Efeitos da terapia de fotobiomodulação sobre a matriz extracelular de membrana celular (cell sheet) de células-tronco da polpa dentária humana / Effects of photobiomodulation therapy on the extracellular matrix of human dental pulp cell sheets

A terapia de fotobiomodulação (PBMT do inglês photobiomodulation therapy) exerce efeitos benéficos em processos relevantes para a regeneração tecidual. A técnica de membranas celulares (CSs; cell sheets) pode gerar grande quantidade de células organizadas em uma matriz extracelular (MEC) produzida por essas células. A constituição de MEC das CSs pode ser de importância para a regeneração de tecidos. O colágeno tipo I, a fibronectina e a tenascina são proteínas da MEC já detectadas em CSs de células-tronco da polpa dentária humana. O objetivo deste estudo foi investigar os efeitos de diferentes parâmetros de PBMT sobre a arquitetura (histologia), composição proteica (Western blotting e imunoistoquímica) e ultraestrutura (MEV e MET) da MEC de CSs de células-tronco da polpa dental humana. As células-tronco foram descongeladas e recaracterizadas através da análise de seu perfil imunofenotípico avaliado pela expressão de moléculas de superfície utilizando citometria de fluxo para marcadores associados a células-tronco mesenquimais (MSC do inglês mesenchymal stem cells; CD105, CD146 e CD44) e não associados (CD45, CD34 e CD14). As CSs foram formadas em placas de cultivo celular após 15 dias em cultura em meio clonogênico suplementado com vitamina C (20 ?g/ml). As culturas celulares foram alocadas em 3 grupos experimentais diferentes, como segue: Controle: nenhum tratamento adicional; PBMT1 e PBMT2. A PBMT foi realizada com um laser diodo vermelho contínuo, aplicando-se os seguintes parâmetros gerais: 660nm, 20mW, 0,028cm2 e 0,71W/cm2. Os parâmetros do PBMT1 foram: 4s, 3J/cm2 e 0,08J por ponto, e o PBMT2: 7s, 5J/cm2 e 0,14J por ponto. As irradiações foram realizadas em dias alternados durante todo o período do experimento, em modo pontual (5 pontos / poço ou 13 por placas de 100 mm de diâmetro) em contato com a base da placa. Após a formação das CSs, 15 dias após o plaqueamento, estas foram submetidas a análises histológica, imunoistoquímica, Western blotting, microscopia eletrônica de transmissão e de varredura. Comparações estatísticas foram realizadas (p <0,05). As células apresentaram perfil imunofenotípico clássico de MSCs, mostrando a expressão de marcadores associados a MSCs, enquanto a expressão dos marcadores não associados a MSCs estavam ausentes. O colágeno tipo I, colágeno tipo III e fibronectina estavam presentes no MEC das CSs. Western blotting revelou maior síntese de fibronectina nas CSs submetidas ao PBMT1. A ultraestrutura geral dos CSs foi diversa nos 3 grupos experimentais. As CSs do grupo PBMT1 apresentaram aspecto epitelióide, enquanto no grupo PBMT2 as CSs apresentaram células isoladas e fusiformes dispostas em feixes unidirecionais. MET identificou uma MEC mais madura e sinais de apoptose nos grupos submetidos à PBMT. A PBMT influenciou a composição e ultraestrutura da MEC de CSs de células-tronco da polpa dentária. Assim, a PBMT pode ser importante na determinação da qualidade mecânica das CSs, o que pode favorecer a terapia celular, facilitando o transplante das células-tronco.

Efeito da Laserfototerapia associada ou não à Vitamina C na indução de membranas celulares (cell sheets) de células-tronco da polpa dentária humana / Effect of laserphototherapy associated or not to Vitamin C in the induction of cell sheets of human dental pulp stem cells

Membranas celulares (MCs; Cell Sheets), constituídas por células-tronco (CTs), são autodestacáveis da placa de cultivo, e sem subcultivos geram grande quantidade de células que podem ser transplantadas de maneira mais próxima da fisiologia celular, mantendo-se as ligaçُões celulares e a matriz extracelular produzidas em cultura. O Ácido ascórbico ou vitamina C (VC) tem efeito indutor da formação destas MCs, aumentando a longevidade e tempo de indiferenciação das CTs. A similaridade observada entre respostas biológicas da VC em MCs e aquelas da Laserfototerapia (LFT) sobre células e tecidos, nos levou à hipótese de que estas terapias poderiam se complementar melhorando o prognóstico de futura aplicação clínica dessas MCs em regenerações tecidos de interesse odontológico. Para testar essa hipótese, LFT e VC foram aplicadas associadas ou não na indução de MCs de células-tronco da polpa dentária humana (hDPSCs). Para tanto, hDPSCs descongeladas, que expressaram níveis típicos de marcadores de superfície de células-tronco mesenquimais, foram plaqueadas em placas de 6 poços (5x104 células por poço). Vinte e quatro horas depois do plaqueamento as culturas foram submetidas aos tratamentos dos grupos experimentais: Controle: hDPSCs em P3 cultivadas com meio clonogênico; Senescente: hDPSCs em P27 cultivadas com meio clonogênico; VC: P3 cultivadas com meio clonogênico acrescido de VC (20µg/ml); Laser: P3 cultivadas com meio clonogênico e submetido à LFT (contato e pontual - 5 pontos / poço, 660 nm, 20 mW, 0,028 cm², 0,71 W/cm², 7 segundos, 5 J/cm², 0,14 J por ponto, 48 horas de intervalo) e Laser+VC: P3 cultivadas com meio clonogênico acrescido de VC e submetido

à LFT. Em 24 horas, 7 e 13 dias as hDPSCs dos diferentes grupos experimentais foram observadas macro e microscopicamente, e atividade da enzima telomerase foi avaliada por PCR-TRAP, complementado por ELISA. Para a avaliação da expressão de genes relacionados à natureza e indiferenciação (Mitofilina e Oct 4) e à longevidade (fase catalíca da enzima telomerase - hTERT); bem como à senescência das células do grupo senescente (­­ß-galactosidase), as hDPSCs de todos os grupos experimentais foram submetidas ao RT-qPCR As hDPSCs foram capazes de formar MCs somente nos grupos VC e Laser+VC (100%), entre 10 e 13 dias. As MCs do grupo Laser+VC apresentaram maior facilidade na manipulação. Atividade de Telomerase nas hDPSCs foi observada somente em 24 horas (Controle e LFT) e em 7 dias (VC e Laser+VC). Os marcadores de indiferenciação (Oct 4) e mesenquimal (mitofilina), bem como a hTERT foram expressos nas hDPSCs de todos os grupos experimentais. O Oct4 e o hTERT, em 7 dias, apresentaram expressões significativamente maiores nos grupos VC e Laser+VC em comparação com os demais (p < 0,0001, p = 0,0009, respectivamente). A expressão da mitofilina foi significativamente maior no grupo Laser+VC, em 7 dias (p =0,033). A técnica de obtenção de MCs de hDPSCs por essa metodologia foi considerada adequada para ser testada em procedimentos regenerativos. A LFT quando associada à VC não interferiu na formação das MCs, nem na manutenção da longevidade e indiferenciação das hDPSCs. Adicionalmente, a LFT melhorou a manipulação das MCs. Assim sendo, a associação de VC e LFT na indução de MCs parece promissora para futura utilização de MCs na odontologia regenerativa.

Cell Sheets, consisting of stem cells (SCs) are self detachable from the cultivation plate, and with no subcultivation can generate large amount of cells. The cell sheets can be transplanted closer to cell physiology environment by keeping the cell connections and the extracellular matrix produced in culture. Ascorbic acid or Vitamin C (VC) has inductive effect on cell sheet formation, increasing the longevity and the stemness of the cell for long period of time. The similarity between biological responses of VC in cell sheets and those of Laserphototherapy (LPT, Laser) on cells and tissues led us to hypothesize that these therapies could improve the prognosis of future clinical application of these cell sheets in regeneration of dental tissues. To test this hypothesis, LPT and VC were applied, associated or not, to induce human dental pulp stem cells (hDPSCs). Therefore, hDPSCs, which expressed typical levels of mesenchymal stem cell surface markers, were plated in 6-well plates (5x104 cells per well). Twenty-four hours later they were subjected to the treatment of experimental groups: Control: hDPSCs in P3 cultured with regular medium; Senescent: hDPSCs in P27 cultured with regular medium; VC: P3 cultured with regular medium supplemented with VC (20 ?g/ml); Laser: P3 cultures with regular medium and submitted to LPT (punctual and contact mode-5 points / well, 660 nm, 20 mW, 0.028 cm², 0.71 W/cm²,

7 sec, 5 J/cm², 0.14 J per point, 48 hours-intervals) and Laser+VC: P3 cultured with regular medium supplemented with VC and submitted to LPT Within 24 hours, 7 and 13 days the hDPSCs of the different experimental groups were observed macroscopically and microscopically, and the telomerase enzyme activity was assessed by PCR-TRAP, complemented by ELISA. To evaluate the expression of genes related to the nature and differentiation (Mitofilina and Oct 4), longevity (catalytic phase of telomerase-hTERT enzyme), and the senescence of the senescent group cells (?-galactosidase), the hDPSCs of all experimental groups were subjected to RT-qPCR. The RT-qPCR data were compared by ANOVA complemented by the Tukey's test (p <= 0.05). The hDPSCs were able to form cell sheets only in the VC and Laser+VC groups (100%). Additionally, the cell sheets of the Laser+VC group presented easier handling...

Altered ß-catenin expression in oral mucosal dysplasia: a comparative study

Objective The current study aimed to investigate the β-catenin expression in oral leukoplakia (OL) with different degrees of epithelial dysplasia and normal oral mucosa.Material and Methods Formalin-fixed, paraffin-embedded tissue samples of 39 OL (mild dysplasia n=19, moderate dysplasia n=13, and severe dysplasia n=7), and 10 normal oral mucosa (control group) were submitted to immunohistochemical reactions to anti-β-catenin primary antibody. A qualitative β-catenin analysis was performed based on the percentage of positive cells. The cellular location and the epithelial layer were also considered. The Chi-square test and the Fisher’s exact test were used to verify possible differences in the β-catenin expression among the OL groups. A p-value of <0.05 was considered statistically significant.Results Membranous expression of β-catenin in parabasal and basal layers was gradually lost in the higher degrees of epithelial dysplasia. In normal oral mucosa, β-catenin was detected only in the cytoplasmic membrane. However, a significant increase in cytoplasmic β-catenin could be observed between mild and moderate dysplasia (Fisher Exact test - p<0.001) and between mild and severe dysplasia (p<0.001).Conclusions The β-catenin cytoplasmic expression observed in this study may represent the initial stage of modifications in the E-cadherin-catenin complex, along with morphological cellular changes.

Avaliação histológica do processo de reparo ósseo na presença da proteína morfogenética óssea (Gen-Pro) associada com uma membrana biológica (Gen-Derm) / Histological evaluation of bone repair in the presence of bone morphogenetic protein (Gen-Pro) associated with a barrier membrane

Os autores avaliaram, histologicamente, o processo de reparo ósseo na presença da proteína morfogenética óssea bovina (Gen-Pro-Genius-Baumer-proteína morfogenética óssea bovina, cedida pelo Departamento de Bioquímica da FOB-USP) associada com uma membrana biológica (Gen-Derm-Genius-Baumer-membrana de cortical óssea bovina liofilizada, cedida pelo Departamento de Bioquímica da FOB-USP). Os resultados revelaram que a fase inicial do processo de reparo ósseo foi retardada na presença de tal associação de biomateriais, porém, à medida em que estes foram absorvidos com o passar do tempo, o processo de reparo ósseo desenvolveu-se rapidamente.