Avaliação da eficácia das formulações lipossomal e desoxicolato de anfotericina B sobre espécies de Candida: estudo in vitro e in vivo em Galleria mellonella / Evaluation of the efficacy of liposomal and deoxycholate amphotericin B formulations on Candida species: in vitro and in vivo study in Galleria mellonella

Anfotericina B pertence a primeira classe (polienos) de medicamentos antifúngicos introduzidos no mercado. O amplo espectro de ação e a baixa taxa de resistência microbiana, definiram a anfotericina B como tratamento de escolha para as infecções graves por Candida spp. Porém, os efeitos colaterais causados pela sua toxicidade impulsionaram o desenvolvimento de novas formulações a base de lipídios. Assim, o objetivo desse estudo foi comparar os efeitos antifúngicos da formulação lipossomal da anfotericina B (AmB-L) com a formulação convencional de anfotericina B desoxicolato (AmB-D). Para isso a atividade antifúngica foi testada sobre diferentes espécies de Candida, incluindo Candida albicans (cepa clínica 70), Candida glabrata (cepa clínica 64), Candida tropicalis (cepa clínica 11) e Candida parapsilosis (cepa ATCC 90018), utilizando-se métodos de estudo in vitro e in vivo. Em estudo in vitro, foi determinada a concentração inibitória mínima (CIM) em células planctônicas por meio do método de microdiluição em caldo. A seguir, concentrações de 10x, 20x e 50x a CIM foram testadas sobre os biofilmes de Candida, verificando-se seus efeitos pela contagem de unidades formadoras de colônias (UFC). Para o estudo in vivo, foi utilizado o modelo invertebrado Galleria mellonella. Os animais foram infectados por Candida e tratados com as formulações de anfotericina B, então foram monitorados diariamente para determinação da curva de sobrevivência e índice de saúde. Os resultados dos testes in vitro demonstraram atividade antifúngica semelhante entre AmB-L e AmB-D em crescimento planctônico. Ambas as formulações apresentaram valores de CIM de 0,5 µg/mL para C. albicans e C. parapsilosis, e de 1 µg/mL para C. glabrata e C. tropicalis. Nos biofilmes, AmB-D apresentou maior atividade inibitória em relação à AmB-L, para todas as cepas de Candida estudadas. Nos testes in vivo, o tratamento com AmB-L ou AmB-D aumentou a sobrevida e índice de saúde das larvas infectadas por Candida, sendo observada maior eficácia da formulação AmB-D em relação à AmB-L. Portanto, concluiu-se que AmB-L e AmB-D apresentam a mesma efetividade sobre células planctônicas, mas AmB-D mostrou maior ação antifúngica sobre biofilmes e infecção experimental no modelo G. mellonella (AU)

Amphotericin B belongs to the first class (polyenes) of antifungal drugs introduced commercially. The broad spectrum of action and the low rate of microbial resistance have defined amphotericin B as the treatment of choice for serious infections by Candida spp. However, the side effects caused by toxicity stimulated the development of new formulations based on lipids. Thus, the aim of this study was to compare the antifungal effects of the liposomal amphotericin B formulation (AmB-L) with the conventional formulation deoxycholate amphotericin B (AmB-D). For this, the antifungal activity was tested on different Candida species, including Candida albicans (clinical strain 70), Candida glabrata (clinical strain 64), Candida tropicalis (clinical strain 11) and Candida parapsilosis (ATCC strain 90018), using in vitro and in vivo study methods. In in vitro tests, the minimum inhibitory concentration (MIC) was determined using the broth microdilution method. Next, concentrations of 10x, 20x and 50x the MIC were tested on Candida biofilms, verifying their effects by counting colonyforming units (CFU). For the in vivo study, the Galleria mellonella invertebrate model was used. The animals were infected with Candida and treated with amphotericin B formulations, then monitored daily to determine the survival curves and health index score. The results of in vitro tests demonstrated similar antifungal activity between AmB-L and AmB-D in planktonic cells. Both formulations showed MIC values of 0.5 µg/mL for C. albicans and C. parapsilosis, and 1 µg/mL for C. glabrata and C. tropicalis. In biofilms, AmB-D showed greater inhibitory activity in relation to AmB-L for all Candida strains studied. In in vivo tests, the treatment with AmB-L or AmB-D increased the survival and health index of larvae infected by Candida, with greater efficacy for the AmB-D formulation in relation to AmB-L. Therefore, it was concluded that AmB-L and AmB-D have the same effectiveness on planktonic cells, but AmB-D showed greater antifungal action on biofilms and experimental infection in the G. mellonella model (AU)

Caracterização genotípica de amostras clínicas de Cryptococcus Spp. e avaliação do perfil de virulência in vitro e em modelo de Galleria Mellonella / Genotypic characterization of clinical samples of Cryptococcus spp. and evaluation of the virulence profile in vitro and in a Galleria mellonella model

A criptococose é uma infecção oportunista comum em pacientes HIV positivos, mas também pode afetar pacientes com outras comorbidades imunológicas ou imunocompetentes. Neste trabalho, cepas clínicas de Cryptococcus spp. provenientes de hospitais de São José dos Campos (SP) foram identificadas pela amplificação do gene SRT. A seguir, foi avaliada a sensibilidades das cepas a fluconazol e anfotericina B (AMB) pela técnica de microdiluição conforme EUCAST. Também foi analisada a capacidade de formação de biofilme por cristal violeta (formação da biomassa) e XTT (viabilidade celular). Foram analisadas in vivo a formação da cápsula durante a infecção, a curva de sobrevivência e do índice de saúde em modelo invertebrado de Galleria mellonella. Seis cepas foram identificadas como C. neoformans var. grubbii e uma como C. gattii. Todas as cepas clínicas foram sensíveis a AMB e a concentração inibitória mínima para fluconazol variou entre 2 e 32 µg/mL. Todos os isolados de Cryptococcus spp. foram capazes de produzir biofilme. A sobrevida de G. mellonella infectada variou entre 6 e 7 dias para C. neoformans, e a cepa clínica 6 se mostrou menos virulenta, com 24% das larvas vivas no último dia de experimento. Para cepa de C. gattii, 20,8% das larvas infectadas permaneceram vivas ao final da análise. Em relação a análise do tamanho da cápsula após inoculação in vivo, as cepas clínicas de ambas espécies apresentaram aumento no tamanho, sendo observado o maior percentual de cápsulas ≥ 30µm na cepa 6. O índice de saúde foi capaz de agregar informações ao resultado da curva de sobrevivência de G. mellonella, uma vez que ele mostrou diferenças de saúde das larvas entre os grupos que apresentaram mesmo perfil de sobrevida. A associação do índice de saúde à curva de sobrevivência amplia a visão da vitalidade das larvas durante os dias de experimento e, ainda, auxilia na comparação de resultados entre laboratórios. O conhecimento das características genotípicas e fenotípicas de Cryptococcus spp. em uma determinada região pode ser ferramenta importante para implementação de políticas públicas de saúde eficazes. (AU)

Cryptococcosis is a common opportunistic infection in HIV-positive patients, but it can also affect patients with other immunological comorbidities or immunocompetent. In this work, clinical strains of Cryptococcus spp. from hospitals in São José dos Campos (SP) were identified by amplification of the SRT gene. Next, the sensitivities of the strains to fluconazole and amphotericin B (AMB) were evaluated by the microdilution technique according to EUCAST. Biofilm formation capacity by crystal violet (biomass formation) and XTT (cellular viability) was also analyzed. Capsule formation during infection, survival curve and health index in an invertebrate model of Galleria mellonella were analyzed in vivo. Six strains were identified as C. neoformans var. grubbii and one as C. gattii. All clinical strains were sensitive to AMB and the minimum inhibitory concentration for fluconazole ranged between 2 and 32 µg/mL. All Cryptococcus spp. were able to produce biofilm. The survival of infected G. mellonella ranged between 6 and 7 days for C. neoformans, and the clinical strain 6 was less virulent, with 24% of larvae alive on the last day of the experiment. For the C. gattii strain, 20.8% of the infected larvae remained alive at the end of the analysis. Regarding the analysis of capsule size after in vivo inoculation, the clinical strains of both species showed an increase in size, with the highest percentage of capsules ≥ 30µm being observed in strain 6. The health index was able to add information to the result of the survival curve of G. mellonella, since it showed differences in the health of larvae between the groups that presented the same survival profile. The association of the health index to the survival curve broadens the vision of the larvae's vitality during the days of the experiment and also helps in comparing the results between laboratories. The knowledge of the genotypic and phenotypic characteristics of Cryptococcus spp. in a given region, it can be an important tool for the implementation of effective public health policies (AU)

Efeito do cloridrato de verapamil, cloridrato de fluoxetina e paroxetina isolados e combinados com anfoteicina B contra Cryptococcus neoformans: estudo in vitro e in vivo / Effect of verapamil hydrochloride, fluoxetine hydrochloride and paroxetine alone and combined with amphotericin B against Cryptococcus neoformans: in vitro and in vivo study

Cryptococcus neoformans são leveduras que acometem principalmente indivíduos imunocomprometidos, podendo causar a meningoencefalite dependendo do estado imunológico do hospedeiro. Os tratamentos convencionais têm enfrentado grandes desafios. Dessa forma, o objetivo desse estudo foi avaliar os efeitos antifúngicos dos fármacos cloridrato de verapamil (CV), cloridrato de fluoxetina (CF) e cloridrato de paroxetina (CP) isolados e combinados com anfotericina B (AmB) contra C. neoformans. Foram determinados os valores de Concentração Inibitória Mínima (CIM) e Concentração Fungicida Mínima (CFM) de acordo com a técnica de microdiluição em caldo proposta pelo Comitê Europeu de Teste de Susceptibilidade Antimicrobiana (EUCAST). Posteriormente, foi avaliada a atividade sinérgica dos fármacos combinados com AmB (EUCAST). Os efeitos das CIMs e das concentrações sinérgicas selecionadas foram avaliados em biofilmes, quantificando a biomassa por cristal violeta e sua viabilidade por contagem de colônias (UFC/mL). Além disso, foram analisados os efeitos dos mesmos na cápsula induzida desta levedura. Os ensaios in vivo foram realizados em Galleria mellonella avaliando a toxicidade dos compostos e a eficácia por análise de curva de sobrevivência e também o efeito em concentração de hemócitos. Os fármacos CV, CF e CP apresentaram valores de CIM de 113, 9,6 e 41µg/mL, respectivamente, e quando combinados com AmB resultaram em vinte concentrações sinérgicas, e uma concentração de cada combinação foi eleita para os ensaios seguintes. CV reduziu a biomassa do biofilme em até 38%, já CF e CP reduziram a biomassa de 22-30% quando isolados, e as combinações reduziram até 35 % da biomassa. O CP diminuiu a viabilidade do biofilme em até 25 % e quando o CF e CP foram combinados com AmB a redução chegou a 11 %. Além disso, todos os fármacos isolados e combinados reduziram o tamanho da cápsula da levedura, de 48-72 %. Em G. mellonella os fármacos não apresentaram toxicidade, eficácia ou ação na concentração de hemócitos. Assim, os fármacos avaliados apresentaram potencial antifúngico frente C. neoformans em todos os ensaios in vitro, podendo ser considerados novas alternativas para o tratamento destes patógenos(AU)

Cryptococcus neoformans are yeasts that mainly affect immunocompromised individuals, and may cause meningoencephalitis depending on the immunological state of the host. Conventional treatments have faced major challenges. Verapamil hydrochloride (CV), fluoxetine hydrochloride (CF) and paroxetine hydrochloride (CP) were isolated and combined with amphotericin B (AmB) against C. neoformans. Minimum Inhibitory Concentration (MIC) and minimum Fungicidal Concentration (CFM) values were determined according to the broth microdilution technique proposed by the European Committee for Antimicrobial Susceptibility Testing (EUCAST). Subsequently, the synergistic activity of drugs combined with AmB (EUCAST) was evaluated. The effects of MICs and selected synergistic concentrations were evaluated in biofilms, quantifying the biomass by violet crystal and its viability by colony-forming unit analysis (CFU / mL). In addition, the effects of the same in the induced capsule of this yeast were evaluated. In vivo assays were performed in Galleria mellonella evaluating the toxicity of the compounds and the efficacy by analysis of survival curve and also the effect on hemocyte concentration. The CV, CF and CP drugs had MIC values of 113, 9.6 and 41 µg / mL, respectively, and when combined with AmB resulted in twenty synergistic concentrations, and a concentration of each combination was chosen for the following trials. CV reduced biofilm biomass to 38%, while CF and CP reduced biomass to 22-30% when isolated, and combinations reduced to 35% of biomass. CP decreased biofilm viability to 25% and when CF and CP were combined with AmB the reduction reached to 11%. In addition, all drugs isolated and combined reduced the size of the yeast capsule to 48-72%. In G. mellonella the drugs did not present toxicity, efficacy or action in the concentration of hemocytes. We suggest that the liposolubility of the compounds has been a limiting factor in vivo analyzes. Thus, the evaluated drugs presented antifungal potential against C. neoformans in all in vitro assays, and could be considered new alternatives for the treatment of these pathogens(AU)

Impact of brief exposure to antifungal agents on the post-antifungal effect and hemolysin activity of oral Candida albicans

AbstractPost-antifungal effect (PAFE) of Candida and its production of hemolysin are determinants of candidal pathogenicity. Candida albicans is the foremost aetiological agent of oral candidosis, which can be treated with polyene, azole, and echinocandin antifungals. However, once administered, the intraoral concentrations of these drugs tend to be subtherapeutic and transient due to the diluent effect of saliva and cleansing effect of the oral musculature. Hence, intra-orally, Candidamay undergo a brief exposure to antifungal drugs.Objective Therefore, the PAFE and hemolysin production of oral C. albicans isolates following brief exposure to sublethal concentrations of the foregoing antifungals were evaluated.Material and Methods A total of 50 C. albicans oral isolates obtained from smokers, diabetics, asthmatics using steroid inhalers, partial denture wearers and healthy individuals were exposed to sublethal concentrations of nystatin, amphotericin B, caspofungin, ketoconazole and fluconazole for 60 min. Thereafter, the drugs were removed and the PAFE and hemolysin production were determined by previously described turbidometric and plate assays, respectively.Results Nystatin, amphotericin B, caspofungin and ketoconazole induced mean PAFE (hours) of 2.2, 2.18, 2.2 and 0.62, respectively. Fluconazole failed to produce a PAFE. Hemolysin production of these isolates was suppressed with a percentage reduction of 12.27, 13.47, 13.33, 8.53 and 4.93 following exposure to nystatin, amphotericin B, caspofungin, ketoconazole and fluconazole, respectively.Conclusions Brief exposure to sublethal concentrations of antifungal drugs appears to exert an antifungal effect by interfering with the growth as well as hemolysin production of C. albicans.

Cinética da colonização bucal por Candida spp. durante a corticoterapia tópica / Universidade Federal de Minas Gerais. Faculdade de Odontologia

A candidíase bucal é uma importante alteração secundária à corticoterapia tópica bucal. O presente estudo tem o objetivo de avaliar a colonização bucal por cinco espécies de candida durante a corticoterapia tópica e investigar a patogenicidade e a suscetibilidade in vitro ao fluconazol e à anfotericina B. Amostras de raspado bucal de 11 pacientes com líquen plano bucal (LPB) sintomático foram coletadas antes (dia 0), 7 e 30 dias após o início da corticoterapia. Métodos convencionais de identificação e quantificação de candida spp...

Susceptibility of Candida spp. Oral isolates for azolic antifungals and amphotericin B

Aims: Among the oral infections, candidosis may be considered the most frequent, and C. albicans the most prevalent species. Meanwhile, the non-albicans species may also be related to other infections processes and be able to affect the oral cavity, including periodontal disease. In this sense, understanding the relationship between Candida spp. and host, it is necessary and justified the search of mechanisms modulators of infections and treatments against diseases associated with these yeasts. Methods: Nineteen patients with periodontal disease were involved in this study. The aim was evaluate the susceptibility to azoles antifungals fluconozole, itraconazole, ketoconazole and the polienic anfotericin B against Candida spp isolated from three different sites of the oral cavity from these patients (periodontal disease, being periodontal pocket, oral mucosa and ridge gingival), by the minimum inhibitory concentration method – MIC. Results: Among the samples of C. albicans, 88% showed susceptibility depending on the concentration (SCD) and 3.6 % were resistant to at least one antifungal azole studied. Among the others species, 57% presented SDC and 42.8% showed resistance to at least one of the antifungal azole tested. Regarding to Anfotericin B, 90% of the C. albicans isolates and 3% of the nonalbicans showed resistance. There was no occurrence of resistance to the fluconazole and only 3.6% of C. albicans and 40% of the non-albicans were SDC to this antifungal. Conclusions: Patients with periondontal disease showed relevant levels of colonization by Candida spp, mainly at the oral mucosa and periodontal pocket showing important occurrence of SDC and resistance to the antifungals drugs tested.

Uso de anfotericina B como antifúngico no meio de cultura para células pulpares humanas / Use of amphotericin B as antifungal agent in a culture medium for human dental pulp cells

Objetivo: O presente trabalho tem como objetivo avaliar o comportamento de células da polpa, de terceiros molares humanos, cultivadas na presença ou ausência de um antifúngico (anfotericina B). Metodologia: As células pulpares foram obtidas de seis terceiros molares inclusos, após extração por motivos ortodônticos. A polpa foi cortada em fragmentos e estes foram incubados a 37ºC, por 60 minutos, em solução tampão contendo 0,2% de colagenase. A suspensão de células foi dividida em 2 tubos e centrifugada, sendo um pellet ressuspenso em meio - DMEM suplementado com 10% de soro fetal bovino, 100 unidades/mL de penicilina, 100μg/mL de estreptomicina, 0,45μg/mL de gentamicina e 3,7mg/L HEPES, e o outro ressuspenso no mesmo meio, porém contendo 2,5μg/mL de anfotericina B. As células foram semeadas em placas de cultura plásticas e incubadas em atmosfera 5% de CO2/95% de ar a 37ºC. Resultados: Dos seis dentes testados, dois não apresentaram crescimento celular em qualquer dos meios testados. Nos demais quatro dentes, houve crescimento celular em ambos meios, sendo este mais proeminente no meio sem anfotericina B. Conclusão: Apesar da anfotericina B ser importante para a prevenção de contaminações por fungos, concluiu-se que esta dificulta o estabelecimento de células pulpares humanas em cultura.

Purpose: The aim of the present work is to evaluate the behavior (survival and proliferation) of human third molar pulp cells cultivated in the presence or absence of amphotericin B.Methods: The cells were obtained from six impacted third molars extracted for orthodontic reasons. The pulp was minced into pieces, which were incubated at 37ºC for 60 minutes in buffer containing 0.2% collagenase. The cell suspension was divided into two tubes, centrifuged, and resuspensed in DMEM medium, supplemented with 10% fetal bovine serum, 100 units/mL penicillin, 100μg/mL streptomycin, 0.45μg/mL gentamincin, and 3.7mg/L HEPES with or without 2.5μg/mL of amphotericin B. The cells were plated in plastic culture dishes and incubated with 5% CO2/95% air at 37ºC. Results: Two out of the six tooth samples did not growth at any of the tested media. The other four samples growth in both media. The growth was more effective in the medium without amphotericin B. Conclusions: Although amphotericin B may prevent fungal contamination, it was concluded that amphotericin B may difficult the culture of human pulp cells.

Atividade antifúngica de produtos químicos empregados no tratamento das candidíases bucais / Antifungal activity of the drugs used in treatment of candidiasis

A candidíase, em suas variadas apresentações clínicas, representa frequente e potencialmente perigoso processo patológico, especialmente em pacientes imunossuprimidos ou sob prolongado tratamento com antimicrobianos e/ou corticosteróides. Desta forma, para uma terapia adequada necessita-se agentes antifúngicos de comprovada eficiência. Assim foi objetivo deste trabalho avaliar a atividade antifúngica de vários compostos empregados na terapia de infecções micóticas (violeta de genciana, bicarbonato de sódio, iodo, cetoconazol, griseofulvina, nistatina, anfotericina B), frente a 50 isolados de C. Albicans obtidos de pacientes portadores de candidíase oral e frente a 50 isolados oriundos de indivíduos sádios. Utilizou-se o método da macrodiluição em caldo. O inóculo final foi de 10(5) leveduras por tubo, em duplicata. Pôde-se concluir que, a anfotericina B, o cetoconazol e a nistatina foram os agentes mais afetivos, embora sua aplicação na clínica odontológica se mostre problemática