Salivary molecules of bone remodeling and tissue repair after head and neck radiotherapy

Abstract Head and neck radiotherapy causes quantitative and qualitative changes in saliva. The objective of this case-control study was to evaluate the salivary biomarkers associated with bone remodeling and tissue repair in patients submitted to radiotherapy for head and neck cancer treatment, compared with non-irradiated individuals. Total unstimulated saliva was collected for ELISA assay analysis of receptor activator for nuclear factor κ B (RANK) and its ligand (RANK-L), osteoprotegerin, matrix metalloproteinase-9/ tissue inhibitor of metalloproteinase-2, vascular endothelial growth factor, and epidermal growth factor. Statistics were performed, and revealed that salivary RANK (p = 0.0304), RANK-L (p = 0.0005), matrix metalloproteinase-9/ tissue inhibitor of metalloproteinase-2 (p = 0.0067), vascular endothelial growth factor (p = 0.0060), and epidermal growth factor (p < 0.0001) were reduced in patients, compared with the control group. Osteoprotegerin did not differ between the groups (p = 0.3765). Salivary biomarkers did not differ according to radiotherapy completion time (p > 0.05). In conclusion, the lower output of the salivary molecules - essential for bone remodeling and tissue repair - may disrupt tissue homeostasis and play a role in the pathogenesis of the radiotherapy-induced deleterious effects in the oral cavity.

The functional EGF+61 polymorphism and nonsyndromic oral clefts susceptibility in a Brazilian population

AbstractNonsyndromic oral clefts are considered a problem of public health in Brazil, presenting a multifactorial etiology that involves genetic and environmental components, such as maternal alcohol consumption. Several candidate genes have been investigated to identify some association with nonsyndromic clefts risk. The epidermal growth factor (EGF) gene is implicated in the normal craniofacial development and its functional +61 A>G polymorphism has been related to cancer susceptibility. It has been suggested that cancer and oral clefts may share the same molecular pathways.Objective Our goal was to evaluate the association between the EGF+61 A>G polymorphism and nonsyndromic oral clefts susceptibility.Material and Methods The case-control study included 218 cleft cases and 253 controls from Brazil. The control group was comprised of individuals without congenital malformations, dental anomalies and family history of clefts. The cleft phenotypes and subphenotypes were determined based on clinical examination. Genomic DNA was extracted from oral mucosa cells obtained by mouthwash. The EGF+61 A>G polymorphism genotype was determined by polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism.Results We noticed the association between maternal alcohol consumption during pregnancy and cleft occurrence. The A allele and AA genotype were over-represented in cleft cases compared with control group when we considered the bilateral cleft lip with or without cleft palate (CL±P) cases, cleft cases with tooth agenesis and cleft cases presenting family history of cleft, but the differences were not statistically significant. Contradictorily, the G allele was higher in cleft palate only (CP) cases than in control group, showing a borderline p value. Comparing the different cleft phenotypes, we observed statistical differences between CP and CL±P cases. Our data suggest the EGF+61 A>G polymorphism was not related with nonsyndromic oral clefts susceptibility in a Brazilian population, but supported the different genetic background between CL±P and CP. Moreover, we confirmed the potential effect of maternal alcohol intake on cleft risk in our population.

Imunoexpressão do EGFR e da PODOPLANINA em cistos radiculares e dentígeros / Immunostaining of EGFR and podoplanin in radicular cysts and dentigerous

Os cistos radiculares (CRs) e dentígeros (CDs), apesar de possuírem etiologias diferentes, formam uma cavidade patológica revestida por epitélio, a qual cresce em função do acúmulo de líquido em seu interior, à medida que o osso ao redor é reabsorvido e o epitélio vai sendo induzido a proliferar. A proliferação epitelial, que tem sido apontada como um dos processos determinantes no crescimento das lesões císticas odontogênicas, é influenciada por fatores de crescimento como o EGFR (receptor do fator de crescimento epidérmico) e a podoplanina (PDPN), muitos dos quais podem ter sua produção estimulada principalmente durante processos inflamatórios. O objetivo desta pesquisa foi avaliar e comparar a expressão imunoistoquímica do EGFR e da PDPN em 30 casos de CRs e 30 casos de CDs, de forma semiquantitativa, em microscopia de luz, associando-a com o grau de inflamação, localização celular da imunocoloração e com as camadas epiteliais imunomarcadas. Os dados foram avaliados estatisticamente por meio de testes do Qui-quadrado e Exato de Fisher, considerando-se um nível de significância de 5%. Os resultados mostraram que houve elevada imunorreatividade das duas proteínas nas lesões estudadas, sendo observada apenas diferença estatística significativa na imunoexpressão da PDPN (p=0,033), que se mostrou mais elevada nos CRs. Os demais parâmetros analisados não demonstraram diferenças significativas relevantes. Conclui-se que, como o EGFR e a PDPN apresentaram elevada imunoexpressão nas lesões císticas analisadas, essas proteínas participam da patogênese dessas lesões através da estimulação epitelial, apesar de apresentarem etiologias diferentes. Além disso, pode-se inferir que a maior imunomarcação da PDPN em CRs do que em CDs não se mostrou indicador de distinção entre as duas lesões, com relação às suas etiologias, uma vez que nestes últimos essa proteína também apresentou expressão considerável, independente da intensidade do infiltrado inflamatório. (AU)

The radicular cysts (RCs) and dentigerous (DCs), despite having different etiologies, form a pathological cavity lined by epithelium, which grows due to the buildup of fluid inside, as the surrounding bone is reabsorbed and the epithelium will being induced to proliferate. The epithelial proliferation, which has been identified as one of the key processes in the growth of odontogenic cystic lesions, is influenced by growth factors such as EGFR (epidermal growth receptor factor) and podoplanin (PDPN), many of which may have its production stimulated mainly during inflammatory processes. The objective of this research was to evaluate and compare the immunohistochemical expression of EGFR and PDPN in 30 cases of RCs and 30 cases of DCs, semiquantitatively, in light microscopy, associating it with the degree of inflammation, cellular localization of immunostaining and with the immunostained epithelial layers. Data were statistically analyzed by Chi-square test and Fisher exact test, considering a significance level of 5 %. The results showed high immunoreactivity of both proteins in the lesions studied, only statistically significant difference was observed in immunostaining of PDPN (p=0.033), which proved higher in RCs. The other analyzed parameters showed no relevant significant differences. We conclude that, as EGFR and PDPN showed high immunoreactivity in cystic lesions analyzed, these proteins participate the pathogenesis of these lesions through the epithelial stimulation process, despite having different etiologies. Furthermore, it can infer that the higher immunostaining of PDNP in RCs that DCs showed no distinction indicator between the two lesions, regarding their etiologies, once this protein also showed a considerable expression in DCs, independent of the intensity of the inflammatory infiltrate. (AU)

Expressão imunoistoquímica de EGFR e PTEN em displasias epiteliais orais / Immunohistochemical expression of EGFR and PTEN in oral epithelial dysplasia

A displasia epitelial (DE) oral é uma desordem potencialmente maligna (DPM), cujo diagnóstico e gradação histológica se baseiam nas suas alterações arquiteturais e citológicas. Para avaliar o risco de transformação maligna dessas lesões de forma mais precisa é fundamental entender e localizar alterações genéticas e epigenéticas nas células displásicas, as quais podem ajudar a compreender melhor a progressão para a malignidade. Dessa forma, o presente estudo objetivou avaliar a imunoexpressão de EGFR e PTEN nas DEs orais e relacionar esse aspecto com as características clínicas e gradação histológica pelo sistema binário (baixo e alto risco de transformação maligna). Para tanto, foram selecionados 20 casos de DE de alto risco e 20 de baixo risco para serem submetidos à análise imunoistoquímica para os biomarcadores supracitados. A imunomarcação de cada caso foi avaliada semiquantitativamente através de escores e quanto à localização nos estratos epiteliais. A análise estatística foi realizada através dos testes de Mann-Whitney, Qui-quadrado de Pearson, Exato de Fisher e de correlação de Spearman com nível de significância estabelecido em 5%. Os resultados mostraram que 57,5% dos pacientes eram do gênero feminino, a média de idade foi de 57,5 anos, 42,5% foram diagnosticados clinicamente como leucoplasia e a maioria dos casos foi proveniente de lesões localizadas na língua (32,5%). De forma geral, gênero e idade não exerceram influência na imunoexpressão do EGFR e PTEN. A expressão do EGFR foi observada em 100% dos casos, nos quais houve predomínio do escore 3 (75%) e imunoreatividade em todas as camadas epiteliais (55%), independente da gradação histológica (p = 0,453 e p = 0,204, respectivamente). O PTEN revelou positividade de marcação em 87,5% dos casos, nos quais observou-se predomínio do escore 0 (55%) e imunoreatividade limitada à camada basal (40%), porém sem diferenças significativas entre os grupos histológicos (p = 0,904 e p = 0,915, respectivamente). Por fim, quando analisados, em conjunto, os 40 casos de DEs, foi observada uma fraca correlação positiva, estatisticamente significativa, entre os padrões de imunoexpressão do EGFR e do PTEN (r = 0,317; p = 0,046). Com base nesses resultados, alterações no padrão de expressão do EGFR e PTEN sugerem que essas proteínas participam de processos moleculares relacionados com a carcinogênese em mucosa oral. (AU)

The oral epithelial dysplasia (ED) is a potentially malign disorder (PMD) which the diagnosis and histological gradation are based on their architectural and cytological alterations. To evaluate the risk of malign transformation of these lesions in a more precise manner it is fundamental to understand and localize genetic and epigenetic alterations on the dysplastic cells, which can help to comprehend better the progression to malignancy. This way, this study has as an objective to evaluate the immunostaining of EGFR and PTEN in the oral EDs and relate it with the clinical characteristics and histological gradation using the binary system (low and high risk of malign transformation). To this end, 20 cases of high risk ED and 20 of low risk ED were selected to be subject to immunochemical analysis to the aforementioned biomarkers. The immunostaining of each case was evaluated semiquantitatively by scores and it was also analyzed regarding the epithelial strata. Statistical analysis was performed using the Mann-Whitney, Pearson's Chi Square, Fisher's exact and Spearman's correlation tests with significance level set at 5%. The results showed that 57,5% of the patients were female, the mean age was 57,5 years, 42,5% were clinically diagnosed as leucoplasia and most of the cases were from tongue lesions (32.5%). Gender and age did not influence on the immunoexpression of EGFR and PTEN. The expression of EGFR was observed in 100% of the cases, in which were predominance of score 3 (75%) and immunoreactivity limited to the epithelial layers (55%), regardless of the histological gradation (p=0,453 and p= 0,204, respectively). The PTEN revealed marking positivity in 87,5% of the cases, in which it was observed the predominance of score 0 (55%) and immunoreactivity limited to the basal layer (40%), but without significant differences between the histological groups (p= 0,904 and p= 0,915, respectively). Lastly, when the 40 cases of EDs were analyzed collectively, it was observed a weak positive correlation, statistically significant, among the patterns of immunoexpression of EGFR and PTEN (r= 0,317; p=0,046). Based on those results, the alterations in the pattern of immunoexpression of EGFR and PTEN suggest that these proteins participate on the molecular processes related to oral carcinogenesis. (AU)

Fluxo salivar e concentração do fator de crescimento epidérmico (EGF) na saliva de pacientes diabéticos tipo 2 / Salivary flow and epidermal growth factor (EGF) levels in saliva of type 2 diabetic patients

O objetivo deste trabalho foi o de avaliar o fluxo salivar e a concentração do EGF na saliva de pacientes diabéticos, comparados a um grupo controle de pacientes clinicamente sadios. A amostra foi composta de 15 indivíduos divididos em dois gruops, G0 - controle (n=9) e G1 - diabéticos (n=6). A saliva foi coletada por estimulação mecânica com o auxílio de um hiperboloide. A concentração do EGF foi verificada por meio de imunoensaio do tipo sanduíche, com a utilização de Kit ELISA (R&D Systems®) e auxílio de um leitor de microplaca. Pôde-se observar uma média do fluxo salivar de 1,27 ml/min. no G0 e 1.26 ml/min. no G1, não havendo diferença estatisticamente significativa entre os dois grupos, quando empregado o teste t-Student (p=0,972). Quando ao EGF, foram observadas as médias de 1624,08 pg/ml e 2367,66 pg/ml para o G0 e G1, respectivamente, também não sendo esta diferença significante (p=0,559). Os dados deste trabalho demonstram que não houve diferenças significativas do fluxo salivar e da concentração de EGF na saliva dos pacientes diabéticos em relação ao grupo controle.

The aim of this study was to evaluate the salivary flow and the concentration of EGF in saliva of diabetic patients not insulin-dependents compared with a non diabetic patients (control group). Stimulated saliva was collected in two groups of patients: G0 - control (n=9) and G1 - diabetics (n=6), using a hiperbolóide. Saliva was expelled in the first minute and it was despised. In the following five minutes it was collected with a funnel connected to a graduated tube. EGF concentration measurement was performed using a sandwich-type immunoassay, using an ELISA Kit (R&D Systems®) and a microplate reader. It was observed an average of salivary flow of 1.27ml/min. in G0 and 1,26ml/min. in G1 and it was not found significant differences between the two groups (p=0,972). It was also observed an average of 1624.08 pg/ml of EGF in the G0 and 2367.66 pg/ml in the G1 and as the salivary flow the difference was not statistically significant (p=0.559). The data present in this work demonstrate no differences between salivary flow and EGF concentration of diabetic patients as compared as non-diabetic patients.

Mecanismo da saucerização nos implantes osseointegrados / Mechanism of saucerization in osseointegration implants

A saucerização ocorre em praticamente todos os implantes osseointegrados, independentemente do seu design, tipo de superfície, de sua plataforma e de sua conexão, da sua marca comercial e das condições do paciente. A sua velocidade pode ser maior ou menor, mas sua ocorrência parece fazer parte da integração dos implantes com o epitélio e tecido conjuntivo gengival. O conhecimento do seu mecanismo biológico é importante para compreendê-la e, se possível, reduzir ou controlar essa perda óssea cervical peri-implantar. A saucerização também pode ser referida como “remodelamento ósseo peri-implantar cervical”. Neste trabalho, será apresentada uma explicação para o mecanismo da saucerização, que tem como agente central o Fator de Crescimento Epitelial, também conhecido como Fator de Crescimento Epidérmico, ou simplesmente EGF, produzido pelo epitélio e também encontrado largamente na saliva.

Efeitos biológicos da radioterapia na expressão do fator de crescimento epidérmico (EGF) durante a odontotogênese em camundongos (Mus musculus) / Biological effects of the radiotherapy in the expression of the epidermal growth factor (EGF) during odontogenesis in mice (Mus musculus)

Pacientes portadores de câncer na região de cabeça e pescoço quando submetidos à radioterapia podem apresentar vários tipos de manifestações clínicas, dentre elas a diminuição dos níveis salivares do fator de crescimento epidérmico (EGF). O EGF é uma pequena proteína (53 aminoácidos) que estimula a proliferação de células dos mamíferos, sendo encontrada em vários órgãos em desenvolvimento. Pode também exercer um papel fisiológico na erupção dentária ao interagir com outras moléculas como o fator de crescimento transformante _ (TGF-_), a interleucina 1 (IL-1) e do fator de estimulação de colônia 1 (CSF-1), aumentando a reabsorção óssea e estimulando a quimiotaxia de células mononucleares. O objetivo deste trabalho foi verificar, por meio de reações de imuno-histoquímica, se a expressão do fator de crescimento epidérmico (EGF) pode ser alterada na odontogênese do primeiro molar superior de camundongos Mus musculus, após exposição de fêmeas prenhes a radioterapia, na dose de 3 Gray (Gy) ao décimo dia de gestação. Foram avaliados os germes dentários dos embriões aos 14, 16 e 18 dias de desenvolvimento pré-natal. As análises morfológica microscópica óptica e histomorfométrica demonstraram que o número de células epiteliais periféricas do órgão do esmalte imunopositivas para o EGF foi significativamente menor no grupo 3 Gy em relação ao grupo controle nos períodos de 14º (P<0,0001), 16º (P<0,0001<0,05) e 18º (P<0,0008) dias pré-natais.

Avaliação in vitro da expressão das proteínas PTEN, Akt, Mdm2 e p53 em células de carcinoma epidermóide de cabeça e pescoço submetidas a ação de EGF e 17-AAG / In vitro evaluation of the expression of PTEN protein, Akt, Mdm2 and p53 in cells of squamous cell carcinoma of head and neck under the action of EGF and 17-AAG

O carcinoma epidermóide de cabeça e pescoço é responsável por 90% das neoplasias malignas, nesta região. Molecularmente, inúmeras vias de sinalização, ainda não muito bem compreendidas, são responsáveis pelo seu crescimento e invasão para tecidos vizinhos, além de metástases para órgãos distantes. Este trabalho destinou-se a avaliar o crosstalk entre as vias de sinalização do PTEN, Akt, Mdm2 e p53 em quatro linhagens de células de carcinoma epidermóide (HN6, HN19, HN30 e HN31) e queratinócitos imortalizados (HaCat), estimulados com EGF (fator de crescimento epitelial) e 17-AAG. Para observar a localização e os níveis de PTEN, Akt, Mdm2 e p53 nos diferentes compartimentos celulares estas proteínas foram localizadas e quantificadas no interior celular através das técnicas de imunofluorescência e western blot, respectivamente. Os resultados mostraram que a ativação da via do PI3K/Akt, pelo EGF, promoveu a proliferação celular, sendo HN31 a linhagem celular de melhor resposta proliferativa. Quando as células foram tratadas com 17-AAG a linhagem HN31 foi a que melhor traçou um perfil apoptótico com diminuição dos níveis de Akt, ausência de Mdm2 e aumento dos níveis de PTEN e p53. As linhagens celulares HN6 e HN19 continuaram apresentando níveis significativos de Akt e Mdm2, o que sugere um potencialmais agressivo devido a manutenção do comportamento proliferativo e anti-apoptótico destas linhagens.

Head and neck squamous cell carcinoma (HNSCC) represents 90% of all head and neck malignancies. Cancer growth, invasion and metastasis are due to several signaling pathways that, unfortunately, are not completely understood. The aim of this study was the crosstalk evaluation among PTEN, Akt, Mdm2 and p53 signaling pathways in four different HNSCC cell lines (HN6, HN19, HN30 and HN31) and HaCat cell line (immortalized keratinocytes), all of than treated with 10ng/ml EGF (epidermal growth factor) and 2ìM 17-AAG. Western blot and imunofluorescence were performed in order to analyze PI3K/Akt signaling key target proteins: PTEN, Akt, Mdm2 and p53. Treatment of HNSCC cell lines with EGF resulted in activation of the PI3K/Akt pathway and enhanced cell proliferation. The results showed higher proliferative activity in HN31 cell line. The treatment of HNSCC cell lines with 17-AAG inhibited the proliferation in various levels. HN31 cell lines expressed PTEN and p53 in high levels and low expression for Akt and Mdm2 proteins. These findings suggest that 17-AAG can induce p53-dependent apoptosis in HN31 cell lines. On the contrary, HN6 and HN19 cell lines displayed high levels of Akt and Mdm2 proteins, resulting in decreased apoptosis and increased aggressive potential.

Efeitos de EGF e do TGF-β sobre o desenvolvimento e sobre os componentes da matriz extracelular do germe dental in vitro / Effects of the EGF and the TGF-β on the development and components of the extra-cellular matrix of tooth germs in vitro

Germes dentais de molares de fetos de camundongos de 14 ou de 17 dias foram cultivados na presença de EGF ou de TGF-β com a finalidade de estudar os efeitos desses fatores de crescimento sobre o desenvolvimento do germe e sobre os componentes da matriz extra celular do tecido conjuntivo. Após o período de observação os germes foram incluídos em parafina, cortados e corados com hematoxilina e o eosina ou congelados em nitrogênio líquido, cortados e submetidos a reação imunocitoquímica para laminina, fibronectina ou colágeno tipo I. Os resultados mostraram uma série de efeitos que permitiram chegar às seguintes conclusões. 1. houve estimulação da proliferação celular, atraso no desenvolvimento do germe dental e inibição da diferenciação celular sob ação do EGF e mais acentuadamente sob o TGF-β. 2. O EGF e o TGF-β não interferiram na presença e distribuição dos componentes da matriz do conjuntivo estudados. 3. A laminina foi identificada nas interfaces epitélio-ectomesênquima do órgão do esmalte com a papila e com o folículo dentais e da gengiva e em formações vasculares na papila no folículo dentais. 4. A fibronectina foi identificada na papila e no folículo dentais principalmente nos germes dentais de fetos mais idosos e entre o epitélio interno do órgão do esmalte e a papila dental. 5. O colágeno tipo I foi identificado entre o epitélio do órgão do esmalte e o ectomesênquima da papila e o do folículo dentais e em regiões específicas dessas estruturas.

The expression of the epidermal growth factor (EGF) during odontogenesis: immunohistochemical study in mice (Mus musculus) / A expressão do fator de crescimento epidérmico (EGF) durante a odontogênese: estudo imunohistoquímico em camundongos (mus musculus)

O objetivo deste estudo foi verificar, por intermédio da técnica de imunohistoquímica, a expressão do fator de crescimento epidérmico (EGF) na odontogênese do primeiro molar superior em camundongos. Mas Musculus, correlacionando-o com a análise morfológica microscópica óptica. A amostragem constou de 23 animais com idade variando do 13º dia de vida intra-uterina até o 20º dia de vida pós-natal. Os resultados mostraram o EGF sendo expresso por vários tecidos e células participantes da odontogênese. Entretanto, o folículo dentário foi o único local ode a expressão do EGF permaaneceu constante por todo o processo, caracterizando-o como um dos tecidos regladores da odontogênese.