transplante de células-tronco espermatogoniais em mamíferos / Bioengineering: spermatogonial stem cells transplantation in mammals

O transplante de espermatogônias tronco (SSCs, do inglês Spermatogonial Stem Cell) é uma biotecnologia que consiste na transferência de células tronco testiculares de um doador fértil para um receptor cuja espermatogênese endógena foi suprimida. Essa técnica pode ser aplicada para a produção de machos que gerem uma progênie com características genotípicas do doador selecionado. Especialmente na bovinocultura, tanto de leite como de corte, o transplante de SSCs tem o potencial de substituir a inseminação artificial (IA). Pode-se também, colocar SSCs de um mesmo doador (de genética superior) em mais de um receptor o que aumentaria o número de filhos desse doador. Além disso, possui outras aplicações como a restauração da fertilidade em homens após o tratamento de câncer, conservação de espécies ameaçadas de extinção e tratamento de causas específicas de infertilidade. Assim, com esta revisão tem-se como propósito discorrer acerca de uma biotecnologia da reprodução que permitirá a propagação do valor genético de doadores de sêmen considerados de alto valor zootécnico.(AU)

Spermatogonial Stem Cell (SSCs) transplantation is a biotechnology that consists in the transfer of testicular stem cells from a fertile donor to a recipient whose endogenous spermatogenesis has been depleted. This technique can be applied to the production of males that generate a progeny with genotypic characteristics of the selected donor. Especially in beef and dairy cattle, SSCs transplantation has the potential to replace artificial insemination (AI). In addition, it has other applications such as restoring fertility in human species after cancer treatment, conserving endangered species and treating specific causes of infertility. Thus, this aim of this review is to discuss the perspectives of reproductive biotechnology that allows the propagation of the genetic material of high pedigree males.(AU)

Diets for Macrobrachium acanthurus breeders: Sperm evaluation / Dietas para reprodutores de Macrobrachium acanthurus: avaliação espermática

The application of biotechnology in animal reproduction has enabled the production of young forms in both quantity and quality. Increasing the number of viable gametes produced by reproducers, among other factors, through an ideal diet, can ensure higher production. Therefore, the aim of this study was to determine the influence of three diets on the sperm survival of Macrobrachium acanthurus. To this end, 24 M. acanthurus males were used, distributed randomly and equally among treatments. Their diets were composed of 100% fresh food (fish and squid muscle - 14% protein), 100% dry feed (commercial feed - 50% protein) and a mixture of these diets containing 30% protein. Spermatophores were extracted through electrical stimulation every 15 days, and the controls consisted of spermatophores obtained directly from nature. No significant difference between diets was observed comparing shrimp and spermatophore weights. The 100% fresh diet provided the best sperm survival performance.

A aplicação de biotecnologias na reprodução animal tem possibilitado produzir formas jovens em quantidade e qualidade. O aumento da quantidade de gametas viáveis produzidos pelos reprodutores, mediante uma dieta ideal, entre outros fatores, pode garantir uma maior produção. Assim, o objetivo deste trabalho foi determinar o efeito de três dietas quanto à sobrevivência espermática de Macrobrachium acanthurus. Para tanto, 24 machos de M. acanthurus foram utilizados, sendo distribuídos ao acaso e de forma igual entre os tratamentos. As dietas foram compostas por 100% de alimento fresco (músculo de peixe e lula - 14% de proteína), 100% de alimento seco (ração comercial - 50% de proteína) e uma mescla dessas dietas contendo 30% de proteína. Os espermatóforos foram extraídos por eletroestimulação a cada 15 dias, sendo o controle aqueles obtidos diretamente da natureza. Não houve diferença significativa entre as dietas quando comparado os pesos dos camarões e dos espermatóforos. A alimentação 100% fresca proporcionou o melhor desempenho para a sobrevivência espermática.

Diets for Macrobrachium acanthurus breeders: Sperm evaluation / Dietas para reprodutores de Macrobrachium acanthurus: avaliação espermática

The application of biotechnology in animal reproduction has enabled the production of young forms in both quantity and quality. Increasing the number of viable gametes produced by reproducers, among other factors, through an ideal diet, can ensure higher production. Therefore, the aim of this study was to determine the influence of three diets on the sperm survival of Macrobrachium acanthurus. To this end, 24 M. acanthurus males were used, distributed randomly and equally among treatments. Their diets were composed of 100% fresh food (fish and squid muscle - 14% protein), 100% dry feed (commercial feed - 50% protein) and a mixture of these diets containing 30% protein. Spermatophores were extracted through electrical stimulation every 15 days, and the controls consisted of spermatophores obtained directly from nature. No significant difference between diets was observed comparing shrimp and spermatophore weights. The 100% fresh diet provided the best sperm survival performance.(AU)

A aplicação de biotecnologias na reprodução animal tem possibilitado produzir formas jovens em quantidade e qualidade. O aumento da quantidade de gametas viáveis produzidos pelos reprodutores, mediante uma dieta ideal, entre outros fatores, pode garantir uma maior produção. Assim, o objetivo deste trabalho foi determinar o efeito de três dietas quanto à sobrevivência espermática de Macrobrachium acanthurus. Para tanto, 24 machos de M. acanthurus foram utilizados, sendo distribuídos ao acaso e de forma igual entre os tratamentos. As dietas foram compostas por 100% de alimento fresco (músculo de peixe e lula - 14% de proteína), 100% de alimento seco (ração comercial - 50% de proteína) e uma mescla dessas dietas contendo 30% de proteína. Os espermatóforos foram extraídos por eletroestimulação a cada 15 dias, sendo o controle aqueles obtidos diretamente da natureza. Não houve diferença significativa entre as dietas quando comparado os pesos dos camarões e dos espermatóforos. A alimentação 100% fresca proporcionou o melhor desempenho para a sobrevivência espermática.(AU)

Resfriamento de espermatóforos e inseminação assistida em camarão marinho Penaeus vannamei (Boone, 1931).

O resfriamento de espermatóforos do camarão Penaeus vannamei com fins de inseminação assistida pode permitir o trânsito de gametas entre laboratórios de reprodução, facilitando a troca de material genético e o uso de linhagens melhoradas geneticamente. O presente trabalho realizou o resfriamento de espermatóforos de P. vannamei a 15 °C durante 24 e 48 horas. Foram avaliados três meios diluidores: Água de Coco em Pó (ACP), Óleo Mineral (OM) e Água do Mar Esterilizada (AME). Foram realizadas análises microscópicas para verificar a viabilidade aparente, através da análise de integridade de membrana com eosina-nigrosina e morfologia espermática. A inseminação assistida foi realizada após os dois períodos de resfriamento. Não foi observada interação estatística entre os tempos de 24 e 48 horas de resfriamento. Para viabilidade aparente e morfologia, as porcentagens de células viáveis e morfologicamente normais mantiveram-se acima de 60% e 70%, respectivamente, em todos os tratamentos e em ambos os tempos de resfriamento avaliados. Ao se avaliar os meios diluentes, observaram-se 74,9±9,20, 77,3±9,40 e 78,1±6,35% de células normais nos tratamentos OM, AME e ACP, respectivamente. A maior média da taxa de eclosão foi de 80,67±12,01%, observada no tratamento AME, que foi superior ao observado para o tratamento ACP, com 50,15±20,75%. A taxa de eclosão obtida pelo tratamento OM foi de 71,47±18,83%. Os espermatóforos de P. vannamei são capazes de manter boas taxas de viabilidade aparente, morfologia normal e eclosão após 48 horas de estocagem a 15 °C em óleo mineral, água do mar ou ACP®. Sendo a água do mar esterilizada o meio diluente mais eficiente, pois resultou em maior taxa de eclosão após inseminação artificial.

The cooling storage of spermatophores of the shrimp Penaeus vannamei for the purpose of assisted insemination may make feasible the transit of gametes between breeding laboratories, without transporting the animal, facilitating the exchange of genetic material and the use of genetically improved strains. The present work performed the cooling of P. vannamei spermatophores to 15 ° C for 24 and 48 hours. Three extenders were evaluated: Coconut Water Powder (ACP), Mineral Oil (OM) and Sterilized Sea Water (AME). Microscopic analyzes were performed to verify the apparent viability, through the analysis of membrane integrity with eosin-nigrosine and sperm morphology. Assisted insemination was performed after both periods of cooling. No statistical interaction was observed between the 24- and 48-hour cooling times. For apparent viability and morphology, the percentages of viable and morphologically normal cells remained above 60% and 70%, respectively, in all treatments and in both evaluated cooling times. When evaluating the extender, 74.9 ± 9.20, 77.3 ± 9.40 and 78.1 ± 6.35% of normal cells were observed in the OM, AME and ACP treatments, respectively. The highest average hatching rate was 80.67 ± 12.01%, observed in the AME treatment, which was higher than that observed for the ACP treatment, with 50.15 ± 20.75%. The hatching rate obtained by OM treatment was 71.47 ± 18.83%. The spermatophores of P. vannamei are capable of maintaining good rates of apparent viability, normal morphology and hatching after 48 hours of storage at 15 ° C in mineral oil, sea water or ACP®. Sterilized sea water is the most efficient diluent, as it resulted in a higher hatching rate after artificial insemination.

VIABILIDADE ESPERMÁTICA DE Macrobrachium amazonicum SUBMETIDOS A DOIS MÉTODOS DE EXTRAÇÃO DE ESPERMATÓFORO

Na aquicultura mundial o cultivo de camarão de água doce tem apresentado um elevado crescimento, sendo uma das espécies mais cultivadas o Macrobrachium amazonicum, que apresenta população de machos adultos podendo ser classificada em quatro morfotipos, diferindo entre si em tamanho, morfologia, fisiologia e comportamento. O objetivo deste trabalho foi verificar a qualidade e viabilidade de espermatóforos e espermatozoides de M. amazonicum submetidos a diferentes formas de extração. Foram utilizados 60 animais machos, entre duas baterias, destes, 30 utilizados para a extração manual e os outros 30 para eletroejaculação. Os animais eram observados diariamente e os parâmetros da água, temperatura e pH monitorados diariamente e feitos a cada dois dias testes de amônia e nitrito. Os espermatóforos extraídos foram então armazenados em microtubos de 1,5 mL contendo solução fisiológica (NaCl a 0,9%) e mantidos em temperatura ambiente. Para a avaliar da porcentagem aparente de espermatozoides vivos e mortos, foram utilizados 50 L de solução composta pelos corantes eosina-nigrosina e adicionada em 50 L de solução espermática. Posteriormente amostras de 25 L da solução total foram levadas a câmara de Neubauer para serem analisadas utilizando microscópio óptico com aumento de 40x. A porcentagem de espermatozoides vivos foi calculada a partir da contagem de 100 espermatozoides. Os dois métodos se mostraram eficientes na extração dos espermatóforos, não apresentando diferença significativa entre eles quanto a taxa de sobrevivência dos espermatozoides (P>0,05). Entretanto, verificou-se diferença (P<0,05) no tamanho e integridade dos espermatóforos extraídos, apresentando os seguintes valores médios finais (±DP) 1,69mm (± 0,53) obtidos manualmente e 3,12mm (± 1,06) eletricamente. Desta forma a extração elétrica se mostrou mais eficiente na obtenção de espermatóforo quando comparada a extração manual.

In aquaculture worldwide the cultivation of freshwater shrimp has shown a high growth, being one of the most cultivated species the Macrobrachium amazonicum, which has a population of adult males and can be superior in four morphotypes, differing in size, morphology, physiology and behavior. The objective of this work was to verify the quality and viability of spermatophores and spermatozoa of M. amazonicum in different forms of extraction. 60 male animals were used, between two batteries, of these, 30 used for manual extraction and the other 30 for electroejaculation. The animals were observed daily and the water, temperature and pH parameters were monitored daily and ammonia and nitrite tests were performed every two days. The extracted spermatophores were then stored in 1.5 mL microtubes containing saline (0.9% NaCl) and collect at room temperature. For the evaluation of the apparent percentage of live and dead sperm, 50 L of solution composed by the dyes eosin-nigrosine and Added in 50 L of sperm solution were used. Subsequently, they removed 25 L of the total solution and were taken to the Neubauer chamber to be analyzed using an optical microscope with a 40x magnification. The percentage of live sperm was calculated from the count of 100 sperm. Both methods improve sperm extraction, they do not increase the difference between them in terms of sperm taxa (P> 0.05). However, there was a difference (P <0.05) in the size and integrity of the extracted spermatophores, these following final mean values (± SD) 1.69mm (± 0.53) manually adjusted and 3.12mm (± 1.06) electrically. Thus, electrical extraction has become more efficient in obtaining spermatophore when compared to manual extraction.

Endocrine and paracrine regulation of zebrafish spermatogenesis: the Sertoli cell perspective

Spermatogonial stem cells (SSCs) either self-renew or differentiate into spermatogonia that further develop into spermatozoa. Self-renewal occurs when residing in a specific micro-environment (niche) While displacement from the niche would tip the signalling balance towards differentiation. Considering the cystic type of spermatogenesis in fish, the SSC candidates are single type A undifferentiated (Aund) spermatogonia, enveloped by mostly one niche-forming Sertoli cell. When going through a self-renewal cell cycle, the resulting new single type Aund spermatogonium would have to recruit another Sertoli cell to expand the niche space, while a differentiating germ cell cyle would result in a pair of spermatogonia that remain in contact with their cyst-forming Sertoli cells. In zebrafish, thyroid hormone stimulates the proliferation of Sertoli cells and of type Aund spermatogonia, involving Igf3, a new member of the Igf family. In cystic spermatogenesis, type A und spermatogonia usually do not leave the niche, so that supposedly the signalling in the niche changes when switching from self-renewal to differentiation. Recombinant zebrafish (rz) Fsh down-regulated Sertoli cell anti-müllerian hormone (amh) mRNA levels, and rzAmh inhibited differentiation of type A und spermatogonia as well as Fsh-stimulated steroidogenesis. Thus, for Fsh to efficiently stimulate testis functions, Amh bioactivity should be dampened. We also discovered that Fsh increased Sertoli cell Igf3 gene and protein expression; rzIgf3 stimulated spermatogonial proliferation and Fsh-stimulated spermatogenesis was significantly impaired by inhibiting Igf receptor signaling. We propose that in zebrafish, Fsh is the major regulator of testis functions and, supported by other endocrine systems (e.g. thyroid hormone), regulates Leydig cell steroidogenesis as well as Sertoli cell number and growth factor production to promote spermatogenesis.

Spermatogenesis in the yellowtail tetra Astyanax altiparanae: a histological analyses with emphasis to spermatogonial and spermatid types / Espermatogênese no lambari-do-rabo-amarelo Astyanax altiparanae: uma análise histológica com ênfase aos tipos espermatogoniais e espermático

This study aimed to detailed description of the characteristics of the different germ cell types found in Astyanax altiparanae during spermatogenesis. In this purpose, testes from 25 adult males specimens of A. altiparanae were sampled and submitted to the usual techniques for light microscopy. Based on nuclear shape, chromatin condensation, nucleoli quantity and cell size were identified four spermatogonial types: type A undifferentiated (Aund.*); type A undifferentiated (Aund.); type A differentiated (Adif.); and type B spermatogonia. Spermatocytes were observed in different phases of meiosis (leptotene/zygotene/pachytene and diplotene), metaphase I and II and secondary spermatocytes, being distinguish mainly by their chromosomal organization inside the nucleus. Were also identified three different types of spermatids, which were named as initial, intermediate and final, which can be differentiated by increase in nuclear condensation and spacing among cells inside the cysts, possibly by flagella arise and reduction in nuclear diameter. Thus, this study contribute to a better understand of spermatogenesis in this and other fish species.(AU)

O presente estudo teve como objetivo a descrição detalhada dos diferentes tipos de células germinativas encontradas em Astyanax altiparanae durante a espermatogênese. Deste modo, os testículos de 25 espécimes machos e adultos de A. altiparanae foram coletados e submetidos às técnicas usuais para microscopia de luz. Baseado no formato nuclear, condensação da cromatina, quantidade de nucléolos e tamanho celular foram identificados quatro tipos de espermatogônias: indiferenciadas do tipo A (Aund.*); indiferenciadas do tipo A (Aund.); diferenciadas do tipo A (Adif.); e espermatogônia do tipo B. Os espermatócitos foram observados em diferentes fases da meiose (leptóteno/zigóteno, paquíteno e diplóteno), metáfase I e II e espermatócitos secundários, sendo distinguidos principalmente pela organização dos cromossomos nos núcleos. Também foram identificados três diferentes tipos de espermátides, que foram nomeadas como iniciais, intermediárias e finais, que se diferenciaram pelo aumento da compactação nuclear e espaçamento entre as células no cisto, pelo possível surgimento do flagelo, e pelo diâmetro nuclear. Assim, este estudo contribui para um melhor entendimento da espermatogênese nesta e nas demais espécies de peixes.(AU)

Endocrine and paracrine regulation of zebrafish spermatogenesis: the Sertoli cell perspective

Spermatogonial stem cells (SSCs) either self-renew or differentiate into spermatogonia that further develop into spermatozoa. Self-renewal occurs when residing in a specific micro-environment (niche) While displacement from the niche would tip the signalling balance towards differentiation. Considering the cystic type of spermatogenesis in fish, the SSC candidates are single type A undifferentiated (Aund) spermatogonia, enveloped by mostly one niche-forming Sertoli cell. When going through a self-renewal cell cycle, the resulting new single type Aund spermatogonium would have to recruit another Sertoli cell to expand the niche space, while a differentiating germ cell cyle would result in a pair of spermatogonia that remain in contact with their cyst-forming Sertoli cells. In zebrafish, thyroid hormone stimulates the proliferation of Sertoli cells and of type Aund spermatogonia, involving Igf3, a new member of the Igf family. In cystic spermatogenesis, type A und spermatogonia usually do not leave the niche, so that supposedly the signalling in the niche changes when switching from self-renewal to differentiation. Recombinant zebrafish (rz) Fsh down-regulated Sertoli cell anti-müllerian hormone (amh) mRNA levels, and rzAmh inhibited differentiation of type A und spermatogonia as well as Fsh-stimulated steroidogenesis. Thus, for Fsh to efficiently stimulate testis functions, Amh bioactivity should be dampened. We also discovered that Fsh increased Sertoli cell Igf3 gene and protein expression; rzIgf3 stimulated spermatogonial proliferation and Fsh-stimulated spermatogenesis was significantly impaired by inhibiting Igf receptor signaling. We propose that in zebrafish, Fsh is the major regulator of testis functions and, supported by other endocrine systems (e.g. thyroid hormone), regulates Leydig cell steroidogenesis as well as Sertoli cell number and growth factor production to promote spermatogenesis.(AU)

Spermatogenesis in the yellowtail tetra Astyanax altiparanae: a histological analyses with emphasis to spermatogonial and spermatid types / Espermatogênese no lambari-do-rabo-amarelo Astyanax altiparanae: uma análise histológica com ênfase aos tipos espermatogoniais e espermático

This study aimed to detailed description of the characteristics of the different germ cell types found in Astyanax altiparanae during spermatogenesis. In this purpose, testes from 25 adult males specimens of A. altiparanae were sampled and submitted to the usual techniques for light microscopy. Based on nuclear shape, chromatin condensation, nucleoli quantity and cell size were identified four spermatogonial types: type A undifferentiated (Aund.*); type A undifferentiated (Aund.); type A differentiated (Adif.); and type B spermatogonia. Spermatocytes were observed in different phases of meiosis (leptotene/zygotene/pachytene and diplotene), metaphase I and II and secondary spermatocytes, being distinguish mainly by their chromosomal organization inside the nucleus. Were also identified three different types of spermatids, which were named as initial, intermediate and final, which can be differentiated by increase in nuclear condensation and spacing among cells inside the cysts, possibly by flagella arise and reduction in nuclear diameter. Thus, this study contribute to a better understand of spermatogenesis in this and other fish species.

O presente estudo teve como objetivo a descrição detalhada dos diferentes tipos de células germinativas encontradas em Astyanax altiparanae durante a espermatogênese. Deste modo, os testículos de 25 espécimes machos e adultos de A. altiparanae foram coletados e submetidos às técnicas usuais para microscopia de luz. Baseado no formato nuclear, condensação da cromatina, quantidade de nucléolos e tamanho celular foram identificados quatro tipos de espermatogônias: indiferenciadas do tipo A (Aund.*); indiferenciadas do tipo A (Aund.); diferenciadas do tipo A (Adif.); e espermatogônia do tipo B. Os espermatócitos foram observados em diferentes fases da meiose (leptóteno/zigóteno, paquíteno e diplóteno), metáfase I e II e espermatócitos secundários, sendo distinguidos principalmente pela organização dos cromossomos nos núcleos. Também foram identificados três diferentes tipos de espermátides, que foram nomeadas como iniciais, intermediárias e finais, que se diferenciaram pelo aumento da compactação nuclear e espaçamento entre as células no cisto, pelo possível surgimento do flagelo, e pelo diâmetro nuclear. Assim, este estudo contribui para um melhor entendimento da espermatogênese nesta e nas demais espécies de peixes.

Criopreservação do espermatóforo e da massa espermática do camarão branco Litopenaeus schmitti post-mortem / Post-mortem spermatophore and sperm cryopreservation of the white shrimp Litopenaeus schmitti

This study was carried out in two phases; the first to evaluate the viability of two cooling protocols (A and B) using glycerol (10%) as a cryoprotectant and the second, the efficiency of two cryoprotectants (10% glycerol and DMSO) and times (30, 60 and 90 days of storage in liquid nitrogen) for the cryopreservation of post-mortem sperm mass and spermatophores of the shrimp Litopenaeus schmitti. The protocol A presented a cooling rate of 0.5C min-1 until reaching -32ºC and protocol B, 20ºC min-1 until reach -120ºC, after which the samples were transferred to liquid nitrogen (N2L). The sperm viability was assessed by smearing the semen stained with eosin-nigrosin. The curve resulted in higher mean sperm survival was Protocol A (50.9%). Therefore, for the second experiment, the protocol A was used, however there was no difference between the cryoprotectants for sperm mass, although the influence on survival time. Difference was observed between the cryoprotectants and the influence of time on sperm survival of cryopreserved spermatophores. Glycerol 10% was more efficient for cryopreservation of spermatophore, but for the masses sperm, both can be used.(AU)

O presente trabalho foi realizado em duas etapas; a primeira para avaliar a eficiência de dois protocolos de resfriamento (A e B) utilizando glicerol (10%) como crioprotetor e, a segunda, a eficiência de dois crioprotetores (glicerol e dimetilsulfóxido - DMSO a 10%) e o tempo (30, 60 e 90 dias de estocagem em nitrogênio líquido) para a criopreservação da massa espermática e espermatóforo de camarões post mortem da espécie Litopenaeus schmitti. O protocolo A apresentou velocidade de resfriamento de 0,5ºC min-1 até alcançar -32ºC e o protocolo B, 20ºC min-1 até alcançar -120ºC, sendo os materiais posteriormente transferidos para o nitrogênio líquido (N2L). A viabilidade espermática foi avaliada por meio do esfregaço de sêmen corado com eosina-nigrosina. A curva que resultou na maior média de sobrevivência espermática foi a do protocolo A (50,9%). Portanto, para o segundo experimento foi utilizado o protocolo A; entretanto, neste não houve diferença entre os crioprotetores para a massa espermática, contudo, o tempo influenciou na sobrevivência. Foi observada diferença entre os crioprotetores e a influência do tempo na sobrevivência espermática dos espermatóforos criopreservados. O glicerol a 10% foi mais eficiente para a criopreservação dos espermatóforos, porém, para as massas espermáticas, ambos podem ser utilizados.(AU)

Criopreservação do espermatóforo e da massa espermática do camarão branco Litopenaeus schmitti post-mortem / Post-mortem spermatophore and sperm cryopreservation of the white shrimp Litopenaeus schmitti

This study was carried out in two phases; the first to evaluate the viability of two cooling protocols (A and B) using glycerol (10%) as a cryoprotectant and the second, the efficiency of two cryoprotectants (10% glycerol and DMSO) and times (30, 60 and 90 days of storage in liquid nitrogen) for the cryopreservation of post-mortem sperm mass and spermatophores of the shrimp Litopenaeus schmitti. The protocol A presented a cooling rate of 0.5C min-1 until reaching -32ºC and protocol B, 20ºC min-1 until reach -120ºC, after which the samples were transferred to liquid nitrogen (N2L). The sperm viability was assessed by smearing the semen stained with eosin-nigrosin. The curve resulted in higher mean sperm survival was Protocol A (50.9%). Therefore, for the second experiment, the protocol A was used, however there was no difference between the cryoprotectants for sperm mass, although the influence on survival time. Difference was observed between the cryoprotectants and the influence of time on sperm survival of cryopreserved spermatophores. Glycerol 10% was more efficient for cryopreservation of spermatophore, but for the masses sperm, both can be used.

O presente trabalho foi realizado em duas etapas; a primeira para avaliar a eficiência de dois protocolos de resfriamento (A e B) utilizando glicerol (10%) como crioprotetor e, a segunda, a eficiência de dois crioprotetores (glicerol e dimetilsulfóxido - DMSO a 10%) e o tempo (30, 60 e 90 dias de estocagem em nitrogênio líquido) para a criopreservação da massa espermática e espermatóforo de camarões post mortem da espécie Litopenaeus schmitti. O protocolo A apresentou velocidade de resfriamento de 0,5ºC min-1 até alcançar -32ºC e o protocolo B, 20ºC min-1 até alcançar -120ºC, sendo os materiais posteriormente transferidos para o nitrogênio líquido (N2L). A viabilidade espermática foi avaliada por meio do esfregaço de sêmen corado com eosina-nigrosina. A curva que resultou na maior média de sobrevivência espermática foi a do protocolo A (50,9%). Portanto, para o segundo experimento foi utilizado o protocolo A; entretanto, neste não houve diferença entre os crioprotetores para a massa espermática, contudo, o tempo influenciou na sobrevivência. Foi observada diferença entre os crioprotetores e a influência do tempo na sobrevivência espermática dos espermatóforos criopreservados. O glicerol a 10% foi mais eficiente para a criopreservação dos espermatóforos, porém, para as massas espermáticas, ambos podem ser utilizados.

USO DIETÉTICO DE PIGMENTOS CAROTENOIDES EM ORGANISMOS AQUÁTICOS SUL-AMERICANOS

Esse trabalho teve como objetivo conhecer as implicações do uso dietético de pigmentos carotenoides em alguns organismos aquáticos nativos da América do Sul com potencial aquícola. Os artigos se pautaram em: Testar a influência do uso de extrato de urucum Bixa orelana na dieta final de camarão branco do Pacífico Litopenaeus vannamei no sistema de bioflocos em fazenda de cultivo comercial na pigmentação do produto final; Testar o uso de astaxantina sintética na dieta do molusco ornamental Ampulária Pomacea diffusa na fase de crescimento e suas implicações; Determinar a acumulação de carotenoides e implicações no desempenho reprodutivo em reprodutores de Camarão da Amazônia Macrobrachium amazonicum mediante o uso de extratos de buriti Mauritia flexuosa, urucum Bixa orelana e astaxantina sintética; Determinar a influência do uso de astaxantina sintética na dieta de Pacamã Lophiosilurus alexandri no desenvolvimento, pigmentação, parâmetros sanguíneos e hepáticos. Os resultados dos experimentos demonstraram que a bixina aspergida na superfície da ração de camarão sofre lixiviação para a água salgada em níveis significativos a partir de 2 h de imersão. Os carotenoides presentes no biofloco do cultivo de camarão branco do Pacífico tiveram baixa correlação com a coloração (L*a*b*) dos camarões. O tratamento com sombreamento de 80% e alimentação com ração contendo 1.235 mg/Kg de bixina durante foi o que apresentou resultados mais estáveis na coloração dos camarões in natura e cozidos nas várias coordenadas do sistema CIELAB. As ampulárias alimentadas com ração comercial de camarão marinho apresentaram melhor conversão alimentar, elevados valores de eficiência alimentar e fator de condição acima da média inicial, o que demonstra que esse alimento pode ser utilizado para seu cultivo. A suplementação dietética de astaxantina sintética não resultou em aumento significativo da concentração desse pigmento na musculatura do molusco gastrópode. A alimentação com ração comercial melhora o fator de condição de reprodutores de camarão da Amazônia, principalmente no caso das fêmeas. A adição de pigmentos carotenoides na dieta desses crustáceos proporciona maior produção de espermatóforos e sobrevivência de espermatozoides. Dietas contendo bixina natural e astaxantina sintética contribuem para a acumulação de astaxantina corporal nos camarões e nos ovos. Não foi observada nenhuma diferença no desempenho dos animais testados com os diferentes pigmentantes. O pacamã consegue aproveitar a astaxantina da dieta para deposição de carotenoides no músculo e tegumento, contudo, sem influenciar no seu desenvolvimento e condição nutricional na fase de vida estudada pelo período de cultivo de dois meses. Desta forma, altas doses desse pigmento parecem contribuir para a redução dos níveis da enzima hepática AST sem influenciar a condição histológica do fígado. Para o melhor aproveitamento da astaxantina sintética como pigmentante e coloração mais equilibrada entre o músculo e o tegumento recomenda-se o nível de inclusão na dieta do pacamã de 100mg/Kg desse carotenoide.

This work aimed to know the implications of the dietary use of carotenoid pigments in some aquatic organisms native to South America with aquaculture potential. The articles were based on: Testing the influence of the use of anatto extract Bixa orelana on the final diet of the Pacific white shrimp Litopenaeus vannamei in the BFT system on commercial farm in pigmentation of the final product; To test the use of synthetic astaxanthin in the diet of the ornamental mollusk Ampularia Pomacea diffusa in the growth phase and its implications; To determine the accumulation of carotenoids and reproductive performance in breeding of Amazonia shrimp Macrobrachium amazonicum using the extracts of buriti Mauritia flexuosa, anatto Bixa orelana and synthetic astaxanthin; To determine the influence of the use of synthetic astaxanthin on the diet of Pacamã Lophiosilurus alexandri in the development, pigmentation, blood and liver parameters. The results of the experiments demonstrated that bixin sprinkled on the surface of the shrimp feed undergo leaching to salt water at significant levels from 2 h of immersion. The carotenoids present in the biofloc of the L. vannamei culture had a low correlation with the shrimp (L * a * b *) coloration. The treatment with 80% shading and feed containing 1,235 mg/Kg of bixin for 14 days was the one that presented the best results in the coloration of the shrimps in natura and cooked in the various coordinates of the CIELAB system. The ampularias fed commercial shrimp feed had better feed conversion, high feed efficiency and condition factor above the initial average, which demonstrates that this feed can be used for their cultivation. Dietary supplementation of synthetic astaxanthin did not result in a significant increase in the concentration of this pigment in the musculature of the gastropod mollusc. Feeding with commercial feed improves the condition factor of Amazon shrimp breeders, especially in the case of females. The addition of carotenoid pigments in the diet of these crustaceans provides greater production of spermatophores and sperm survival. Diets containing natural bixin and synthetic astaxanthin contribute to the accumulation of body astaxanthin in shrimp and eggs. No differences were observed in the performance of the animals tested with the different pigmenters. Pacamã is able to take advantage of dietary astaxanthin for deposition of carotenoids in muscle and integument. However, it did not influence its development and nutritional condition in the life stage studied by the two-month growing period. However, high doses of this pigment appear to contribute to the reduction of levels of the AST liver enzyme without influencing the histological condition of the liver. For the best use of synthetic astaxanthin as a pigment and more balanced staining between the muscle and the integument, the level of inclusion in the pacaman diet of 100 mg/Kg of this carotenoid is recommended

Sistema reprodutor masculino e espermiotaxonomia em Dromiidae: existe um só padrão de produção de fluido seminal, empacotamento do espermatozoide e transferência espermática em caranguejos?

Os caranguejos da família Dromiidae estão incluídos na seção Podotremata Guinot, 1977 e são pouco conhecidos do ponto de vista histo-morfológico e ultraestrutural. Na presente dissertação, apresentamos a ultraestrutura dos espermatozoides e os padrões anátomo-histológicos do sistema reprodutor dos dromiídeos que ocorrem no litoral brasileiro. Adicionalmente, o comportamento de cópula e a morfologia da espermateca em Hypoconcha parasitica foram estudados, com o intuito de levantar pistas sobre os mecanismos de fertilização em Dromiidae. As amostras foram processadas segundo as rotinas para histologia e histoquímica, microscopia, eletrônica de transmissão e varredura. As análises ultraestruturais do espermatozoide indicam que não existe um padrão distinto típico para os gametas entre todos os Dromioidea. Adicionalmente, apenas caracteres específicos foram observados, como a presença do flange esférico na zona eletronlúcida anterolateral e a zona acrossomal externa granular em H. parasitica, a ausência da zona acrossomal raiada e a presença de resquícios de flange em Moreiradromia antillensis e diferentes morfologias das câmaras perforatoriais entre todas as espécies estudadas. Apenas quando os caracteres da ultraestrutura dos espermatozoides dos Dromioidea foram comparados com Homolidae, Latreillidae e Raninidae, notaram-se características claras entre estas famílias. A produção do fluido seminal e o empacotamento dos espermatozoides no vaso deferente dos Dromiidae são totalmente distintos dos Eubrachyura. Hypoconcha parasitica, Hypoconcha arcuata, M. antillensis e Dromia erythropus não possuem espermatóforos, mas sim a presença de um cordão espermático interno envolto por secreções, os quais são mais similares aos Astacidae. O comportamento de cópula em H. parasitica é simples, sem corte e as fêmeas copulam em muda e intermuda. O armazenamento do material seminal na espermateca é distinto de Eubrachyura. A organização morfo-histológica da espermateca indica que a liberação dos espermatozoides para a fertilização ocorre por meio de contrações musculares da parede cuticular, com a participação do pleópodo 1 na movimentação dos ovócitos e espermatozoides, auxiliando o contato dos gametas.

The Dromiidae crabs are included in the section Podotremata Guinot, 1977 and are poorly known from histo-morphological and ultrastructural point of view. This dissertation shows the sperm ultrastructure and the anatomo-histological patterns of the reproductive system to the Brazilian dromiid species. In addition, we studied the mating behavior and spermathecal morphology in Hypoconcha parasitica to elucidate some points of the fertilization in dromiid crabs. The samples were processed according to the routine for histology and histochemistry and also, to transmission and scanning electron microscopy. There are no distinct ultrastructural characters to sperm ultrastructure among Dromioidea. Additionally, only specific characters were observed for studied Dromiidae as the presence of the spherical flange in the anterolateral eletron-lucid zone and the granular acrosomal outer zone founded in H. parasitica, absence of the acrosome ray zone and presence of the flange remnants in Moreiradromia antillensis. The perforatorial chambers show specific morphology among all species studied. The Dromiidae spermatozoa ultrastructure were not consistent to separate Dromiidae from the other Dromioidea. The ultrastructural differences were only found when compared Dromiodea with other Podotremata as Homolidae, Latreillidae e Raninidae. The seminal fluid production and spermatozoa package in the vas deferens of Dromiidae are totally different from Eubrachyura. In H. parasitica, Hypoconcha arcuata, M. antillensis and Dromia erythropus, the spermatophores are absent, and they show only a long internal spermatic cord surrounded by secretions in vas deferens, which is similar to the species of Astacidae. The mating behavior is simple without courtship and the females copulated in both soft and hard during moulting condition. The storage of seminal material inside the spermatheca is distinct from Eubrachyura. The morpho-histological organization of the spermathecae indicates that the process of sperm release for fertilization occurs through muscular contractions of its wall, and the pleopod 1 may promote the oocytes and spermatozoa movement to ensure the fertilization.

Morfologia e ultraestrutura do sistema reprodutor masculino do camarão sete- barbas Xiphopenaeus kroyeri (Heller, 1862): caracterização da maturidade morfológica e fisiológica

Esta dissertação visou estudar o sistema reprodutor masculino do camarão Xiphopenaeus kroyeri com o intuito de esclarecer a maturação dos machos e incluir mais informações sobre a morfologia e reprodução dos animais da tribo Trachypeneini. No primeiro capítulo foi testada a sincronia entre a maturidade morfológica, determinada pela presença de petasma, e a maturidade fisiológica, determinada pela observação microscópica de espermatozoides e espermatóforos no vaso deferente (VD). Para isso, o sistema reprodutor de indivíduos machos juvenis e adultos foi analisado histologicamente e descrito. A partir da classe de tamanho de 12 13 mm de comprimento de carapaça (CC) os indivíduos apresentam petasma, contudo a presença de espermatozoides e espermatóforos no sistema reprodutor deu-se somente a partir da classe de 14 15 mm de CC. O sistema reprodutor apresenta um par de testículos lobados fusionados, onde são produzidos os espermatozoides, os quais se mostram prontos ainda neste órgão. Os espermatozoides são direcionados aos VD, os quais são divididos em região proximal (PVD), onde os espermatóforos são montados, e regiões média (MVD) e distal (DVD), onde são produzidos os principais componentes do fluido seminal. Ao final do VD encontra-se a ampola, uma glândula adjacente ao VD que produz secreção ausente de espermatozoides e espermatóforos. No segundo capítulo, foram descritas ultraestruturalmente a espermatogênese e a produção de secreção pelo VD. No testículo, as células germinativas mostram três estágios da espermiogênese, tornado-se maduras com espinho acrossomal e prolongamento posterior na luz dos túbulos seminíferos. O VD mostra epitélio secretor, na qual a PVD produz secreções que empacotam os espermatozoides e formam a parede do espermatóforo. Ambas MVD e DVD apresentam várias camadas musculares e produzem somente um tipo de vesícula secretora, sendo a DVD responsável pela diluição do fluido seminal. A ampola apresenta epitélio estratificado e produz secreção por mecanismo holócrino. A morfologia do sistema reprodutor é semelhante à Rimapenaeus similis, na qual a ampola produz secreção para formação de plug espermático, podendo este ser o padrão para Trachypeneini.

In this work, we analyzed the male reproductive system of the shrimp Xiphopenaeus kroyeri to clarify the male maturation and add more information about the morphology and reproduction of the tribe Trachypeneini. In the first chapter, we investigated the synchrony between the morphological maturity, determined by the presence of petasma, and the physiological maturity, determined by the macroscopic observation of spermatozoa and spermatophores in the vas deferens (VD). For this, the male reproductive system of juveniles and adult males was histologically analyzed and described. From the size class of 12 13 mm of carapace length (CL) the individuals presented petasma, however the presence of spermatozoa and spermatophores was detected in the male reproductive system from the size class of 14 15 mm of CL. The reproductive system presented a pair of fusioned lobed testes, where the spermatozoa are produced, which are fully matured in this organ. The spermatozoa are directed to the VD, which are divided in proximal region (PVD), where the spermatophores are packed, and medial (MVD) and distal (DVD) regions, where the main compounds of the seminal fluid are produced. At the end of the VD is located the ampoule, an adjacent glandule which produces secretion absent of spermatozoa and spermatophores. In the second chapter, the spermatogenesis and the seminal fluid production were ultrastructurally described. In the testis, the germ cells showed three stages of spermiogenesis, becoming mature with an acrossomal spike and the posterior region, in the lumen of the seminiferous tubules. The VD showed secretory epithelium, in which the PVD produces secretions that pack the spermatozoa and constitute the spermatophore wall. Both MVD and PVD presented many muscular layers and produced only one type of secretory vesicle, being the DVD responsible for the dilution of the seminal fluid. The ampoule presented stratified epithelium and showed holocrine secretion. The morphology of the reproductive system is similar to Rimapenaeus similis, in which the ampoule produces the secretion to the formation of sperm plug, being a possible pattern to Trachypeneini.

Morfologia comparada do sistema reprodutor masculino e transferência espermática de caranguejos da família Trichodactylidae H. Milne Edwards, 1853 (Decapoda, Brachyura)

O sistema reprodutor masculino em caranguejos de água doce da família Trichodactylidae ainda é pouco conhecido. No capítulo I deste estudo foram analisados a morfologia do sistema reprodutor masculino, espermatogênese e produção de fluido seminal de Dilocarcinus pagei e Sylviocarcinus pictus, bem como a investigação experimental sobre a transferência espermática para verificar se o fluido seminal forma plug ou pacote espermático em D. pagei. O sistema reprodutor masculino em Trichodactylidae apresenta morfologia de U invertido, conectados pelos testículos, e vasos deferentes divididos em anterior (AVD), médio (MVD) e posterior (PVD). A espermatogênese ocorre de forma similar em ambas espécies, e a produção do fluido seminal para formação de espermatóforos ocorre na AVD, sendo a MVD responsável pelo armazenamento e PVD pela produção de fluido seminal adicional para transferência espermática. Não há formação de plug espermático, mas há formação de pacotes espermáticos quando em múltiplas cópulas com diferentes machos. No capítulo II desta dissertação foram investigados os espermatozoides de D. pagei, Zilchiopsis oronensis e Valdivia serrata em um enfoque filogenético, comparando também ao único tricodactilídeo descrito, Dilocarcinus septemdentatus. As espécies estudadas apresentam espermatóforos coenospérmicos. Zilchiopsis oronensis e V. serrata apresentaram também cleistospermia. Os espermatozoides apresentam morfologia globular, com opérculo pontiagudo fechado e vesícula acrossomal com três camadas concêntricas de diferentes eletrondensidades. As três espécies neste estudo, bem como D. septemdentatus apresentam uma placa núcleo-citoplasmática espessa e elétron-densa que provavelmente é uma autapomorfia para Trichodactylidae. Esta característica diverge dos outros caranguejos de água doce da Ásia e África, suportando a hipótese do surgimento de duas linhagens independentes de caranguejos dulcícolas.

The male reproductive system in freshwater crabs of the family Trichodactylidae is still little known. In Chapter I of this study, we studied the morphology of the male reproductive system, spermatogenesis and seminal fluid production of Dilocarcinus pagei and Sylviocarcinus pictus, as well as the experimental investigation on the sperm transfer to verify if the seminal fluid create a sperm plug or spermatic package in D. pagei. The male reproductive system in Trichodactylidae shows inverted U-shape, connected by the testes, and vas deferens divided into anterior (AVD), medium (MVD) and posterior (PVD). Spermatogenesis occurs in a similar way in both species, and seminal fluid production for spermatophore formation occurs in AVD, and MVD is responsible for storage and PVD for the production of additional seminal fluid for sperm transfer. There is no sperm plug formation, but there is formation of spermatic packets when in multiple copulations with different males. In Chapter II of this work, the spermatozoa of D. pagei, Zilchiopsis oronensis and Valdivia serrata were investigated in a phylogenetic context, also comparing to the tricodactylid described, Dilocarcinus septemdentatus. The species studied present coenospermic spermatophores. Zilchiopsis oronensis and V. serrata also presented cleistospermia. The morphology of the spermatozoa is globular, with closed operculum and acrosomal vesicle with three concentric layers in different electron densities. The three species in this study, as well as D. septemdentatus present a thick and electron dense nucleo-cytoplasmic plate that is probably an autapomorphy for Trichodactylidae. This feature differs from other freshwater crabs of Asia and Africa, supporting the hypothesis of the emergence of two independent lineages of freshwater crabs.

TOXICIDADE DE AGENTES CRIOPROTETORES EM CÉLULAS ESPERMÁTICAS DE Macrobrachium amazonicum (Heller 1862) (Decapoda, Palaemonidae)

As técnicas de criopreservação têm se destacado na aquicultura por viabilizar a estocagem e o transporte de material genético. Para tanto o uso de agentes crioprotetores são comumente empregados, contudo, quando utilizados em altas concentrações podem apresentar efeitos tóxicos. Assim, testes prévios de toxicidade são capazes de estabelecer as concentrações mais eficazes para os protocolos de criopreservação. Este estudo avaliou os efeitos de toxicidade dos agentes crioprotetores dimetilsulfóxido (DMSO), etilenoglicol (EG) e glicerol (GLY) na massa espermática de M. amazonicum. Para o presente experimento, 150 espermatóforos foram coletados de 30 machos de M. amazonicum, usando uma adaptação da técnica de leve compressão abdominal. A massa espermática foi extrusada, formando pools e submetida em DMSO, GLY e EG nas concentrações de 5, 10 e 15% v/v, preparada em solução salina estéril livre de cálcio (Ca-F) durante 30 minutos de tempo de equilíbrio. O percentual de espermatozoides vivos foi determinado por um teste modificado de coloração com eosina-nigrosina e os espermatozoides foram contados em microscópio óptico (40x) com auxílio de um hemicitômetro (câmara de Neubauer). Os resultados foram analisados utilizando análise de variância (ANOVA) e teste de Tukey HSD e Dunnett a um nível de significância de 5%. De acordo com o teste de toxicidade, o GLY foi o menos tóxico entre os crioprotetores testados em comparação com o controle (P < 0,05) com 47,5 ± 2,2 de espermatozoides vivos. Os testes de toxicidade de DMSO não revelaram diferença estatisticamente significativa (P < 0,05) nas concentrações de 5, 10 e 15% com 18,6 ± 1,8, 19,2 ± 2,0 e 16,5 ± 2,7 de espermatozoides vivos, respectivamente. Para testes com EG, a concentração de 15% resultou em 100% de mortalidade nas células espermáticas testadas. Este estudo sugere que a massa espermática de M. amazonicum pode ser criopreservado utilizando GLY 5% como agente crioprotetor.

The cryopreservation techniques have been highlighted in aquaculture by enabling the storage and transport of genetic material. For this, the use of cryoprotectants is commonly used, however, when used in high concentrations they may present toxic effects. Thus, prior toxicity tests are able to establish the most effective concentrations for cryopreservation protocols. This study evaluated toxicity effects of cryoprotectants agents dimethyl sulfoxide (DMSO), ethylene glycol (EG) and glycerol (GLY) on Macrobrachium amazonicum sperm mass. For the present experiment, 150 spermatophores were taken from 30 M. amazonicum males, collected using an adapting technique of gentle abdominal compression. The sperm mass were extruded in pools and submitted in DMSO, GLY and EG at concentrations of 5, 10 and 15% v/v, prepared in sterile Calcium Free saline (Ca-F saline) for 30 min of equilibration time. The survival of the sperm was determined by staining with eosin-nigrosin modified and sperm cells were counted in the optical microscope (40x) with the aid of a hemacytometer (Neubauer chamber). Results were analysed using analysis of variance (ANOVA), Tukeys and Dunnetts test at a 5% significance level. According cryoprotectant toxicity assay, GLY was less toxic among the tested cryoprotectants compared to control (P < 0.05) with 47.5 ± 2.2 of viability sperm. DMSO toxicity tests revealed no statistically significant difference (P < 0.05) between 5, 10 and 15% sperm viability with 18.6 ± 1.8, 19.2 ± 2.0 and 16.5 ± 2.7 respectively. For tests with EG, the concentration of 15% resulted in 100% mortality to tested sperm. This study suggests that sperm mass from M. amazonicum can be cryopreserved using GLY 5% as a cryoprotective agent.

O enigma da "reação espermatofórica": breve síntese do conhecimento sobre a estrutura e o funcionamento dos espermatóforos dos cefalópodes (Mollusca: Cephalopoda)

Coleoid cephalopods (squids, cuttlefishes, and octopods) produce elaborate spermatophores, which are transferred to the female during mating with the aid of a modified appendage called hectocotylus. During transfer, the spermatophores undergo the so-called spermatophoric reaction, i.e., a complex process of evagination of the ejaculatory apparatus that, ultimately, leads to the extrusion of the cement body and sperm mass. The present review summarizes the bulk of our knowledge on the morphology and functioning of this exclusive coleoid character, identifying gaps and defining strategies to stimulate advancements in this area. Few detailed morphological studies regarding this structure have yet been conducted, and much of the knowledge on the coleoid spermatophore was generated by classical studies of the 19th and early 20th centuries. Furthermore, investigations on the functioning of this structure are even rarer, the basic knowledge of the spermatophoric reaction being restricted to 19 species. There seems to be a consensus in the literature that two types of attachment of spermatophores occur in decapodiforms (i.e., squids and sepioids): superficial attachment, and deep (or intradermal) implantation. In superficial attachment, the base of the spermatangia ends up attached on the surface of the female's body, by means of the adhesive contents and, in some cases, attachment structures of the cement body; this type is found in several groups of decapodiforms (e.g., Loliginidae, Ommastrephidae, Sepiidae). In deep implantation, the spermatangia penetrate autonomously the integument, embedding themselves completely into the female tissue; this strategy is common to some oceanic and deep-sea species (e.g., Architeuthidae, Cranchiidae, Octopoteuthidae, Sepiolidae). The mechanism responsible for deep implantation remains unknown. In octopodiforms (octopods), the spermatophore is inserted inside the lumen of the female gonoduct, reaching the oviducal gland, where the spermathecae are located, or the ovarian cavity. Since the extracorporeal functioning of coleoid spermatophores must rely entirely on the intricate structure and organization of the tunics, membranes, and other structures composing the spermatophore, only detailed investigations of these components would provide the basis for comprehending its mechanics. This paper recommends the development of a specific, efficient protocol for whole-mount staining and permanent preparation of coleoid spermatophores, in order to enable expansion of spermatophore morphological descriptions in taxonomic and anatomical studies, and therefore enhance the knowledge of this unique, still enigmatic structure.

Cefalópodes coleóides (lulas, sépias e polvos) produzem espermatóforos muito complexos que são transferidos à fêmea durante a cópula por meio do hectocótilo, um apêndice modificado nos machos. Durante a transferência à fêmea, ocorre a chamada "reação espermatofórica", complexo processo de evaginação do aparato ejaculatório do espermatóforo, que conduz à exteriorização da massa espermática e corpo cimentante. A presente revisão sintetiza o conhecimento acerca da morfologia e funcionamento desta estrutura exclusiva dos coleóides, identificando lacunas e definindo estratégias que possibilitem avanços na área. Poucos trabalhos abordam com detalhes a morfologia e anatomia funcional dos espermatóforos dos cefalópodes, grande parte do conhecimento acerca da estrutura do espermatóforo tendo sido gerada por trabalhos clássicos do século XIX e início do século XX. Investigações acerca do funcionamento dos espermatóforos são consideravelmente mais raras, estando o conhecimento básico sobre a reação espermatofórica restrito a apenas 19 espécies de coleóides. A revisão da literatura especializada permite sugerir que existem dois tipos básicos de fixação de espermatóforos em Decapodiformes (lulas e sepióides): fixação superficial e implante profundo (ou intra-dérmico). Na fixação superficial, comum em diversas espécies (e.g., Loliginidae, Sepiidae, Ommastrephidae), a base dos espermatângios é aderida ao tecido-alvo aparentemente por meio do corpo cimentante, a partir de substâncias adesivas e, em alguns casos, estruturas de fixação. No implante profundo, comum em alguns grupos de lulas oceânicas e de águas profundas (e.g., Architeuthidae, Cranchiidae, Octopoteuthidae, Sepiolidae), os espermatóforos implantam-se inteiramente no corpo da fêmea, de forma autônoma. Permanece desconhecido o mecanismo responsável pelo implante profundo. Em Octopodiformes (polvos), o espermatóforo é inserido no gonoduto feminino, alcançando a glândula oviducal, onde estão localizadas as espermatecas, ou a cavidade do ovário. Como o funcionamento extracorpóreo dos espermatóforos depende exclusivamente da intrincada estrutura e organização de seus componentes (e.g., membranas e túnicas), somente investigações detalhadas dessas estruturas proverão as bases para a compreensão do funcionamento e da exata função do complexo espermatóforo dos coleóides. Recomenda-se o desenvolvimento de um protocolo simples e eficiente para coloração e preparação total de espermatóforos, de forma que seja possível expandir as descrições morfológicas do espermatóforo em estudos taxonômicos e anatômicos, permitindo, portanto, ampliação do conhecimento acerca desta enigmática estrutura.

O enigma da "reação espermatofórica": breve síntese do conhecimento sobre a estrutura e o funcionamento dos espermatóforos dos cefalópodes (Mollusca: Cephalopoda)

Coleoid cephalopods (squids, cuttlefishes, and octopods) produce elaborate spermatophores, which are transferred to the female during mating with the aid of a modified appendage called hectocotylus. During transfer, the spermatophores undergo the so-called spermatophoric reaction, i.e., a complex process of evagination of the ejaculatory apparatus that, ultimately, leads to the extrusion of the cement body and sperm mass. The present review summarizes the bulk of our knowledge on the morphology and functioning of this exclusive coleoid character, identifying gaps and defining strategies to stimulate advancements in this area. Few detailed morphological studies regarding this structure have yet been conducted, and much of the knowledge on the coleoid spermatophore was generated by classical studies of the 19th and early 20th centuries. Furthermore, investigations on the functioning of this structure are even rarer, the basic knowledge of the spermatophoric reaction being restricted to 19 species. There seems to be a consensus in the literature that two types of attachment of spermatophores occur in decapodiforms (i.e., squids and sepioids): superficial attachment, and deep (or intradermal) implantation. In superficial attachment, the base of the spermatangia ends up attached on the surface of the female's body, by means of the adhesive contents and, in some cases, attachment structures of the cement body; this type is found in several groups of decapodiforms (e.g., Loliginidae, Ommastrephidae, Sepiidae). In deep implantation, the spermatangia penetrate autonomously the integument, embedding themselves completely into the female tissue; this strategy is common to some oceanic and deep-sea species (e.g., Architeuthidae, Cranchiidae, Octopoteuthidae, Sepiolidae). The mechanism responsible for deep implantation remains unknown. In octopodiforms (octopods), the spermatophore is inserted inside the lumen of the female gonoduct, reaching the oviducal gland, where the spermathecae are located, or the ovarian cavity. Since the extracorporeal functioning of coleoid spermatophores must rely entirely on the intricate structure and organization of the tunics, membranes, and other structures composing the spermatophore, only detailed investigations of these components would provide the basis for comprehending its mechanics. This paper recommends the development of a specific, efficient protocol for whole-mount staining and permanent preparation of coleoid spermatophores, in order to enable expansion of spermatophore morphological descriptions in taxonomic and anatomical studies, and therefore enhance the knowledge of this unique, still enigmatic structure.

Cefalópodes coleóides (lulas, sépias e polvos) produzem espermatóforos muito complexos que são transferidos à fêmea durante a cópula por meio do hectocótilo, um apêndice modificado nos machos. Durante a transferência à fêmea, ocorre a chamada "reação espermatofórica", complexo processo de evaginação do aparato ejaculatório do espermatóforo, que conduz à exteriorização da massa espermática e corpo cimentante. A presente revisão sintetiza o conhecimento acerca da morfologia e funcionamento desta estrutura exclusiva dos coleóides, identificando lacunas e definindo estratégias que possibilitem avanços na área. Poucos trabalhos abordam com detalhes a morfologia e anatomia funcional dos espermatóforos dos cefalópodes, grande parte do conhecimento acerca da estrutura do espermatóforo tendo sido gerada por trabalhos clássicos do século XIX e início do século XX. Investigações acerca do funcionamento dos espermatóforos são consideravelmente mais raras, estando o conhecimento básico sobre a reação espermatofórica restrito a apenas 19 espécies de coleóides. A revisão da literatura especializada permite sugerir que existem dois tipos básicos de fixação de espermatóforos em Decapodiformes (lulas e sepióides): fixação superficial e implante profundo (ou intra-dérmico). Na fixação superficial, comum em diversas espécies (e.g., Loliginidae, Sepiidae, Ommastrephidae), a base dos espermatângios é aderida ao tecido-alvo aparentemente por meio do corpo cimentante, a partir de substâncias adesivas e, em alguns casos, estruturas de fixação. No implante profundo, comum em alguns grupos de lulas oceânicas e de águas profundas (e.g., Architeuthidae, Cranchiidae, Octopoteuthidae, Sepiolidae), os espermatóforos implantam-se inteiramente no corpo da fêmea, de forma autônoma. Permanece desconhecido o mecanismo responsável pelo implante profundo. Em Octopodiformes (polvos), o espermatóforo é inserido no gonoduto feminino, alcançando a glândula oviducal, onde estão localizadas as espermatecas, ou a cavidade do ovário. Como o funcionamento extracorpóreo dos espermatóforos depende exclusivamente da intrincada estrutura e organização de seus componentes (e.g., membranas e túnicas), somente investigações detalhadas dessas estruturas proverão as bases para a compreensão do funcionamento e da exata função do complexo espermatóforo dos coleóides. Recomenda-se o desenvolvimento de um protocolo simples e eficiente para coloração e preparação total de espermatóforos, de forma que seja possível expandir as descrições morfológicas do espermatóforo em estudos taxonômicos e anatômicos, permitindo, portanto, ampliação do conhecimento acerca desta enigmática estrutura.