Efeitos da nanopartícula de ácido poli lático-co-glicólico (PLGA) associada ao cloridrato de metformina na doença periodontal em ratos diabéticos / Effects of polylactic-co-glycolic acid (PLGA) nanoparticle associated with metformin hydrochloride on periodontal disease in diabetic rats

Existe uma associação entre diabetes e a periodontite, e a Metformina (MET) além de controlar os níveis glicêmicos, tem apresentado efeitos antiinflamatórios e na diminuição da perda óssea periodontal. Ao se veicular a MET a um sistema de nanopartículas pode-se apresentar a vantagem de aumento da eficácia terapêutica. Objetivos: esse estudo consistiu na avaliação dos efeitos antiinflamatórios, perda óssea e disponibilidade in vitro/in vivo de uma nanopartícula de ácido poli lático-co-glicólico (PLGA) associada à MET em um modelo de periodontite induzida por ligadura. Materiais e métodos: o PLGA carreado com diferentes doses da MET foi caracterizado pelo seu diâmetro médio, tamanho da partícula, índice de polidispensão e eficiência de aprisionamento. Foram utilizados ratos machos da linhagem Wistar, divididos aleatoriamente, em grupos controles e experimentais com diferentes doses de MET associadas ou não ao PLGA, os quais receberam diferentes tratamentos. Amostras de maxilas e tecidos gengivais foram utilizadas para avaliação de perda óssea e inflamação, por meio da microtomografia computadorizada, histopatológico, imunohistoquímica, análise de citocinas inflamatórias e expressão gênica de proteínas por RT-PCR quantitativo. Para o ensaio de liberação in vitro, utilizou-se o dispositivo de células de difusão vertical de Franz estáticas. Para a disponibilidade in vivo, as amostras de sangue foram coletadas em diferentes intervalos de tempo e analisadas por cromatografia líquida de alta eficiência acoplado a espectrometria de massas (HPLC-MS/MS). Resultados: o diâmetro médio das nanopartículas de PLGA carreadas com MET estava em um intervalo de 457,1 ± 48,9 nm (p <0,05) com um índice de polidispersidade de 0,285 (p <0,05), potencial Z de 8,16 ± 1,1 mV (p <0,01) e eficiência de aprisionamento (EE) de 66,7 ± 3,73. O tratamento com a MET 10 mg / kg + PLGA mostrou uma baixa concentração de células inflamatórias, fraca imunomarcação para RANKL, Catepsina K, OPG e osteocalcina. Diminuição dos níveis de IL-1ß e TNF-α (p <0,05), aumento da expressão gênica do AMPK (p <0,05) e diminuição do NF-κB p65, HMGB1 e TAK-1 (p <0,05). O 10 mg/kg MET + PLGA foi liberado no ensaio in vitro sugerindo um modelo cinético de difusão parabólica com um perfil de liberação que atinge 50% de seu conteúdo em 2h e permanece em liberação constante em torno de 60% até o final de 6h. O ensaio in vivo mostrou o volume aparente de distribuição Vz/F (10 mg/kg MET + PLGA, 46,31 mL/kg vs. 100 mg/kg MET + PLGA, 28,8 mL/kg) e o tempo médio de residência MRTinf (PLGA + MET 10 mg /kg, 37,66h vs. MET 100 mg/kg, 3,34h). Conclusão: o PLGA carreado com MET diminuiu a inflamação e a perda óssea na periodontite em ratos diabéticos. O 10 mg/kg MET + PLGA teve uma taxa de eliminação mais lenta em comparação com o MET 100 mg/kg. A formulação modifica os parâmetros farmacocinéticos, como volume de distribuição aparente e tempo médio de residência (AU).

There is an association between diabetes and periodontitis, and Metformin (MET) in addition to controlling glycemic levels, has shown anti-inflammatory effects and decreased periodontal bone loss. By transferring MET to a nanoparticle system, the advantage of increasing therapeutic efficacy can be presented. Objectives: this study consisted of evaluating the antiinflammatory effects, bone loss and in vitro/in vivo availability of a polylactic-co-glycolic acid (PLGA) nanoparticle associated with MET in a ligature-induced periodontitis model. Materials and methods: PLGA loaded with different doses of MET was characterized by its mean diameter, particle size, polydispension index and entrapment efficiency. Male Wistar rats were used, randomly divided into control and experimental groups with different doses of MET associated or not with PLGA, which received different treatments. Samples of jaws and gingival tissues were used to assess bone loss and inflammation, using computed microtomography, histopathology, immunohistochemistry, analysis of inflammatory cytokines and gene expression of proteins by quantitative RT-PCR. For the in vitro release assay, the static Franz vertical diffusion cell device was used. For in vivo availability, blood samples were collected at different time intervals and analyzed by high performance liquid chromatography coupled with mass spectrometry (HPLC-MS/MS). Results: the mean diameter of MET-loaded PLGA nanoparticles was in the range of 457.1 ± 48.9 nm (p <0.05) with a polydispersity index of 0.285 (p <0.05), Z potential of 8.16 ± 1.1 mV (p <0.01) and trapping efficiency (EE) of 66.7 ± 3.73. Treatment with MET 10 mg/kg + PLGA showed a low concentration of inflammatory cells, weak immunostaining for RANKL, Cathepsin K, OPG and osteocalcin. Decreased IL-1ß and TNF-α levels (p <0.05), increased AMPK gene expression (p <0.05) and decreased NF-κB p65, HMGB1 and TAK-1 (p <0. 05). The 10 mg/kg MET + PLGA was released in the in vitro assay suggesting a kinetic model of parabolic diffusion with a release profile that reaches 50% of its content in 2h and remains in constant release around 60% until the end of 6h . The in vivo assay showed the apparent volume of distribution Vz/F (10 mg/kg MET + PLGA, 46.31 mL/kg vs. 100 mg/kg MET + PLGA, 28.8 mL/kg) and the mean MRTinf residency (PLGA + MET 10 mg/kg, 37.66h vs. MET 100 mg/kg, 3.34h). Conclusion: MET-loaded PLGA decreased inflammation and bone loss in periodontitis in diabetic rats. 10 mg/kg MET + PLGA had a slower rate of elimination compared to 100 mg/kg MET. The formulation modifies pharmacokinetic parameters such as apparent volume of distribution and mean residence time (AU).

Avaliação da combinação de poli (ácido láctico-co-glicólico) e poli-isopreno (Cellprene®): estudo histológico em ratos / Evaluation of the combination of poly (Lactic-Co-Glycolic Acid) and polyisoprene (Cellprene®) materials: histological study in rats

Resumo Introdução A quantidade e qualidade óssea na implantodontia é um fator de alta relevância quando se tem por objetivo instalar implantes e reabilitar pacientes. No entanto, essa disponibilidade é comprometida na maioria dos casos, havendo a necessidade da busca de novos biomateriais, membranas e substâncias para uma regeneração mais favorável. Objetivo: O objetivo deste estudo foi avaliar a resposta da neoformação óssea em defeitos críticos em calvárias de ratos utilizando scaffolds de fibras de blenda polimérica a partir de poli (ácido láctico-co-glicólico) e poli-isopreno (Cellprene®). O projeto foi aprovado pelo Comitê de Ética em Experimentação Animal. Material e método Neste estudo, foram utilizados 36 ratos (Rattus Norvegicus), variação albinus, Holtzman, adultos. Os animais foram submetidos à tricotomia na região da calota craniana e à confecção de defeitos ósseos circulares bilaterais com 5 mm de diâmetro. Os animais foram divididos em três grupos: GC - defeito sem colocação de biomaterial; GCol - scaffolds de colágeno (Bio-Gide, da empresa Geistlich Pharma Ag - Biomaterials); GPoli - scaffolds de fibras de blenda polimérica a partir de poli (ácido láctico-co-glicólico - Cellprene®). Cada grupo foi avaliado em quatro períodos experimentais (7, 15, 30 e 60 dias). Após esses períodos, os animais foram sacrificados, e as peças passaram por tramitação laboratorial de rotina e inclusão em parafina. Foram obtidos cortes semisseriados e corados pela técnica de hematoxilina e eosina para análise histométrica e histológica. Foi executada análise histométrica para avaliar a composição do tecido ósseo reparado (% osso). Os dados obtidos foram analisados estatisticamente com nível de significância de 95%. Resultado Foi verificado que o GCol apresentou maior preenchimento do defeito nos períodos de 30 e 60 dias em comparação aos GC e GPoli. Conclusão Os scaffolds de fibras de blenda polimérica a partir de poli (ácido láctico-co-glicólico) e poli-isopreno (Cellprene®) não apresentaram vantagens quando utilizados em defeitos críticos.

Abstract Introduction The bone quantity and quality in implant dentistry is a highly relevant factor when it aims the use of implants and rehabilitation in patients. However, this availability is compromised in most cases, with the need to research new biomaterials, membranes and substances for more favorable regeneration. Objective: The aim of this study was to evaluate the response of bone neoformation in critical defects in rat calvaries using polymeric blend fiber scaffolds from Poly (Lactic-Co-Glycolic Acid) and Polyisoprene (Cellprene®). The project was approved by the Animal Experimentation Ethics Committee. Material and method In this study 36 rats (Rattus Norvegicus), variation albinus, Holtzman, adults were used. The animals had trichotomy in the region of the skull and the confection of bilateral circular bone defects with a diameter of 5 mm. The animals were divided into 3 groups: Group GC - defect without biomaterial placement, Group GCol - collagen scaffolds (Bio-Gide, from Geistlich Pharma Ag - Biomaterials), Group GPoli - polymeric blend fiber scaffolds from Poly (Lactic-Co-Glycolic Acid)-Polyisoprene. Each group was evaluated in 4 experimental periods (7, 15, 30 and 60 days). After these periods the animals were sacrificed and the pieces underwent routine laboratory procedures and paraffin embedding. Semi-serial sections were obtained and stained by hematoxylin and eosin technique for histometric and histological analysis. Histometric analysis was performed to evaluate the composition of repaired bone tissue (% Bone). The data obtained were statistically analyzed with a significance level of 95%. Result It was found that the GCol group presented greater defect filling in the 30 and 60 days periods compared to the GC and GPoli groups. Conclusion Polymer blend fiber scaffolds from Poly (Lactic-Co-Glycolic Acid) and Polyisoprene (Cellprene®) did not have advantages when used in critical defects.

Efeito osteogênico do compósito produzido com cerâmica de beta tricálcio fosfato, polímeros [PCL e PLGA] e ß-ciclodextrina, associado à doxiciclina, no modelo de reparo ósseo alveolar em ratos / Osteogenic effect of the composite produced with beta tricalcium phosphate ceramics, polymers [PCL and PLGA] and ß-cyclodextrin, associated with doxycycline, in the alveolar bone repair model in rats

A avaliação da influência da Doxiciclina, e seu comportamento osteogênico, quando adicionada ao compósito produzido com cerâmica de beta tricálciofosfato associado a polímeros (PCL e PLGA) e ß-ciclodextrina, implantada em alvéolos de ratos, foi realizada imediatamente após a exodontia. O osso neoformado foi caracterizado de forma qualitativa (histologicamente) e quantitativa (histomorfometricamente), sendo os animas divididos em 04 grupos: Grupo 01 (Coágulo Sanguíneo ­ Controle), Grupo 02 ( ßTCP ­ Controle), Grupo 03 ( ßTCP/PCL/PLGA ­ Controle) e Grupo 04 ( ßTCP/PCL/PLGA/DOX/ ßCD ­ Teste). O defeito no osso alveolar, pós exodontia do primeiro molar superior esquerdo foi preparado. Uma única loja cirúrgica foi criada, e preenchida com o material correspondente a cada grupo. Após os tempos pré-determinados, T1 (14 dias) e T2 (28 dias) procedeu-se com as análises propostas. A análise histológica mostrou, para todos os grupos, a presença de osso neoformado em ambos os tempos, sendo que em T1, o Grupo 04 ­ Teste, obteve a maior área de osso neoformado, quando comparado aos outros grupos. O Grupo 04 -Teste, manteve o volume praticamente estável entre os tempos, podendo-se observar um ligeiro aumento, porém com trabéculas bem mais maduras e estruturadas em T2. Quando da observação do infiltrado inflamatório, notou-se que o mesmo era de predominância mononuclear, compatível com o processo de reparo, para todos os grupos, sendo que para o grupo ßTCP/PCL/PLGA/DOX/ ßCD, esse infiltrado se mostrou ligeiramente diminuído. A análise histomorfométrica confirmou os achados histológicos qualitativos, sendo que para o tempo de 14 dias o Grupo Teste apresentou a maior área aferida de osso neoformado (47%), quando comparado ao Grupo 01 (36%), Grupo 02 (33%) e Grupo 03 (31%) , não havendo diferença estatística entre os tempos, quando comparados no mesmo grupo e nem entre os grupos, quando comparados grupos diferentes (p > 0,05). A imunomarcação para osteoclastos (TRAP) mostrou, ainda, uma menor quantidade dessas células no Grupo 04 ­ Teste com 28 dias, quando comparado ao mesmo grupo com 14 dias, evidenciado o efeito antiosteoclastogênico de DOX. Concluiu-se, portanto, que a Doxiciclina utilizada no sistema de liberação controlada de fármacos foi capaz de aumentar a qualidade e a velocidade de neo-formação óssea para este modelo experimental, especialmente nas fases iniciais críticas do reparo ósseo (T1 ­ 14 dias), quando associada ao compósito biocerâmica/polímeros, sendo seu uso promissor para aplicações clínicas relacionadas à manutenção do rebordo ósseo alveolar.

The evaluation of the osteogenic potential, in an animal bony model after tooth extraction, it was made for a composite containing calcium phosphate bioceramics, biodegradable polymers, and an antimicrobial agent, doxycycline, of the tetracycline class. The newly formed bone was qualitatively characterized (histologically) and quantitative (histomorphometrically). The animals were divided into 04 groups: Group 01 (Blood Clot ­ Control), Group 02 (ßTCP ­ Control), Group 03 (ßTCP/PCL/PLGA ­ Control) and Group 04 (ßTCP/PCL/PLGA/DOX/ßCD ­ Test). After left upper molar extraction, and alveolar bone defect was prepared. A single surgical store was created, and filled with the material corresponding to each group. After predetermined times, T1 (14 days) and T2 (28 days) proceeded with the proposed analysis. Histological analysis showed, for all groups, the presence of neoformed bone at both times, and at T1, Group 04 ­ Test, obtained the largest área of the neoformed bone when compared to the other groups. Group 04 ­ Test, kept the volume practically stable between times, and a slight increase can be observed, but with much more mature and structured trabeculated bone in T2. When observing the inflammatory infiltrate, it was noted that it was predominantly mononuclear, compatible with the repair process, for all groups, and the ßTCP/PCL/PLGA/DOX/ßCD group, this infiltrate was slightly decreased. The histomorphometric analysis confirmed the qualitative histological findings. For the 14 days time, the Test Group presented the largest measured área of newly formed bone (47%), when compared to Group 01 (36%), Group 2 (33%) and Group 03 (31%), with no statistical difference between the times compared into the same groups or between groups, when compared different groups (p<0,05). The osteoclast immunostaining (TRAP) also showed a smaller amount of these cells in Group 04 ­ Test with 28 days, when compared with the same group with 14 days, evidencing the antiosteoclastogenic effect of DOX. It was concluded, therefore, that Doxycycline used in the controlled drug delivery system was able to increase the quality and speed of bone neo-formation for this experimental model, especially in the critical early stages of bone repair (T1 ­ 14 days). This composite has promising use for clinical applications related to the maintenance of the alveolar bone ridge.

Efeito de diferentes doses de laser de baixa intensidade em células-tronco dentais cultivadas sobre arcabouços de ácido polilático / Effect of different doses of low intensity laser on dental stem cells cultured on polylactic acid scaffolds

As células-tronco mesenquimais dentais (dMSC) têm sido amplamente utilizadas na engenharia tecidual por sua capacidade de auto-renovação e potencial multilinhagem. Dentre as dMSCs, as células-tronco da polpa do dente decíduo esfoliado (SHEDs) destacam-se pela facilidade de coleta, capacidade proliferativa e tempo sobrevivência. O objetivo do estudo foi avaliar, através de experimentos in vitro, o efeito de diferentes doses do laser de baixa intensidade (LBI) na atividade biológica de SHEDs cultivadas sobre arcabouços de ácido polilático (PLA). Células previamente isoladas e caracterizadas foram cultivadas sobre filmes de PLA e foram irradiadas ou não (controle) com um laser diodo InGaAlP (660 nm, 30 mW, modo de ação contínuo) em um screening de doses (1, 4, 7.5, 15, 22.5 e 30 J/cm²). A proliferação e viabilidade celular foram analisadas nos intervalos de 24, 48 e 72 h, através dos ensaios do Alamar Blue e Live/Dead. A morfologia celular foi avaliada por MEV no intervalo de 72h. A avaliação do estresse oxidativo foi realizada através das dosagens de malondialdeído (MDA) e glutationa (GSH). Densidades de energia de 1 J/cm² e 4 J/cm² promoveram um efeito estimulador da proliferação celular nos três intervalos de tempo quando comparados ao grupo controle e aos demais grupos irradiados. Por outro lado, doses elevadas de irradiação (22.5 e 30 J/cm²) promoveram redução significativa das células. Verificou-se que a viabilidade celular foi afetada ao longo do experimento nos grupos L22.5 e L30, que apresentaram maior quantidade de células mortas no intervalo de 72h. Na análise por MEV evidenciou-se uma maior densidade celular nos grupos L1 e L4, contrapondo-se às SHEDs arranjadas mais dispersamente nos grupos L22.5 e L30. Em relação ao estresse oxidativo, nos grupos L1 e L4 houve elevação dos níveis de GSH e redução do MDA, de modo contrário, nos grupos L22.5 e L30 houve redução dos níveis de GSH e elevação do MDA. Conclui-se que doses baixas de LBI (1 e 4 J/cm²) promovem proliferação e tem efeito citoprotetor em SHEDs cultivadas sobre arcabouços de PLA, enquanto doses elevadas (22.5 e 30J/cm²) tem ação citotóxica e reduzindo a viabilidade e proliferação destas células (AU).

Dental mesenchymal stem cells (dMSCs) have been widely used in tissue engineering for their capacity for self-renewal and multi-lineage potential. Among the dMSCs, the stem cells from human exfoliated deciduous teeth (SHEDs) are highlighted for their ease of collection, proliferative capacity and survival time. The aim of the study was to evaluate, through in vitro experiments, the effect of different doses of low intensity laser (LLLI) on the biological activity of SHEDs cultured on polylactic acid (PLA) scaffolds. Pre-isolated and characterized cells were cultured on PLA films and irradiated or not (control) with an InGaAlP diode laser (660 nm, 30 mW, continuous action mode) in a dose screening (1, 4, 7.5, 15, 22.5 and 30 J/cm²). Cell proliferation and viability were analyzed at 24, 48 and 72 hr using the Alamar Blue and Live/Dead assays. Cell morphology was evaluated by SEM at 72 h. The evaluation of oxidative stress was performed through the dosages of malondialdehyde (MDA) and glutathione (GSH). Energy densities of 1 J/cm² and 4 J/cm² promoted cell proliferation in all intervals when compared to the control group and the other irradiated groups. Contrarily, high doses of irradiation (22.5 and 30 J/cm²) promoted significant negative effect on cell proliferation. It was verified that cell viability was affected throughout the experiment in groups L22.5 and L30, which presented a higher number of dead cells in the interval of 72h. The SEM analysis showed a greater cell density in L1 and L4 groups, opposing the SHEDs arranged more sparsely in L22.5 and L30 groups. Regarding to oxidative stress, in L1 and L4 groups there was elevation of GSH levels and reduction of MDA, showing a cytoprotective effect of these doses. Conversely, in groups L22.5 and L30 there was a reduction of GSH levels and elevation of MDA, corroborating with the results of the aforementioned assays. It is concluded that low doses of LLLI (1 and 4 J/cm²) promote proliferation of SHEDs on PLA scaffolds, while high doses (22.5 and 30 J/cm²) promote cytotoxic and anti-proliferative action in these cells (AU).

Implantes intra-ósseos de material à base de ácido poliláctico em mandíbula de coelhos. Estudo histológico / The use of polylactic acid implants in surgical defects of rabbits mandibles. Histological analysis

Materiais biodegradáveis usados em cirurgia óssea têm sido pesquisados há mais de três décadas. Os implantes biodegradáveis mais comumente testados são os ácidos polilácticos e sua biocompatibilidade é considerada de excelência. Outros estudos demonstraram apenasbiodegradação parcial que resultou em respostas teciduais de processos inflamatórios em longo prazo. Objetivo: o presente estudo tem a finalidade de avaliar histologicamente o comportamento de um material a base de ácido poliláctico após sua implantação em cavidades ósseas em mandíbulade coelhos. Material e método: a amostra foi constituída de 16 coelhos adultos que foram divididos em dois grupos. Grupo I: cavidades ósseas cirúrgicas preenchidas com material à base de ácidopoliláctico que foi utilizado como grupo teste; e Grupo II; cavidades ósseas cirúrgicas preenchidas com coágulo sangüíneo, perfazendo o grupo controle. Após 15, 30, 60 e 90 dias, os animais foramsacrificados e as mandíbulas processadas segundo rotina laboratorial histológica para coloração em H.E. Resultado: aos 15 dias, o material encontra-se com reação inflamatória intensa e iníciode formação de cápsula fibrosa. Aos 30 dias o material permanece na cavidade e observa-se início de formação óssea advinda da parede da cavidade. Aos 60 dias, ausência de infiltrado inflamatórioe presença de osso neoformado ao redor do implante. Aos 90 dias, o osso neoformado apresenta aspecto organizado e mais maduro. Conclusão: o material à base de ácido poliláctico implantadomostrou-se biocompatível, sendo bem aceito pelo tecido ósseo adjacente ao implante. Porém não sofreu processo de degradação ou reabsorção nos períodos avaliados.

The biodegradable materials used in bone surgery have been researched for more than three decades. The most commonly tested bioresorbable implants are the polylactic acids which present excellent biocompatibility. On the other hand, some studies showed only partial degradation and variable long-term tissue reactions. Objective: This study evaluated the histological behavior of a polylactic acid-based material after implantation into extensive and deep surgical cavities in rabbit mandibles. Material and method: Sixteen adult rabbits were used in this study. Ineach animal a surgical cavity was prepared in the mandible. The sixteen rabbits were divided into two groups: Group I- surgical cavities filled with polylactic acid material and, Group II- surgical cavities filled with blood clot as controls. After fifteen, thirty, sixty and ninety days the animalswere sacrificed and the mandibles were dissected for histological processing and analysis. Results: After 15 days, the implant showed inflammatory reaction and capsule formation. After 30 days,the material remained in the surgical cavity without degradation and beginning of bone formation was observed. At sixty days, the inflammatory process was absent and the material was surroundedby bone. At 90 days, lamellar bone was formed. Conclusion: The polydactyl acid implants were biocompatible and well accepted by the adjacent bone. However, with ninety days the materialstill remained in the surgical cavity without degradation.