Prevalência, susceptibilidade antimicrobiana e virulência de bacilos Gram-negativos e enterococos isolados do biofilme subgengival associado à doenca periodontal' / Prevalence, antimicrobial susceptibility and virulence of Gram-negative bacilli and enterococci isolated from subgingival biofilm associated with periodontal disease

Objetivos: A cavidade oral pode atuar como reservatório de vários patógenos de importância clínica, incluindo bacilos Gram-negativos (BGN) e Enterococcus spp. Essas espécies podem ainda aumentar em uma condição disbiótica, como ocorre nas doenças periodontais. Assim, este estudo teve como objetivo determinar a prevalência, susceptibilidade antimicrobiana e presença de fatores de virulência de BGN e enterococos isolados do biofilme subgengival de indivíduos com diferentes condições periodontais, correlacionando esses achados com parâmetros clínicos e composição da microbiota subgengival. Métodos: Na análise dos BGN, amostras de biofilme subgengival foram obtidas de indivíduos com Saúde Periodontal (SP, n=81), Gengivite (G, n=74) e Periodontite (P, n=207); para Enterococcus spp., amostras foram coletadas de 139 indivíduos com SP, 103 com G e 305 com P. As amostras foram cultivadas em meio seletivo e as colônias isoladas e identificadas por MALDI-ToF. A susceptibilidade antimicrobiana foi determinada por disco-difusão (CLSI); já os genes de virulência de enterococos e genes codificadores de ESBL e carbapenemases em BGN foram pesquisados por PCR. A produção de ESBL e carbapenemases por BGN foi avaliada pelo teste de sinergia de disco duplo e hidrólise de imipenem por espectrofotometria, respectivamente. A microbiota subgengival desses indivíduos foi determinada pelo Checkerboard. Diferenças entre os grupos foram avaliadas pelos testes de KruskalWallis, Mann-Whitney e Qui-quadrado. Resultados: BGN foram isolados em 36.2% das amostras, com maior prevalência (p<0,001) em pacientes com P (46.4%) em comparação com SP (22.2%) e G (22.9%). Pseudomonas aeruginosa (27.5%), Enterobacter cloacae (16.8%) e Enterobacter asburiae (10.7%) foram as espécies mais predominantes. Resistência/sensibilidade reduzida a ≥ 1 antimicrobiano foi encontrada em 60% dos BGN, mas apenas 4.6% eram multirresistentes. Altas taxas de resistência (>40%) foram observadas na família Enterobacteriacea para cefoxitina, cefalotina, amoxicilina- clavulanato e cefazolina. Uma única cepa de K. pneumoniae apresentou resistência/sensibilidade reduzida ao imipenem, embora o fenótipo ESBL e a detecção dos genes codificadores de beta-lactamases foram negativos. Enterococcus spp. foram isolados em 7.4% de todas as amostras, 53.7% eram E. faecalis. Essas espécies foram mais predominantes na P (9.8%) e G (7.8%) do que na SP (2.2%, p< 0,05); entretanto não houve correlação com os níveis de gravidade da P. Altas taxas de resistência/susceptibilidade reduzida foram observadas para ciprofloxacina, eritromicina e rifampicina. Os fatores de virulência mais predominantes incluíram ace, asa e esp, todos relacionados à formação de biofilme e colonização. F. nucleatum foi mais prevalente na microbiota de indivíduos enterococos +. Por outro lado, Dialister pneumosintes foi pouco detectado em indivíduos portadores de enterococos bopD+. Estreptococos orais foram prevalentes (>70%) na microbiota de pacientes que apresentavam enterococos suceptíveis à doxiciclina (p<0,05), frequentemente bopD- e esp- (p<0,01). Conclusão: Uma prevalência elevada de BGN da família Enterobacteriacea com resistência a cefalosporinas e penicilina é observada na microbiota subgengival de indivíduos com P. Enterococcus spp., principalmente E. faecalis são pouco frequentes na microbiota subgengival associada à SP, porém aumentam significativamente nas doenças periodontais. Os mesmos apresentam diversos genes de virulência compatíveis com destruição tecidual, bem como resistência a antimicrobianos de uso na clínica periodontal, o que pode limitar uma resposta terapêutica favorável. (AU)

Background/Aim: The oral cavity can act as a reservoir for several pathogens of clinic importance, including Gram-negative bacilli (GNB) and Enterococcus spp. These species may increase even more in a dysbiotic condition as seen in periodontal diseases. Thus, this study aimed to determine the prevalence, antimicrobial susceptibility and virulence factors of GNB and enterococci isolated from subgingival biofilm of individuals with different periodontal conditions, correlating these findings with clinical parameters and the composition of the subgingival microbiot. Methods: For GNB analysis, subgingival biofilm was obtained from individuals with periodontal health (PH, n=81), gingivitis (G, n=74) and periodontitis (P, n=207), whereas for enterococci isolation samples were taken from 139 patients with PH, 103 with G, and 305 with P. Samples were cultivated in selective media and isolated colonies were identified by MALDI-ToF. Antimicrobial susceptibility was determined by CLSI disk diffusion, whereas virulence genes by PCR. Production of ESBL and carbapenemases were evaluated by double disk synergy test and spectrophotometric detection of imipenem hydrolysis, respectively, and ESBL and carbapenemase encoding genes were surveyed by PCR. The subgingival microbiota was determined by checkerboard. Differences among groups were examined by Chi-square, Kruskal-Wallis or Mann-Whitney tests. Results: GNB were isolated from 36.2% of all samples, with a significantly greater prevalence (p<0.001) in P patients (46.4%) compared to PH (22.2%) and G (22.9%). Pseudomonas aeruginosa (27.5%), Enterobacter cloacae (16.8%) and Enterobacter asburiae (10.7%) were the most predominant species. Resistance/reduced sensitivity to ≥ 1 antimicrobial was found in 60% of GNB, but only 4.6% were multidrug resistant. High resistance rates (>40%) were seen in the Enterobacteriaceae family for cefoxitin, cephalotin, amoxicillin-clavulanate, and cefazolin. One strain of K. pneumoniae showed resistance/reduced sensitivity to imipenem, although the ESBL-phenotype and PCR targeting beta-lactamase encoding genes were negative. Enterococcus spp. were isolated from 7.4% of all samples; 53.7% were E. faecalis. Enterococci were more predominant in P (9.8%) and G (7.8%) samples than PH (2.2%; p<0.05), however there were no associations with distinct levels of disease severity. High rates of low susceptibility/resistance were seen for ciprofloxacin, erythromycin and rifampicin. Predominant virulence factors included ace, asa and esp, all related to colonization and biofilm formation. F. nucleatum was prevalent in the microbiota of enterococci+ individuals. In contrast, lower frequency of Dialister pneumosintes was found in patients carrying bopD+ enterococci. Oral streptococci were prevalent (>70%) in the microbiota of patients carrying enterococci susceptible to doxycycline (p<0.05), which were also frequently bopD- and esp- (p<0.01). Conclusion: A high prevalence of GNB of the Enterobacteriacea family, resistant to cephalosporins and penicillins is observed in the subgingival microbiota of patients with P, Enterococcus spp., mainly E.faecalis are not commonly detected in the healthy-related subgingival microbiota, however their frequency increases significantly in patients with periodontal diseases. These species carry several genes related to tissue destruction, as well as resistance to antimicrobials routinely used in the periodontal clinic, which may hinder a successful therapeutic response. (AU)

Caracterização do papel do receptor do tipo Toll 4 (TLR4) em infecção por Aggregatibacter actinomycetemcomitans / The role of TLR4 (Toll like receptor 4) in the recognition of Aggregatibacter actinomycetemcomitans

Os tecidos periodontais estão em confronto continuo com microorganismos capazes de disparar mecanismos da resposta imune inata, dando origem ao infiltrado inflamatório. Estudos recentes mostraram a importancia dos receptores do tipo Toll (TLRs) na fase inicial de reconhecimento de diferentes patogenos. A participação de receptores tipo Toll (TLRs) na resposta de neutrófilos e macrófagos frente a periodontopatógenos precisa ser determinada. Nesse estudo procuramos caracterizar o infiltrado inflamatório presente no peritônio de animais deficientes de TLR4^-/-, avaliar a atividade fagocítica, bem como a produção de óxido nítrico (NO) e a atividade de mieloperoxidase (MPO) no curso da infecção por Aggregatibacter actinomycetemcomitans. A ausência de TLR4 não influenciou a quimiotaxia de neutrófilos e macrófagos para o local da infecção, a produção de óxido nítrico, a atividade de MPO e a viabilidade celular. No entanto, neutrófilos e macrófagos de animais TLR4^-/- apresentaram menor atividade fagocítica quando comparado ao grupo controle (camundongos WT). Em relação a doença periodontal induzida experimentalmente com Aggregatibacter actinomycetemcomitans em camundongos deficientes de TLR4, os resultados mostraram que 100% dos animais deficientes de TLR4 sobreviveram a infecção durante o período de observação. Em relação a análise de perda óssea, os dados revelaram uma menor perda progressiva de osso alveolar na região dos molares de animais deficientes de TLR4. A ausência do receptor interferiu na disseminação da bactéria, uma vez que se observou um grande número de bacilos no linfonodo e baco dos animais que não expressaram TLR4, diferente do observado para os animais selvagens (WT). Os resultados indicam a importância da sinalização via TLR4 durante a resposta imune contra Aggregatibacter actinomycetemcomitans (AU).

Aggregatibacter actinomycetemcomitans is an oral gram negative bacteria that contributes to periodontitis progression. Isolated antigens from A. actinomycetemcomitans could be activating innate immune cells through Toll-like receptors (TLRs), molecules that recognize structural components conserved among microorganisms. In this study, we evaluated the role of TLR4 in the recognition of Aggregatibacter actinomycetemcomitans. Neutrophils and macrophage from TLR4 deficient mice and WT mice were collected and used for the subsequent assays. The phagocytosis of leukocytes against A. actinomycetemcomitans and the presence of apoptotic cells were determined by flow cytometry. The in vivo and in vitro production of NO and MPO was evaluated 24h after A. actinomycetemcomitans challenge. In addition, we examined the mechanisms that modulate the outcome of A. actinomycetemcomitans-induced periodontal disease in TLR4^-/- mice. The results show that inflammatory cells influx in peritoneal cavity of TLR4^-/- mice was similar to that observed into their littermate controls. The phagocytic activity was diminished by cells from TLR4^-/- mice. In addition, we did not observe difference in NO and MPO production and the frequency of apoptotic cells between cells from TLR4^-/- and WT mice. The results showed that TLR4-deficient mice developed less severe periodontitis after A. actinomycetemcomitans infection, characterized by significantly lower bone loss and inflammatory cell migration to periodontal tissues. Together, these data demonstrate the role TLR4 signals for neutrophils activation afterA. actinomycetemcomitans infection and development of periodontal disease.

Avaliaçäo clínica e microbiológica da saúde periodontal de crianças portadoras de fissura completa de lábio e palato unilateral comparada a de crianças sem fissuras na mesma faixa etária (5-6 anos) / Clinical and microbiological evaluation of periodontal condition in 5-6 years old children with unilateral complete cleft lip and palate compared to normal controls

Crianças portadoras de fissura de lábio e palato apresentam alteraçöes anatômicas decorrentes da própria anomalia e dos procedimentos terapêuticos para a sua reabilitaçäo, que podem predispô-las a um maior acúmulo de placa bacteriana, principalmente na regiäo anterior da maxila. Com o objetivo de comparar as condiçöes clínicas, através da utilizaçäo dos índices de placa (IP) e gengival (IG) de Loe (1967) e a presença das bactérias P. gingivalis, P. nigrescens e T. denticola, através da técnica "Slot Immunoblot", foram avaliadas 57 crianças com dentiçäo decídua e idades entre 5 e 6 anos, sendo 30 portadoras de fissura completa de lábio e palato unilateral (grupo experimental) e 27 crianças sem fissura (grupo controle). O IP médio do grupo experimental (1,82 ñ 0,38) foi superior ao do grupo controle (1,63 ñ 0,38), embora sem diferença estatisticamente significante, enquanto o IG médio do grupo experimental (1,05 ñ 0,22) foi significantemente superior ao do grupo controle (0,79 ñ 0,33) (p<0,05). No grupo experimental a área da fissura (2 sítios), com IP médio de 2,04 ñ 0,58 e IG médio de 1,11 ñ 0,26, quando comparada à regiäo posterior (4 sítios), com IP médio de 1,74 ñ 0,37 e IG médio de 1,04 ñ 0,26, mostrou difrença estatisticamente significante somente em relaçäo ao IP. Considerando a severidade, a maioria das crianças dos dois grupos apresentou IP de grau moderado, 73,33 por cento para o grupo experimental e 81,48 por cento para o grupo controle; enquanto, para o IG, a maioria apresentou severidade de grau baixo, sendo de 53,33 por cento para o grupo experimental e de 70,37 por cento para a grupo controle...

Lesöes periapicais podem ser infectadas? Visäo crítica do problema / The periapical lesions may be infected? The critical visual of the problem

O objetivo deste trabalho foi destacar o papel da infecçäo periapical no fracasso da terapia endodôntica. Säo descritos vários mecanismos desenvolvidos por bactérias que as permitem sobreviver no interior de lesöes periapicais

Avaliaçäo da presença e localizaçäo de bactèrias nos canais radiculares e nas lesöes periapicais crônicas pelo método de coloraçäo de Brown e Brenn / Evaluation of the presence and localization of bacteria in root canals and chronic periapical lesions by the Brown and Brenn staining method

Para avaliar a presença e localizaçäo de bactérias nos canais radiculares e nas lesöes periapicais crônicas, foram examinadas pela coloraçäo de Brown e Brenn 17 dentes humanos extraídos, apresentando necrose pulpar e lesöes firmemente aderidas ao ápice. Verificamos ser alta a freqüência de bactérias nos canais, com predomínio de cocos e bacilos Gram positivos e de bacilos Gram negativos, detectados em 57(95 por cento), 55(91,7 por cento) e 51(85 por cento) das 60 lâminas em estudo, respectivamente. Nas lesöes periapicais as bactérias foram detectadas com graus de infecçäo leve e moderado, com predomínio de cocos e bacilos Gram positivos, presentes em 35(58,3 por cento) e 27(45 por cento) das lâminas examinadas, respectivamente. As bactérias foram localizadas preferencialmente entre o ápice e a lesäo, nas imediaçöes do forame

Gengivite e periodontite: detecçäo de antígeno e anticorpo pelas técnicas de imunofluorescência e imunoeletroforese em relaçäo ao Bacteroides melaninogenicus subsp. intermedius / Gingivitis and periodontitis: detection of antigen and antibody by immunofluorescence and immunoelectrophoresis in relation about Bacteroides melaninogenicus subsp. intermedius

A doença periodontal inflamatória é considerada como resultante da açäo das bactérias contidas na placa dentária. Uma vez que as bactérias inteiras näo säo encontradas na intimidade dos tecidos periodontais é provável que a doença ocorra devido à difusäo dos seus produtos através do epitélio do sulco gengival, provocando uma resposta inflamatória e imune. Assim, torna-se importante identificar esses produtos, principalmente das bactérias que predominam na placa dental, como é o caso do Bacteroides melaninogenicus e suas subespécies, que tem se distinguido como patógenos importantes na doença periodontal. O propósito deste estudo foi verificar a presença de antígenos solúveis de B. melaninogenicus subsp. intermedius nos tecidos gengivais, bem como de anticorpos séricos para o mesmo microrganismo em portadores de doença periodontal...