Ação da clorofila como fotossensibilizador e do LED como fonte de luz alternativa na terapia fotodinâmica antimicrobiana contra o Enterococcusfaecalis / Effect of chlorophyll as photosensitizer and LED as an alternative light source on Antimicrobial Photodynamic Therapy against Enterococcus faecalis

O objetivo deste estudo foi investigar o efeito da Terapia Fotodinâmica antimicrobiana (TFDa) sobre o Enterococcus faecalis (E. faecalis), in vitro, utilizando a clorofila (CL) como agente fotossensibilizador (FS) e o diodo emissor de luz (LED) como fonte de luz. A cultura pura de E. faecalis foi ativada em caldo de BHI a 37oC por 24h. O cultivo do microrganismo foi centrifugado a 3000rpm por 15min, e o pellet re-suspenso em 0,85% de solução salina. As concentrações da bactéria foram ajustadas para 107UFC mL-1 (unidades formadoras de colônias por mililitro). Diferentes tipos de solventes para a CL foram testados: éter, álcool de cereais, Tween 80 e P-123. 100l do inóculo e o mesmo volume da solução teste foram inseridos em cada poço da placa de microtitulação. A mistura foi agitada e aguardou-se 1min. 25l da suspensão foi removida e diluições seriadas foram realizadas. Alíquotas de cada diluição foram espalhadas na superfície da placa, armazenadas em microaerofilia e incubadas na estufa por 24h a 37oC. O número de UFC foi contado em cada placa. Para o experimento da TFDa, os grupos foram divididos em: controle (G1); TBO 1min (G2); CL+Tween 1min (G3); CL+Tween 5min (G4); CL+P-123 1min (G5); CL+P-123 5min (G6); CL+Tween 1min + LED 1min (G7); CL+Tween 1min + LED 5min (G8); CL+Tween 5min + LED 1min (G9); CL+Tween 5min + LED 5min (G10); CL+P-123 1min + LED 1min (G11); CL+P-123 1min + LED 5min (G12); CL+P-123 5min + LED 1min (G13); CL+P-123 5min + LED 5min (G14); TBO 1min + LED 1min (G15); TBO 1min + LED 5min (G16); LED 1min (G17); LED 5min (G18).Um volume de 100l da suspensão bacteriana foi inserido em poços da placa e o mesmo volume da solução do FS foi adicionado. A CL foi solubilizada em soluções aquosas de Tween ou P-123. Cada poço foi agitado e o tempo de préirradiação foi de 1 ou 5min. O LED foi acionado durante 1 ou 5min. 25l da suspensão foi submetida a diluições seriadas e as alíquotas de cada diluição foram espalhadas na superfície da placa em Ágar BHI...

The aim of this study was to investigate the effect of Antimicrobial Photodynamic Therapy (aPDT) against Enterococcus faecalis (E. faecalis), in vitro, using chlorophyll (CL) as photosensitizer (FS) agent and light-emitting diode (LED) as light source. Pure culture of E. faecalis was cultivated in BHI broth at 37oC for 24h. The culture was centrifuged at 3000rpm for 15min, and the pellets were resuspended in 0.85% saline solution. The bacterial concentrations were adjusted to 107CFU mL-1 (colony forming units per milliliter). Different types of solvents for CL were tested: ether, grain alcohol, Tween 80 and P-123. 100l of inoculum and the same volume of the test solution were inserted into each well of the microtitre plate. The mixture was mixed and 1 min was awaited. 25l of the suspension was removed and serial dilutions were performed. Aliquots of each dilution were spread on the surface of the plates, stored in microaerophilic conditions and incubated for 24h at 37oC. The number CFU was counted in each plate. For aPDT experiment, the groups were divided into: control (G1); TBO 1min (G2); CL+Tween 1min (G3); CL+Tween 5min (G4); CL+P-123 1min (G5); CL+P-123 5min (G6); CL+Tween 1min + LED 1min (G7); CL+Tween 1min + LED 5min (G8); CL+Tween 5min + LED 1min (G9); CL+Tween 5min + LED 5min (G10); CL+P-123 1min + LED 1min (G11); CL+P-123 1min + LED 5min (G12); CL+P-123 5min + LED 1min (G13); CL+P-123 5min + LED 5min (G14); TBO 1min + LED 1min (G15); TBO 1min + LED 5min (G16); LED 1min (G17); LED 5min (G18). A volume of 100l of bacterial suspension was inserted into the well of microtitre plate and the same volume of FS was added. CL was solubilized in aqueous solution of Tween and P-123. Each well was mixed and preirradiation time was 1 or 5min. LED was irradiated during 1 or 5 min. 25l of suspension was subjected to serial dilutions and aliquots of each dilution were spread on the surface of agar BHI plates. The plates were stored and incubated at 37oC for 24h...

Ação da terapia fotodinâmica (TFD) sobre o biofilme dentário humano / The action of photodynamic therapy on human dental plaque

Entre os métodos de prevenção da cárie dentária, os controles mecânico e químico do biofilme dentário são de grande relevância neste processo. O controle mecânico é eficaz desde que executado diariamente e sistematicamente envolver todas as superfícies dentárias expostas ao meio bucal. Ele pode ser realizado pelo odontólogo por meio da profilaxia profissional e pelo próprio paciente pela escovação dentária. O controle químico do biofilme dentário deve ser empregado de forma suplementar, quando o controle mecânico não puder ser realizado diariamente ou se for realizado de forma inadequada acarretando o risco do acúmulo do biofilme dentário e como consequência, a ocorrência de lesões de cárie dentária e/ou da doença periodontal. O ideal seria associar ambos os métodos, para que um compense a deficiência do outro. É nesta direção que inúmeros estudos são feitos nos últimos anos. Para o controle químico, são relatadas na literatura inúmeras substâncias antimicrobianas. Dentre os agentes químicos recomendados, a clorexidina (CLX) tem se mostrado eficiente para esta finalidade, porém, sua aplicação apresenta limitações como: manchamento de áreas desmineralizadas dos dentes e perda do paladar, condições estas que limitam seu uso por tempo prolongado. Sendo assim, a busca de alternativas para o controle microbiano do biofilme dentário é de grande relevância para se somar aos esforços ora empreendidos neste sentido. Nas últimas décadas o emprego da luz associada a corantes surgiu como um tratamento alternativo ao uso de agentes antimicrobianos tradicionais. Este tratamento é chamado terapia fotodinâmica (TFD), sendo recentemente também chamado de Terapia Fotodinâmica Antimicrobiana (TFDA). Na TFDA, a luz interage com o corante que está associado ao microorganismo, sendo capaz de inibir sua proliferação ou eliminá-lo completamente. Poucos são os estudos que avaliam a ação antimicrobiana da TFD sobre biofilmes cariogênicos. A comprovação da eficácia dessa terapia...

The mechanical and chemical controls of dental plaque are important methods of caries prevention. The mechanical control is efficient if its run properly and daily. It can be made by a dentist (professional cleaning) or by patients themselves (toothbrushing). The chemical control should be used additionally, when the mechanical control cant be performed properly, them the biofilm can accumulate and in consequence, there are risks of dental caries or periodontal disease. For chemical control, many antimicrobial substances are related in literature. Several studies have shown that chlorexidine (CLX) is an effective antimicrobial substance against dental plaque. However, it presents some limitations like: tooth staining, loss of taste, conditions that limit its use by prolonged periods. Therefore, the search by new alternatives in microbial control of plaque is very important for improvement the treatment. In last decades, the use of light for activation of a photosensitizer appears like an alternative treatment with antimicrobial function. This treatment is called Photodynamic Therapy (PDT), recently Photochemotherapy (PACT). In PACT, the light activates a photosensitizer that is bond in microorganism and it can kill it or inhibit its growing. If this treatment is effective on human dental plaque, it will have positive impact for Dentistry and new protocols of chemical control will be developed. The present study aim was analyze the chlorexidine effect and the PDT effect (using Toluidine blue (TBO) and Liquid Chlorophyll (LC) like photosensitizer) in human natural dental plaque formed in situ. Volunteers wore a palatal appliance containing bovine enamel blocks, where the biofilm was formed. After 48 hours, different therapies were performed on plaque: (1) distilled water: negative control; (2) CLX; (3) Laser irradiation; (4) TBO; (5) TBO + Laser; (6) CL; (7) CL + Laser. The plaque samples were collected and dispersed. Next, serial dilutions were prepared and...

Atividade antimicrobiana da soluçãode clorofila sobre Candida albicans e Enterococcus faecalis / Antimicrobial activity of chlorophyll-based solution on Candida albicans and Enterococcus faecalis

A clorofila é uma substância fitoterápica que possui propriedades curativas, apesar de ainda ser pouco utilizada na odontologia. O presente trabalho objetivou analisar a atividade antimicrobiana do extrato de clorofila sobre amostras de Candida albicans e Enterococcus faecalis, utilizando o método de diluição em ágar. Foram incluídos no estudo isolados bucais e amostra-padrão de Candida albicans (ATTC 18804) e Enterococcus faecalis (ATCC 29212). O extrato de clorofila foi diluído em ágar Sabouraud ou Triptic soy, de acordo com o microrganismo a ser testado, o vertido em placas de Petri, obtendo concentrações finais de 50%, 25%, 12,5%, 6%, 3% e 1,5%. As amostras de Candida albicans e Enterococcus faecalis foram semeadas nas placas com auxílio de replicador de Steers. Em seguida, as placas de Petri com C. albicans foram incubadas a 37ºC por 48 horas; para as de E. faecalis procedeu-se do mesmo modo, em 5% de CO2. Os experimentos foram realizados em duplicata. Os resultados mostraram que as concentrações de 50% e 25% do extrato de clorofila foram efetivas nas amostras de Candida albicans, entretanto nas concentrações de 12,5% , 6%, 3% e 1,5% observou-se crescimento. Enterococcus faecalis desenvolveu-se em todas as concentrações. Foi possível concluir que o extrato de clorofila, diluído em até 25%, tem efetiva ação antimicrobiana sobre Candida albicans, não apresentando atividade sobre Enterococcus faecalis nas concentrações testadas

Chlorophyll is a phytotherapic substance that presents curingproperties, however it is rarely used in Dentistry. Objective: to analyzethe antimicrobial activity of a chlorophyll-based solution on isolatesof Candida albicans and Enterococcus faecalis by agar dilution method. Material and Methods: oral isolates and Candida albicans referencestrain (ATCC 18804) and Enterococcus faecalis (ATCC 29212) were included in the study. Chlorophyll extract was diluted in Sabouraud dextrose or brain heart infusion (BHI) agar, according to the testing microorganism and poured in Petri plates, obtaining the fina lconcentrations of 50%, 25%, 12.5%, 6%, 3% and 1.5%. C. albicans and E. faecalis strains were plated with the aid of a Steers' inoculator. Plates were incubated at 37°C for 48 h for C. albicans and at 5% CO2 for E. faecalis. The experiments were performed in duplicate. Results: the results showed that the concentrations 50% and 25% chlorophyll extract were effective against C. albicans. E. faecalis grew in thepresence of all the concentrations. Conclusion: chlorophyll-based solution presents effective antimicrobial activity of C. albicans but did not present any activity on E. faecalis

Avaliação in vitro da citotoxicidade de um novo irrigante: clorofila / In vitro evaluation of the new irrigant cytotoxicity: chlorophyll

A desinfecção do sistema de canais radiculares é o somatório da ação mecânica dos instrumentos com os agentes antimicrobianos usados na irrigação ou na medicação intracanal. Vários estudos foram feitos com o objetivo de se alcançar um irrigante com atividade antimicrobiana e habilidade de solvência de matéria orgânica, porém sem causar severas reações inflamatórias quando em contato com tecidos vitais. O objetivo deste trabalho foi avaliar in vitro o efeito citotóxico da clorofila a 100% no cultivo de células Hep-2 (fibroblasto humano). Essa avaliação foi realizada pelo teste de citotoxicidade em monocamadas celulares, utilizando linhagem de células Hep-2 originária de células epitelióides de carcinoma de laringe humana (Departamento de Imunologia - INCQS) a uma concentração de 5x10 e tempo de exposição de 5 minutos. Compararam-se os efeitos citotóxicos da solução testada com os efeitos da solução aquosa de hipoclorito de sódio a 2,5% como grupo controle positivo e o meio de Duldecco's como controle negativo. Os dados foram submetidos aos testes não paramétricos de Kruskal-Wallis e de Mann-Whitney, a um nível de significância de 5%, demonstrando uma diferença significativa da solução testada quando comparada ao controle. Essa diferença significativa nos mostra que a solução aquosa declorofila a 100% testada se comportou como uma solução não citotóxica, sendo a solução de hipoclorito de sódio a 2,5% severamente citotóxica.

Avaliação in vitro da citotoxicidade do extrato da clorofila / In vitro evaluation of the cytotoxicity of extrect of clorophyll

Introdução: A clorofila tem demonstrado apresentar capacidade de limpeza, aumentando a permeabilidade de túbulos dentinários in vitro. No uso endodôntico, essa substância poderia entrar em contato com o tecido periodontal. Portanto, para indicar a aplicação da clorofila na clínica odontológica se faz necessário analisar sua citotoxicidade primeiramente em cultivo celular, antes dos testes in vivo. O objetivo deste trabalho é analisar a citotoxicidade do extrato da clorofila utilizando cultura de fibroblastos. Método - Foi utilizada a técnica da exclusão de células coradas pelo azul de Trypan em linhagem de fibroblastos de ligamento periodontal humano (linhagem FI3). A clorofila foi diluída na proporção de 1: 1 em meio Eagle modificado por Dulbecco (DME) e aplicada sobre monocamadas confluentes de células FL3. As porcentagens de viabilidade celular foram calculadas após O, 6, 12, 24 horas do contato das células com a clorofila. Resultados - A viabilidade celular das culturas tratadas variou de 70 a 87%, enquanto a viabilidade das culturas-controles tratadas com meio DME sem clorofila variou de 82 a 94%. Portanto, não houve diferença significante entre a viabilidade de células tratadas com a clorofila e células-controle. Conclusão - Os resultados demonstram que a clorofila é uma substância biocompatível no nível in vitro.