Caracterização genotípica de amostras clínicas de Cryptococcus Spp. e avaliação do perfil de virulência in vitro e em modelo de Galleria Mellonella / Genotypic characterization of clinical samples of Cryptococcus spp. and evaluation of the virulence profile in vitro and in a Galleria mellonella model

A criptococose é uma infecção oportunista comum em pacientes HIV positivos, mas também pode afetar pacientes com outras comorbidades imunológicas ou imunocompetentes. Neste trabalho, cepas clínicas de Cryptococcus spp. provenientes de hospitais de São José dos Campos (SP) foram identificadas pela amplificação do gene SRT. A seguir, foi avaliada a sensibilidades das cepas a fluconazol e anfotericina B (AMB) pela técnica de microdiluição conforme EUCAST. Também foi analisada a capacidade de formação de biofilme por cristal violeta (formação da biomassa) e XTT (viabilidade celular). Foram analisadas in vivo a formação da cápsula durante a infecção, a curva de sobrevivência e do índice de saúde em modelo invertebrado de Galleria mellonella. Seis cepas foram identificadas como C. neoformans var. grubbii e uma como C. gattii. Todas as cepas clínicas foram sensíveis a AMB e a concentração inibitória mínima para fluconazol variou entre 2 e 32 µg/mL. Todos os isolados de Cryptococcus spp. foram capazes de produzir biofilme. A sobrevida de G. mellonella infectada variou entre 6 e 7 dias para C. neoformans, e a cepa clínica 6 se mostrou menos virulenta, com 24% das larvas vivas no último dia de experimento. Para cepa de C. gattii, 20,8% das larvas infectadas permaneceram vivas ao final da análise. Em relação a análise do tamanho da cápsula após inoculação in vivo, as cepas clínicas de ambas espécies apresentaram aumento no tamanho, sendo observado o maior percentual de cápsulas ≥ 30µm na cepa 6. O índice de saúde foi capaz de agregar informações ao resultado da curva de sobrevivência de G. mellonella, uma vez que ele mostrou diferenças de saúde das larvas entre os grupos que apresentaram mesmo perfil de sobrevida. A associação do índice de saúde à curva de sobrevivência amplia a visão da vitalidade das larvas durante os dias de experimento e, ainda, auxilia na comparação de resultados entre laboratórios. O conhecimento das características genotípicas e fenotípicas de Cryptococcus spp. em uma determinada região pode ser ferramenta importante para implementação de políticas públicas de saúde eficazes. (AU)

Cryptococcosis is a common opportunistic infection in HIV-positive patients, but it can also affect patients with other immunological comorbidities or immunocompetent. In this work, clinical strains of Cryptococcus spp. from hospitals in São José dos Campos (SP) were identified by amplification of the SRT gene. Next, the sensitivities of the strains to fluconazole and amphotericin B (AMB) were evaluated by the microdilution technique according to EUCAST. Biofilm formation capacity by crystal violet (biomass formation) and XTT (cellular viability) was also analyzed. Capsule formation during infection, survival curve and health index in an invertebrate model of Galleria mellonella were analyzed in vivo. Six strains were identified as C. neoformans var. grubbii and one as C. gattii. All clinical strains were sensitive to AMB and the minimum inhibitory concentration for fluconazole ranged between 2 and 32 µg/mL. All Cryptococcus spp. were able to produce biofilm. The survival of infected G. mellonella ranged between 6 and 7 days for C. neoformans, and the clinical strain 6 was less virulent, with 24% of larvae alive on the last day of the experiment. For the C. gattii strain, 20.8% of the infected larvae remained alive at the end of the analysis. Regarding the analysis of capsule size after in vivo inoculation, the clinical strains of both species showed an increase in size, with the highest percentage of capsules ≥ 30µm being observed in strain 6. The health index was able to add information to the result of the survival curve of G. mellonella, since it showed differences in the health of larvae between the groups that presented the same survival profile. The association of the health index to the survival curve broadens the vision of the larvae's vitality during the days of the experiment and also helps in comparing the results between laboratories. The knowledge of the genotypic and phenotypic characteristics of Cryptococcus spp. in a given region, it can be an important tool for the implementation of effective public health policies (AU)

Estudo dos fatores de virulência de Cândida spp. isoladas da cavidade bucal de pacientes pediátricos em UTI / Study of the virulence factors of Candida spp. isolated from the oral cavity of pediatric patients in the ICU

O presente estudo teve como objetivo avaliar, in vitro, fatores de virulência e susceptibilidade ao fluconazol, associado ou não a Clorexidina, de Candida spp. isoladas de diferentes sítios da cavidade bucal de crianças hospitalizadas em Unidade de Terapia Intensiva (UTI) comparando com isolados de crianças não hospitalizadas. Para isso, foram utilizados isolados de Candida spp., previamente identificados e estocados, oriundos de 30 pacientes de UTI (G1) e 30 pacientes saudáveis (G2), com idade entre 01 e 13 anos, pareados por sexo e idade. A coleta dos espécimes clínicos foi realizada através de esfregaço de mucosa (swab) e raspagem de biofilme dental supragengival, e a identificação das espécies de Candida se deu por espectrometria de massa (MALDI-TOF). Todos os isolados de Candida (n=60, sendo 46 G1 e 14 G2 (C.albicans n=15, C. tropicalis n=5, C. guilliermondii n=32, C. parapsilosis n=5, C. glabrata n=2, C. kefyr n=1) foram então selecionados para a avaliação de fatores de virulência como, formação de biofilme, produção de fosfolipase e protease, susceptibilidade ao fluconazol (FLZ) e clorexidina (CHX); e, verificação de sinergismo, checkerboard, entre as duas drogas. Os resultados foram analisados através do SPSS versão 20 e comparados por meio dos testes Qui-quadrado, Fisher e Razão de chance (95% IC), com nível de significância de 95% (p≤0,05). Tanto os isolados de G1 (97,8%) quanto os de G2 (100%) produziram biofilme (χ2, p=0,76). Quanto a produção de fosfolipase, somente 3 (6,5%) isolados do G1 (todos de C. albicans) foram produtores, sendo um isolado de mucosa (16,7%) e dois em biofilme (40%); No G2, isso aconteceu de modo similar (1 isolado produtor) (χ2, p=0,66). Já em relação a produção de protease, 42 isolados (91,3%), dos quais 100% dos isolados de C. guilliermondii, seguida de C. albicans (81,8%), produziram esta enzima em G1, sendo esta frequência significativamente maior do que a encontrada no G2 com 9 isolados (64,3%) (χ2, p=0,025). Não houve diferença significativa quando comparamos os fatores de virulência entre os isolados oriundos de diferentes sítios, nos dois grupos. Cinquenta e um (85%) isolados foram resistentes ao FLZ, sendo 38 (82,6%) no G1 e 13 (92,9%) no G2 (χ2, p=0,47), sendo a frequência de isolados resistentes similar entre os sítios (mucosa x biofilme dental) (χ2, p=0,40). Foi observado que os poucos isolados resistentes a Clorexidina (n=2; 1 C. tropicalis do G1 e 1 C. albicans do G2), foram sensíveis a combinação FLZ e CHX, mostrando um sinergismo entre as duas drogas. Conclui-se que os pacientes internados em UTI apresentam maior freqüência de isolados de Candida spp. produtores de protease e que isolados de biofilme dental são tão virulentos quanto os de mucosa nesses pacientes. Ainda, a combinação de fluconazol e clorexidina foi eficiente no controle do crescimento de Candida spp. (AU)

The present study aimed to evaluate, in vitro, virulence and susceptibility factors to fluconazole, associated or not with Chlorhexidine, from Candida spp. isolated from different sites in the oral cavity of children hospitalized in an Intensive Care Unit (ICU) compared with isolates from children not hospitalized. For this, Candida spp. Isolates, previously identified and stored, were used, coming from 30 ICU patients (G1) and 30 healthy patients (G2), aged between 01 and 13 years, matched by sex and age. The collection of clinical specimens was carried out through mucosa smear (swab) and scraping of supragingival dental biofilm, and Candida species were identified by mass spectrometry (MALDI-TOF). All Candida isolates (n = 60, 46 G1 and 14 G2 (C.albicans n = 15, C. tropicalis n = 5, C. guilliermondii n = 32, C. parapsilosis n = 5, C. glabrata n = 2, C. kefyr n = 1) were then selected for the evaluation of virulence factors such as biofilm formation, phospholipase and protease production, susceptibility to fluconazole (FLZ) and chlorhexidine (CHX); and, synergism check, checkerboard, between the two drugs. The results were analyzed using SPSS version 20 and compared using the Chi-square, Fisher and odds ratio tests (95% CI), with a 95% significance level (p≤0.05) Both G1 (97.8%) and G2 isolates (100%) produced biofilm (χ2, p = 0.76). Regarding the production of phospholipase, only 3 (6.5%) isolates from G1 (all of C. albicans) were producers, one isolated from the mucosa (16.7%) and two in biofilm (40%); In G2, this happened in a similar way (1 producer isolate) (χ2, p = 0.66). Regarding protease production, 42 isolates (91.3%), of which 100% of the isolates of C. guilliermondii, followed by C. albicans (81.8%), produced this enzyme in G1, this frequency being significantly greater than that found in G2 with 9 isolates (64.3%) (χ2, p = 0.025). There was no significant difference when comparing the virulence factors between the isolates from different sites, in the two groups. Fifty-one (85%) isolates were resistant to FLZ, 38 (82.6%) in G1 and 13 (92.9%) in G2 (χ2, p = 0.47), the frequency of resistant isolates being similar between sites (mucosa x dental biofilm) (χ2, p = 0.40). It was observed that the few isolates resistant to chlorhexidine (n = 2; 1 C. tropicalis from G1 and 1 C. albicans from G2), were sensitive to the combination of FLZ and CHX, showing a synergism between the two drugs. It is concluded that patients admitted to the ICU have a higher frequency of Candida spp. protease producers and that dental biofilm isolates are as virulent as mucosal ones in these patients. Also, the combination of fluconazole and chlorhexidine was effective in controlling the growth of Candida spp. (AU)

Efeito do cloridrato de duloxetina frente a Cryptococcus neoformans: abordagem in vitro e in vivo / Evaluation of the antifungal activity of duloxetine hydrochloride in Cryptococcus neoformans: in vitro and in vivo approach

A criptococose se destaca pela alta incidência principalmente em pacientes imunocomprometidos, sendo responsável por um terço de todas as mortes em pacientes HIV positivos. Cryptococcus neoformans é o agente etiológico dessas infecções e possui uma cápsula composta, principalmente, por glucuronoxilomanana (GXM) e galactoxilomanana (GalXM) e é o maior fator de virulência dessa levedura. Devido ao limitado número de antifúngicos disponíveis, a toxicidade e a resistência a esses fármacos, o reposicionamento de medicamentos, ou seja, o uso de fármacos convencionalmente utilizados para outras finalidades no tratamento de uma nova doença, bem como a combinação entre os mesmos, podem ser opções importantes para o tratamento da criptococose. Os animais invertebrados têm sido amplamente utilizados na avaliação de eficácia e toxicidade de compostos. Assim, o objetivo deste estudo foi avaliar a atividade antifúngica do composto cloridrato de duloxetina (CD) isolado e em combinação com o antifúngico fluconazol (FLZ) utilizando técnicas in vitro e in vivo. Para determinar a Concentração Inibitória Mínima (CIM) e a Concentração Fungicida Mínima (CFM) foi realizada a técnica de microdiluição de acordo com a European Committee for Antimicrobial Susceptibility Testing (EUCAST). Em seguida, foi realizada a avaliação da atividade sinérgica de CD em combinação com FLZ. Além disso, foram avaliados os efeitos isolados de CD bem como as combinações sinérgicas com FLZ em cápsula induzida desta levedura e também na liberação de GXM. Em relação aos ensaios in vivo, o efeito tóxico de CD foi avaliado nos modelos de Caenorhabditis elegans e em Galleria mellonella. Além disso, a eficácia de CD por análise de curva de sobrevivência e o efeito na concentração de hemócitos também foram avaliados em G. mellonella. O fármaco CD apresentou o valor de CIM e CFM de 18,5 µg/mL e quando em combinação com FLZ resultaram em 12 concentrações sinérgicas reduzindo o valor de CIM em 4 a 16 vezes para CD e 4 vezes para FLZ. A análise do efeito de CD e combinações com FLZ mostrou diminuição de 12,5% a 67% no tamanho da cápsula quando avaliadas em concentração sub-inibitória, e em combinação com o FLZ. CD foi capaz de induzir a liberação de GXM em concentração dose-dependente. Em C. elegans e G. mellonella, CD não apresentou efeito tóxico. A dose 18,5 µg/larva de CD em G. mellonella diminuiu 35 vezes a concentração de hemócitos em relação ao grupo PBS. O tratamento isolado e em combinação com FLZ não aumentou o porcentual de sobrevivência de G. mellonella em relação ao grupo controle, fato que pode estar relacionado à alta lipossolubilidade do composto mantendo ligado ao corpo de gordura e impedindo assim seu efeito. Portanto, esse estudo mostrou que CD é ativo frente a C. neoformans in vitro, quando isolado e em combinação com fluconazol, sendo ainda capaz de agir na cápsula desta levedura e liberação de GXM(AU)

Cryptococcosis stands out for its high incidence, mainly in immunocompromised patients, being responsible for one third of all deaths in HIV positive patients. Cryptococcus neoformans is the etiological agent of these infections and has a capsule composed mainly of glucuronoxylomannan (GXM) and galactoxylomannan (GalXM), being considered the major virulence factor of this yeast. Due to the limited number of antifungals available, the toxicity and resistance to these drugs, the repositioning of drugs, that is, the use of drugs conventionally used for other purposes in the treatment of a new disease, as well as the combination between them, may be important options for the treatment of cryptococcosis. Invertebrate animals have been widely used to evaluate the efficacy and toxicity of compounds. Thus, the objective of this study was to evaluate the antifungal activity of the compound duloxetine hydrochloride (DH) isolated and in combination with the antifungal fluconazole (FLZ) using in vitro and in vivo techniques. To determine the Minimum Inhibitory Concentration (MIC) and the Minimum Fungicidal Concentration (MFC), the microdilution technique was performed according to the European Committee for Antimicrobial Susceptibility Testing (EUCAST). Then, the evaluation of the synergistic activity of DC in combination with FLZ was performed. In addition, the effects of DH as well as synergistic combinations with FLZ in capsule induced from this yeast and also in the release of glucuroxylomannan (GXM) were evaluated. In relation to in vivo tests, the toxic effect of DH was evaluated in the models of Caenorhabditis elegans and in Galleria mellonella. In addition, DH efficacy by survival curve analysis and also the effect on hemocyte concentration were also evaluated in G. mellonella. The drug DH showed a MIC and MFC value of 18.5 µg/mL and when in combination with FLZ resulted in 12 synergistic concentrations, reducing the MIC value by 4 to 16 times for DH and 4 times for FLZ. The analysis of the effect of DH and combinations with FLZ showed a decrease of 12.5% to 67% in the size of the capsule when evaluated in sub-inhibitory concentration, and in combination with FLZ. DH was able to induce the release of GXM in dose-dependent concentration. In C. elegans and G. mellonella, DH had no toxic effect. When the treatment effect was evaluated with 18.5 µg / larva in G. mellonella, DH showed a 35-fold reduction compared to the PBS group. However, treatment alone and in combination with FLZ did not increase the percentage of G. mellonella survival in relation to the control group, a fact that may be related to the high liposolubility of the compound keeping it bound to the body of fat and thus preventing its effect. Thus, this study showed that DH is active against C. neoformans in vitro, when isolated and in combination with fluconazole, being able to act in the capsule of this yeast and release GXM(AU)

Impact of brief exposure to antifungal agents on the post-antifungal effect and hemolysin activity of oral Candida albicans

AbstractPost-antifungal effect (PAFE) of Candida and its production of hemolysin are determinants of candidal pathogenicity. Candida albicans is the foremost aetiological agent of oral candidosis, which can be treated with polyene, azole, and echinocandin antifungals. However, once administered, the intraoral concentrations of these drugs tend to be subtherapeutic and transient due to the diluent effect of saliva and cleansing effect of the oral musculature. Hence, intra-orally, Candidamay undergo a brief exposure to antifungal drugs.Objective Therefore, the PAFE and hemolysin production of oral C. albicans isolates following brief exposure to sublethal concentrations of the foregoing antifungals were evaluated.Material and Methods A total of 50 C. albicans oral isolates obtained from smokers, diabetics, asthmatics using steroid inhalers, partial denture wearers and healthy individuals were exposed to sublethal concentrations of nystatin, amphotericin B, caspofungin, ketoconazole and fluconazole for 60 min. Thereafter, the drugs were removed and the PAFE and hemolysin production were determined by previously described turbidometric and plate assays, respectively.Results Nystatin, amphotericin B, caspofungin and ketoconazole induced mean PAFE (hours) of 2.2, 2.18, 2.2 and 0.62, respectively. Fluconazole failed to produce a PAFE. Hemolysin production of these isolates was suppressed with a percentage reduction of 12.27, 13.47, 13.33, 8.53 and 4.93 following exposure to nystatin, amphotericin B, caspofungin, ketoconazole and fluconazole, respectively.Conclusions Brief exposure to sublethal concentrations of antifungal drugs appears to exert an antifungal effect by interfering with the growth as well as hemolysin production of C. albicans.

Fatores de virulência de Candida spp. isoladas da cavidade bucal de crianças infectadas pelo HIV / Virulence factors of Candida spp. isolated from the oral cavity of HIV-infected children

Candida spp. são responsáveis por infecções graves em indivíduos imunossuprimidos. Diversos fatores de virulência contribuem para sua transição de comensais a patógenos, como a formação de biofilme, produção de fosfolipase, produção de protease e a resistência a antifúngicos. O objetivo deste estudo in vitro foi avaliar a formação de biofilme, produção de fosfolipase e protease e a susceptibilidade ao Fluconazol de isolados Candida spp., provenientes da saliva de crianças infectadas pelo HIV (Grupo HIV) e crianças saudáveis (Grupo controle). Também estes fatores foram correlacionados com o uso do HAART, estado imunológico, presença de AIDS e carga viral do grupo HIV. Foi analisado um total de 79 isolados, sendo 48 isolados de C. albicans (33/15) e 20 isolados do complexo C. parapsilosis lato sensu (12/8) dos grupos HIV e controle, respectivamente, e isolados de C. krusei (8), C. tropicalis (1), C. dubliniensis (1) e C. guilliermondii (1) do grupo HIV. Dados médicos e laboratoriais (CD4%, carga viral) foram coletados dos respectivos prontuários médicos. A formação de biofilme foi avaliada pela redução do XTT. Isolados de cada espécie com a habilidade de formar maior quantidade de biofilme maduro (grupo HIV) foram submetidos à microscopia confocal de fluorescência para a visualização da morfologia e estrutura do biofilme. As análises da produção de fosfolipase e protease se deram por meio da metodologia de placas de àgar de gema de ovo e Albumina de Soro Bovino, respectivamente. A susceptibilidade ao Fluconazol foi determinada por meio da técnica de microdiluição. Todos os isolados formaram biofilme (n= 79) e quantitativamente, esta formação foi semelhante em ambos os grupos (p>0.05). A formação de biofilme dos isolados de C. albicans foi maior do que a dos isolados de Candida não-albicans (p<0.05).A atividade de fosfolipase foi detectada em 40,5% (32/79) de todos os isolados e foi significativamente maior no grupo HIV (p=0.006) e nos isolados de C. albicans deste grupo (p=0,007). A atividade de protease foi detectada em 66 isolados (84,8%) e em ambos os grupos a maioria era produtor relativamente forte ou muito forte. Trinta e três (33/41, 7%) isolados eram resistentes ao Fluconazol, sendo 42,9% do grupo HIV e 39,1% do grupo controle. Não foi observada correlação entre a expressão dos fatores de virulência e os dados médicos relativos ao grupo HIV. No entanto, a expressão dos fatores de virulência dos isolados orais de Candida spp. de crianças infectadas pelo HIV se mostrou acentuada. Este achado pode destacar o papel da imunossupressão na regulação da expressão dos fatores de virulência de Candida spp (AU)

Candida species are responsible for life threatening infections in severely immunocompromised individuals. Several virulence attributes support their transition from commensal to parasite, as the biofilm formation, secretion of phospholipase, protease and the resistance to antifungals. The aims of this study were to assess the in vitro biofilm formation, phospholipase production, protease production and the susceptibility to Fluconazole of Candida spp. recovered from the saliva of HIV infected children and controls. Also, to correlate these features with the use of HAART, immunological status, presence of AIDS and viral load of HIV group. A total of 79 isolates were analyzed: 48 C. albicans isolates (33/15) and 20 C. parapsilosis sensu lato complex isolates (12/8) from HIV and control patients, respectively, while C. krusei (8), C. tropicalis (1), C. dubliniensis (1) and C. guilliermondii (1) from HIV patients only. Medical data was collected, considering antiretroviral therapy, CD4 count and viral load. The biofilm forming ability was analyzed through the XTT reduction assay technique. Representative isolates of each specie with the ability to form more quantity of mature biofilm (HIV group) underwent confocal laser scanning microscopy for the visualization of biofilm morphology and structure. Phospholipase and protease assays were performed through the egg yolk and Bovine Serum Albumin agar plate methods, respectively. Fluconazole susceptibility was determined through the microdilution assay. All isolates were able to form biofilm (n= 79). Quantitatively, Candida isolates from HIV-positive and negative children presented similar ability to form biofilm (p>0.05). In C. albicans isolates from both, HIV and control groups, the biofilm formation was higher than in non-albicans Candida isolates (p<0.05).Phospholipase activity was detected in 40.5% (32/79) of all isolates. Its activity was significantly higher in HIV group (p=0.006) and C. albicans isolates from HIV group (p=0.007). Protease activity was detected in 66 isolates (84.8%) and most of them from both groups were relatively/very strong producers. Thirty three (33/41.7%) of all isolates were resistant to Fluconazole. Most non-albicans Candida isolates from HIV (87.0%) and control (87.5%) groups were susceptible to this drug. No significant difference was detected between groups in biofilm, protease and Fluconazole susceptibility assays. Correlation with medical data in HIV group was not found. Candida spp. isolates of HIV-positive children present increased virulence expression due to significant higher in vitro phospholipase production. This finding may enlighten the relevant role played by immunosuppression in the modulation of Candida virulence attributes (AU)

Cinética da colonização bucal por Candida spp. durante a corticoterapia tópica / Universidade Federal de Minas Gerais. Faculdade de Odontologia

A candidíase bucal é uma importante alteração secundária à corticoterapia tópica bucal. O presente estudo tem o objetivo de avaliar a colonização bucal por cinco espécies de candida durante a corticoterapia tópica e investigar a patogenicidade e a suscetibilidade in vitro ao fluconazol e à anfotericina B. Amostras de raspado bucal de 11 pacientes com líquen plano bucal (LPB) sintomático foram coletadas antes (dia 0), 7 e 30 dias após o início da corticoterapia. Métodos convencionais de identificação e quantificação de candida spp...

Estudo in vivo dos efeitos da terapia fotodinâmica, mediada pelo Photothazine® e luz Led, sobre Cândida Albicans resistente a Fluconazol / In vivo study of the effects of photodynamic therapy, mediated by Photodithazine and LED light, on Fluconazole-resistant Candida albicans

Este estudo avaliou os efeitos da Terapia Fotodinâmica (PDT), mediada pelo Photodithazine® (PDZ) e luz LED, sobre Candida albicans resistente a fluconazol em um modelo de candidose oral induzida. Para isso, camundongos fêmeas de 6 semanas foram imunussuprimidos e inoculados com C. albicans (107 células/mL). Em seguida, aplicou-se 100 mg/L de PDZ (diluído em salina ou hidrogel) na cavidade bucal por 20 min e o dorso lingual foi iluminado (37,5 J/cm² dose de luz). Animais adicionais foram tratados somente com LED ou PDZ. O grupo controle positivo não recebeu nenhum tratamento e, adicionalmente, animais saudáveis receberam tratamento com PDT (n=5). Em seguida, foi feita a recuperação do micro-organismo da língua dos animais. O número de colônias viáveis foi quantificado e os valores de UFC/mL foram determinados. Os animais foram sacrificados e as línguas foram removidas cirurgicamente para análise histológica. Duas colônias de cada animal foram isoladas da placa de cultura para avaliação dos fatores de virulência: adesão e formação de biofilme em superfície abiótica, formas filamentares de crescimento e produção de exoenzimas. Os dados foram analizados por ANOVA (P < 0,05). Os resultados demonstraram que a PDT resultou em redução significativa de C. albicans resistente a fluconazol (1,91 e 1,96 log10) em relação ao grupo controle positivo. Somente a aplicação da luz ou PDZ não reduziu a viabilidade celular. A PDT não ocasionou efeitos adversos no tecido lingual dos animais e reduziu apenas a produção de fosfolipase. A PDT foi efetiva na inativação da C. albicans resistente a fluconazol, sem causar efeitos adversos no tecido lingual.

This study evaluated the effects of Photodynamic Therapy (PDT), mediated by Photodithazine® (PDZ) and LED light, on fluconazole-resistant Candida albicans in a murine model of oral candidosis. For this, six-week-old female mice were immunosuppressed and inoculated with C. albicans (107 células/mL). Then, 100 mg/L of PDZ (diluted in saline or hydrogel) was applied on the oral cavity for 20 min and the dorsum of the tongue was illuminated (37.5 J/cm2 of fluence). The use of PDZ or light only was also investigated. Additionally, healthy animals received treatment with PDT. Positive control animals did not receive any treatment and negative control animals were not inoculated (n=5). After treatment the dorsum of the tongue was swabbed to recover C. albicans. The yeast colony counts were quantified and the number of CFU/mL was determined. The animals were killed and the tongues were surgically removed for histological analysis. Two yeast colony of each group were isolated from the culture plate for the evaluation of virulence factors: adhesion and biofilm formation in abiotic surface, filamentous forms of growth and production of exoenzymes. Data were analyzed by ANOVA (P < 0.05). PDT resulted in a significant reduction of fluconazole-resistant C. albicans (1.91 e 1.96 log10). The application of PDZ or LED only did not reduce the cell viability. PDT did not cause adverse effects in the local mucosa and it was able to reduce only phospholipase production. PDT was effective in the inactivation of fluconazole-resistant C. albicans without harming the tongue tissue

Poly (Methyl Methacrylate) absorption and releasing of nystatin and fluconazole / Absorção e liberação de nistatina e fluconazol por polimetilmetacrilato

Objectives: The aim of this study was to verify if there are poly (methyl methacrylate) (PMMA) absorptionand releasing of nystatin (NYS) and fluconazole (FLZ) after simulated treatment of oral candidosis. Materialsand methods: Specimens (30 × 25 × 5 mm) prepared with PMMA polymerized by hot water bath or microwaveenergy were immersed into NYS (3.12 μg/mL), FLZ (2.56 μg/mL) or deionized water (control) during14 days at 35 ± 2 °C. After treatment simulation, specimens were immersed into distilled water during 3, 7, 10and 14 days. The immersion liquid was changed after each analysis. Higher performance liquid chromatographywas used in order to detect antifungal compounds. In order to determine if there was surface depositionof drugs on PMMA resin, specimens were analyzed with electronic microscopy (SEM). Results: None of theantifungal agents was released from the PMMA resins. Conclusion: Within the limitations of this study, itcould be concluded that PMMA resins had no drug absorption with posterior release.

Objetivos: O objetivo deste estudo foi verificar se o poli (metil metacrilato) (PMMA) é capaz de absorver e liberar nistatina (NYS) e fluconazol (FLZ) após simular um tratamento para candidose oral. Materiais e métodos:Espécimes (30 × 25 × 5 mm) foram preparados em resina de PMMA por banho de água quente ou energia demicro-ondas e, em seguida, imersos em solução contendo NYS (3.12 μg/mL), FLZ (2.56 μg/mL) ou água deionizada(controle) durante 14 dias a 35 ± 2 °C. Após a simulação de tratamento, os espécimes foram imersos em água destilada durante 3, 7, 10 e 14 dias. O líquido de imersão foi trocado após cada análise. Cromatografia líquida de alta performance foi utilizada para detectar a presença dos agentes antifúngicos. Para determinar se houve deposição dos agentes antifúngicos na superfície de PMMA, os espécimes foram analisados por microscopia eletrônica de varredura(MEV). Resultados: Não houve liberação de agentes antifúngicos dos espécimes. Conclusão: Considerando as limitações deste estudo, pode-se concluir que a resina de PMMA não absorve ou libera agentes antifúngicos.

Susceptibility of Candida spp. Oral isolates for azolic antifungals and amphotericin B

Aims: Among the oral infections, candidosis may be considered the most frequent, and C. albicans the most prevalent species. Meanwhile, the non-albicans species may also be related to other infections processes and be able to affect the oral cavity, including periodontal disease. In this sense, understanding the relationship between Candida spp. and host, it is necessary and justified the search of mechanisms modulators of infections and treatments against diseases associated with these yeasts. Methods: Nineteen patients with periodontal disease were involved in this study. The aim was evaluate the susceptibility to azoles antifungals fluconozole, itraconazole, ketoconazole and the polienic anfotericin B against Candida spp isolated from three different sites of the oral cavity from these patients (periodontal disease, being periodontal pocket, oral mucosa and ridge gingival), by the minimum inhibitory concentration method – MIC. Results: Among the samples of C. albicans, 88% showed susceptibility depending on the concentration (SCD) and 3.6 % were resistant to at least one antifungal azole studied. Among the others species, 57% presented SDC and 42.8% showed resistance to at least one of the antifungal azole tested. Regarding to Anfotericin B, 90% of the C. albicans isolates and 3% of the nonalbicans showed resistance. There was no occurrence of resistance to the fluconazole and only 3.6% of C. albicans and 40% of the non-albicans were SDC to this antifungal. Conclusions: Patients with periondontal disease showed relevant levels of colonization by Candida spp, mainly at the oral mucosa and periodontal pocket showing important occurrence of SDC and resistance to the antifungals drugs tested.

Efetividade da terapia fotodinâmica na inativação de Candida spp / Effectiveness of photodynamic therapy on the inactivation for Candida spp

O surgimento da resistência antifúngica aos tratamentos convencionais tem proporcionado o desenvolvimento de novas modalidades terapêuticas para o tratamento da candidose bucal. Nesse contexto, a utilização da PDT vem sendo sugerida como método alternativo para a inativação de microrganismos patogênicos. Este estudo avaliou a efetividade da PDT na inativação de C. albicans e C. glabrata, ATCC e resistente a fluconazol, por meio da utilização do agente fotossensibilizador Photogem® e da iluminação com LEDs de comprimento de onda azul. Inicialmente, os microrganismos avaliados foram inoculados em tubos de ensaio contendo meio de cultura líquido e incubados overnight a 37ºC. Em seguida, foram obtidas suspensões celulares das espécies de Candida avaliadas. Essas suspensões foram transferidas para placas de 96 orifícios, tratadas com cinco diferentes concentrações de Photogem® (2,5; 5; 10; 25 e 50mg/L) e expostas a quatro doses de luz (10,5; 18; 25,5 e 37,5J/cm2). Suspensões adicionais foram tratadas somente com as cinco concentrações do fotossensibilizador ou apenas com as quatro doses de luz. Cada condição experimental foi realizada três vezes. Após a realização desses experimentos, foram obtidas diluições seriadas de cada amostra (10-1 a 10-3), e alíquotas de 25 µL dessas diluições foram plaqueadas, em triplicatas, em Sabouraud Dextrose Agar. Adicionalmente, alíquotas de 25 µL foram removidas das cavidades das placas de orifícios e transferidas diretamente para um quadrante da placa de Petri, sem a realização de diluição. As placas foram incubadas a 37ºC por 48 horas. Após a incubação, foi realizada a contagem das colônias viáveis (ufc/mL), e os valores obtidos foram analisados com o teste t de Student (p < 0,05). Os 16 resultados demonstraram que a inativação de Candida spp. ocorreu de forma concentração/dose dependente, que resultou na completa inativação desses microrganismos em determinadas condições experimentais. A dose de luz mínima que promoveu a completa inativação das duas origens de C. albicans foi 18 J/cm2, em associação com 50mg/L de Photogem® . Após a aplicação de 25,5 e 37,5 J/cm2, baixas concentrações de fotossensibilizador foram requeridas para a inativação total dessa espécie, sendo que diferenças estatisticamente significantes foram apontadas entre os valores obtidos para as duas origens de C. albicans. Também foram observadas diferenças estatisticamente significantes na obtenção da inativação total das duas origens de C. glabrata. Para a ATCC, não houve crescimento de colônias viáveis após o tratamento com 10, 25 e 50 mg/L de Photogem® seguido de iluminação a 37,5 J/cm2 . No entanto, somente as concentrações de 25 e 50 mg/L foram capazes de eliminar a C. glabrata resistente a fluconazol, nas doses de 25,5 e 37,5 J/cm2. Assim, a fotoativação do Photogem® pela luz do LED demonstrou efetividade na inativação das duas espécies de Candida avaliadas, ATCC e resistente a fluconazol

Oral candidosis is an opportunistic infection that affects a significant percentage of the population. The oral infection caused by Candida spp. is usually treated with topical and systemic antifungal drugs. However, the widespread use of these agents has resulted in an alarming increase in the rate of antifungal resistance. Recently, the photodynamic therapy (PDT) has been studied as an alternative modality of killing microorganisms, including viruses, fungi and bacteria. The aim of this study was to determine whether Candida albicans and C. glabrata, ATCC and fluconazole-resistant strains, could be photosensitized by Photogem® in combination with blue Light Emitted Diode (LED). Suspensions of each Candida strain, containing viable cells per milliliter, were treated with five concentrations of Photogem® (2.5, 5, 10, 25 and 50 mg/l), followed by LED irradiation in four light doses (10.5, 18, 25.5 and 37.5 J/cm2). Each experimental condition was carried out in triplicate and repeated tree times. From each sample, serial dilutions were obtained and aliquots of 25 µl of each dilution were plated on Sabouraud Dextrose Agar. All plates were incubated at 37°C for 48 hours. After incubation, colonies were counted (CFU/ml) and the data were statistically analyzed by the Student's t test (p < 0.05). The results demonstrated a concentration/dose-dependent pattern of inactivation, that resulted in complete elimination of all Candida evaluated. The minimal light dose for the complete inactivation of both C. albicans source was 18 J/cm2 , in conjunction with 50 mg/l of Photogem®. After 25.5 and 37.5 J/cm2 , a lower concentration of Photogem® was required to totally inactivate C. albicans ATCC (5 and 2.5 mg/l) in comparison with C. albicans fluconazole-resistant (10 and 5 mg/l). There were statistically significant differences in the log (CFU/ml) for the minimal light dose to complete inactivation of both C. glabrata sources. For C. glabrata ATCC, no viable cells were detected after treatment with 10, 25.5 or 50 mg/l of Photogem® followed by 37.5 J/cm2 , while the association of 25 mg/l with 25.5 J/cm2 was sufficient to totally inactivate the C. glabrata fluconazole-resistant. The photoactivation of Photogem® by blue LED light proved to be effective for the inactivation of fluconazole-resistant and ATCC strains of C. albicans and C. glabrata