Matrix Metalloproteinase 2: A Possible Role inTooth Development and Eruption / Metaloproteinasa de matriz 2: Un posible papel en el desarrollo dental y la erupción

Abstract 18. Introduction: Tooth development results from a highly coordinated epithelial-mesenchyme interaction in which mesenchyme cells originate the dental papilla and dental follicle, while ectodermal cells originate the enamel organ. Simultaneously, bone tissue is formed around the developing tooth, trapping it in a bony crypt. Tooth eruption requires the resorption of the coronal part of the bony crypt, followed by degradation of the lamina propria, most likely by metalloproteinases (MMPs) activity. Objectives: The aim of this research was to determine MMP-2 expression in the dental germ cells (ameloblasts, odontoblasts, dental papilla and dental follicle) and surrounding tissues (alveolar bone and lamina propria) of rat molars throughout the eruptive process. Material and Methods: A total of 24 rats (4,6,9,11,14 and 16 days old) were used in this study. MMP-2 was detected through immunohistochemistry. A qualitative analysis was performed to investigate the expression of MMP2 in the dental germ cells, lamina propria, and coronal and basal regions of the bony crypt. Results: MMP-2 expression was observed in the dental papilla cells, dental follicle, ameloblasts, odontoblasts and bone cells from the coronal and basal regions of the bony crypt. MMP-2 was also detected in the lamina propria during the mucosal penetration stage of tooth eruption. Conclusion: We conclude that MMP-2 may be important for the extracellular matrix rearrangement necessary for tooth development and secretion of its mineralized tissues. We also conclude that MMP-2 may play a role in the extensive tissue remodeling during the intra-and-extra-osseous phases of the tooth eruption process.

Resumen 24. Introducción: el desarrollo del diente resulta de una interacción epitelial-mesénquima altamente coordinada en la cual las células mesénquima originan la papila dental y el folículo dental, mientras que las células ectodérmicas originan el órgano del esmalte. Simultáneamente, el tejido óseo se forma alrededor del diente en desarrollo y lo atrapa en una cripta ósea. La erupción dentaria requiere la resorción de la parte coronal de la cripta ósea, seguida de la degradación de la lámina propia, muy probablemente por la actividad metaloproteinasas (MMPs). Objetivos: el objetivo de esta investigación fue determinar la expresión de MMP-2 en las células germinales dentales (ameloblastos, odontoblastos, papila dentaria y folículo dentario) y tejidos circundantes (hueso alveolar y lámina propia) de molares de rata a lo largo del proceso eruptivo. Material y métodos: en este estudio se utilizó un total de 24 ratas (4,6,9,11,14 y 16 días de edad). MMP-2 se detectó a través de inmunohistoquímica. Un análisis cualitativo fue realizado para investigar la expresión de MMP-2 en las células de germen dentales, el lámina propria, y las regiones coronales y basales de la cripta ósea. Resultados: la expresión de MMP2 fue observada en las células de la papila dental, el folículo dental, el ameloblastos, el odontoblastos y las células del las regiones basales y coronales de la cripta ósea. La expresión de MMP-2 también se detectó en la lámina propia durante la etapa de penetración de la mucosa de la erupción dental. Conclusión: Concluimos que MMP-2 puede ser importante para el cambio extracelular de la matriz necesario para el desarrollo del diente y la secreción de sus tejidos mineralizados. También concluimos que MMP-2 puede desempeñar un papel en la remodelación extensa del tejido durante las fases intra y extraósea del proceso de erupción dental.

Analysis of MMP-3 polymorphism in osseointegrated implant failure

Polymorphisms in matrix metalloproteinases (MMPs) genes have been associated with several pathologies, including dental implant loss. MMP-3 is crucial to the connective tissue remodeling process. The objective of this study was to investigate the possible relationship between -1612 MMP-3 polymorphism and the early implant failure. A sample of 240 non-smokers was divided: test group 120 patients with one or more early failed implants and control group 120 patients with one or more healthy implants. Genomic DNA from oral mucosa was analyzed by PCR-RFLP. No association of early implant loss with genotypes and alleles of the -1612 polymorphism in MMP-3 were found by the Chi-squared test. Only the presence of the -1612 polymorphism of MMP-3 is not a genetic risk factor for early loss of implants (AU)

Diabetes promove potencialização da reabsorção óssea alveolar e causa desequilíbrio entre MMPs e colágeno em camundongos com doença periodontal experimental / Diabetes potentiates alveolar bone resorption and causes imbalance between collagen and MMPs in mice with experimentally induced periodontal disease

A doença periodontal (DP) e o diabetes mellitus (DM) são doenças inflamatórias crônicas, e quando associadas aumentam a destruição da região periodontal. Por esta razão, o objetivo do nosso trabalho foi avaliar o papel do diabetes sobre o processo inflamatório, reabsorção óssea alveolar, produção de metaloproteinase de matriz (MMP), colágeno e TGF-ß1 em camundongos com DP experimental. Foram utilizados 40 camundongos Balb/c machos de 18 ­ 22 g, distribuídos igualmente em 4 grupos, sendo estes, normal (N), normal com doença periodontal (N+DP), diabético (DM) e diabético com doença periodontal (DM+DP). O diabetes foi induzido por tratamento com estreptozotocina 200 mg/kg por via intraperitoneal. Passados 7 dias os índices glicêmicos foram verificados, e os animais foram considerados diabéticos quando a glicemia apresentava-se igual ou superior a 250 mg/dL. Posteriormente, os camundongos do grupo com DP foram submetidos a uma ligadura em torno dos primeiros molares inferiores, e no 15º dia, estes animais foram eutanasiados e as amostras foram coletadas para as análises seguintes. O tecido gengival marginal foi coletado para as análises de marcadores inflamatórios, tais como, níveis de CXCL2, CCL3 e TGF-ß1 por ELISA, expressão gênica de MMP-2, MMP-9, TGF-ß1 e col1a2 por RT-PCR em tempo real, e atividade enzimática de MMP-2 e MMP-9 por zimografia. Os parâmetros de reabsorção de osso alveolar, recrutamento de neutrófilos e quantificação de colágeno também foram avaliados, pelo processamento histológico das hemimandíbulas, os quais apresentaram diferença significativa no grupo DM+DP. A DP foi capaz de aumentar a produção de CXCL2, CCL3 e TGF-ß1, contudo somente a produção de CXCL2 e CCL3 foi aumentada no grupo DM+DP. A expressão gênica de MMP-2 não apresentou diferença estatística nos grupos analisados, em contrapartida a expressão de MMP-9 foi diminuída com a DP, apresentado diferença significativa no grupo DM+DP, assim como a expressão de TGF-ß1 e col1a2. Nos grupos com DP, houve aumento significativo na atividade de MMP-2 e MMP-9, com potencializada atividade de MMP-2 no grupo DM+DP. Em resumo, nós observamos que o DM mais a DP agravam a resposta inflamatória e processo destrutivo na região periodontal, caracterizada por aumento da migração de neutrófilos, reabsorção óssea, aumento na produção de CXCL2 e CCL3, aumento na atividade de MMP-2 e diminuição da porcentagem de colágeno, sugerindo assim um desequilíbrio no reparo tecidual da região periodontal(AU)

Periodontal disease (DP) and diabetes mellitus (DM) are chronic inflammatory diseases that when associated increase destruction in the periodontal region. Then, the aim of our study was to evaluate the role of DM in inflammatory process, bone resorption, matrix metalloproteinase (MMP), collagen and TGF-ß1 production during periodontal disease experimental in mice. Forty Balb/c mice 18-22 g were used, divided equally into 4 groups, normal (N), normal with periodontal disease (N+DP), diabetic (DM), diabetic with periodontal disease (DM+DP). The diabetes was induced by 200 mg/kg streptozotocin via intraperitoneal. After of 7 days the glycemic indices was evaluated, and animals were considered diabetics than blood glucose has become equal to or greater than 250 mg/dL. Mice of the DP group had a ligature around the first molars, and 15th day, the animals were euthanized and samples were collected for the following analyzes. The gingival tissue was collected to analysis inflammatory markers, such as CXCL2, CCL3 and TGF-ß1 levels by ELISA; gene expression of MMP-2, MMP-9, TGF-ß1 and col1a2 by real time RT-PCR; and MMP-2 and MMP-9 enzyme activity by zymography. The parameters of alveolar bone resorption, neutrophil recruitment and collagen quantification also were evaluated by histological processing of the hemimandibles, which showed significant difference in DM+DP group. Periodontal disease was able to increase CXCL2, CCL3 and TGF-ß1 production, however only CXCL2 and CCL3 production were increased in the DM+DP group. Gene expression of MMP-2 was not significant altered in the groups analyzed, however expression de MMP-9 was reduced in the DP, meanly in the DM+DP group, well as expression of TGF-ß1 and col1a2. In addition, groups with periodontal disease showed significant enhance in the activity of the MMP-2 and MMP-9, with high level activity of MMP-2 in the DM+DP group. In summary, it was possible to observe that diabetes plus DP aggravate inflammatory and destructive process of periodontal region, characterized by increased in the neutrophil migration and bone resorption, higher CXCL2 and CCL3 production, and increase in the MMP-2 activity with change of the amount of collagen, suggesting an imbalance in tissue repair of periodontal region(AU)

Influência das células mioepiteliais neoplásicas benignas de adenoma pleomórfico na produção de MMPs -1, -2, - 8, -9 e -13 por células epiteliais malignas e sua possível relação com o índice de invasão / Influence of benign neoplastic myoepithelial cells of pleomorphic adenoma in the production of MMPs -1, -2, -8, -9 and -13 for malignant epithelial cells and their possible relationship with the invasion index

A célula mioepitelial é um componente de diversos órgãos glandulares, incluindo glândulas salivares e mamárias, que auxilia na excreção do conteúdo glandular, atuando também na sua embriogênese e morfogênese. Além de suas funções normais, ação supressora tumoral tem sido atribuída a esta célula. Utilizando como modelo o Carcinoma Ex-Adenoma Pleomórfico, neoplasia maligna proveniente da malignização das células do Adenoma Pleomórfico (AP), foi estudada a influência das células mioepiteliais neoplásicas no comportamento invasivo de células epiteliais malignas, em um estudo in vitro. Para isso, células de carcinoma epidermoide bucal (CAL 27, ATCC) e de carcinoma ductal (HS578T, ATCC) foram cultivadas em câmaras de invasão, sobre matrigel, com meios condicionados de células mioepiteliais de AP por 96 h. Foi calculado o índice de invasão, quantificada a secreção de MMPs-1,-2,-8,-9 e -13 e de TIMP-1 e -2, por meio de ELISA, e a atividade proteolítica por Zimografia. Os resultados foram submetidos à análise estatística e demonstraram que os meios condicionados de células mioepiteliais provocaram aumento do potencial invasivo de ambas as células malignas. Os meios condicionados exibiram, em geral, maiores quantidades e atividades proteolíticas de MMPs-1 e -2 e quantidades de TIMPs-1 e -2 do que as células malignas. A MMP-8 apresentou baixos níveis em todas as amostras e as MMPs-9 e -13 não foram detectadas. Nestas condições experimentais, as células mioepiteliais promoveram aumento do comportamento invasivo das células epiteliais malignas e as MMPs-1 e - 2 produzidas por elas podem estar envolvidas no processo

The myoepithelial cell is a component of various glandular organs, including salivary and mammary glands, which aids in the excretion of glandular content, also acting in embryogenesis and morphogenesis of the gland. In addition to their normal functions, tumor suppressive action has been attributed to this cell. Using as a model the carcinoma ex pleomorphic adenoma, malignant neoplasm from the malignancy of pleomorphic adenoma cells (PA), the influence of neoplastic myoepithelial cells in the invasive behavior of malignant epithelial cells in an in vitro study was studied. Therefore, cells of oral squamous cell carcinoma (CAL 27, ATCC) and ductal carcinoma (HS578T, ATCC) were cultured in invasion chambers on matrigel with conditioned media of myoepithelial cells of PA for 96 hours. We calculated the invasion índex, quantified the secretion of MMP-1, -2, -8, -9 and -13 and TIMP-1 and -2 by ELISA and the proteolytic activity by zymography. The results were statistically analyzed and showed that the conditioned media of myoepithelial cells caused increased invasive potential of both malignant cells. The conditioned media showed, in general, larger amounts and proteolytic activities of MMP-1 and -2 and amounts of TIMP-1 and -2 than the malignant cells. MMP-8 was decreased in all samples and MMP-9 and -13 were not detected. Under these experimental conditions, myoepithelial cells caused an increase in invasive behavior of malignant epithelial cells and MMP-1 and -2 produced by them may be involved in the process

Influência das células mioepiteliais neoplásicas benignas de adenoma pleomórfico na produção de MMPs -1, -2, - 8, -9 e -13 por células epiteliais malignas e sua possível relação com o índice de invasão / Influence of benign neoplastic myoepithelial cells of pleomorphic adenoma in the production of MMPs -1, -2, -8, -9 and -13 for malignant epithelial cells and their possible relationship with the invasion index

A célula mioepitelial é um componente de diversos órgãos glandulares, incluindo glândulas salivares e mamárias, que auxilia na excreção do conteúdo glandular, atuando também na sua embriogênese e morfogênese. Além de suas funções normais, ação supressora tumoral tem sido atribuída a esta célula. Utilizando como modelo o Carcinoma Ex-Adenoma Pleomórfico, neoplasia maligna proveniente da malignização das células do Adenoma Pleomórfico (AP), foi estudada a influência das células mioepiteliais neoplásicas no comportamento invasivo de células epiteliais malignas, em um estudo in vitro. Para isso, células de carcinoma epidermoide bucal (CAL 27, ATCC) e de carcinoma ductal (HS578T, ATCC) foram cultivadas em câmaras de invasão, sobre matrigel, com meios condicionados de células mioepiteliais de AP por 96 h. Foi calculado o índice de invasão, quantificada a secreção de MMPs-1,-2,-8,-9 e -13 e de TIMP-1 e -2, por meio de ELISA, e a atividade proteolítica por Zimografia. Os resultados foram submetidos à análise estatística e demonstraram que os meios condicionados de células mioepiteliais provocaram aumento do potencial invasivo de ambas as células malignas. Os meios condicionados exibiram, em geral, maiores quantidades e atividades proteolíticas de MMPs-1 e -2 e quantidades de TIMPs-1 e -2 do que as células malignas. A MMP-8 apresentou baixos níveis em todas as amostras e as MMPs-9 e -13 não foram detectadas. Nestas condições experimentais, as células mioepiteliais promoveram aumento do comportamento invasivo das células epiteliais malignas e as MMPs-1 e - 2 produzidas por elas podem estar envolvidas no processo.

The myoepithelial cell is a component of various glandular organs, including salivary and mammary glands, which aids in the excretion of glandular content, also acting in embryogenesis and morphogenesis of the gland. In addition to their normal functions, tumor suppressive action has been attributed to this cell. Using as a model the carcinoma ex pleomorphic adenoma, malignant neoplasm from the malignancy of pleomorphic adenoma cells (PA), the influence of neoplastic myoepithelial cells in the invasive behavior of malignant epithelial cells in an in vitro study was studied. Therefore, cells of oral squamous cell carcinoma (CAL 27, ATCC) and ductal carcinoma (HS578T, ATCC) were cultured in invasion chambers on matrigel with conditioned media of myoepithelial cells of PA for 96 hours. We calculated the invasion índex, quantified the secretion of MMP-1, -2, -8, -9 and -13 and TIMP-1 and -2 by ELISA and the proteolytic activity by zymography. The results were statistically analyzed and showed that the conditioned media of myoepithelial cells caused increased invasive potential of both malignant cells. The conditioned media showed, in general, larger amounts and proteolytic activities of MMP-1 and -2 and amounts of TIMP-1 and -2 than the malignant cells. MMP-8 was decreased in all samples and MMP-9 and -13 were not detected. Under these experimental conditions, myoepithelial cells caused an increase in invasive behavior of malignant epithelial cells and MMP-1 and -2 produced by them may be involved in the process.

Influência do pH na atividade funcional de enzimas endógenas (metaloproteinases -2 e -9) que degradam a matriz de colágeno da dentina coronária e radicular humana / pH-influence on the functional activity of endogenous enzymes (metaloproteinases -2 and -9) that degrade collagen matrix of coronal and radicular human dentin

As metaloproteinases da matriz (MMPs) são uma família de endopeptidades cálcio e zinco dependentes que participam da degradação de praticamente todos os componentes da matriz extracelular. Com o pressuposto de que estas enzimas podem estar relacionadas à progressão da erosão dental e que os agentes ácidos causadores da erosão podem influenciar na ativação das MMPs, o objetivo desse estudo in vitro foi avaliar a influência do pH sobre a atividade funcional das MMP-2 e -9 presentes na dentina coronária e radicular humana. O pó das dentinas coronária e radicular, provenientes de terceiros molares inclusos recém extraídos foi obtido separadamente e submetido ao protocolo de extração das proteínas, com ácido fosfórico a 1%. Após, o extrato contendo as proteínas e o pó de dentina parcialmente desmineralizado foram incubados em uma das respectivas soluções: solução 2 mM de APMA (acetato de 4-aminofenilmercúrio / grupo controle) ou em uma das soluções tampão (fosfato de potássio 0.1 M) com diferentes pHs (2.5, 4.5, 5.0, 6.0 e 7.0). Após a incubação, as proteínas foram separadas por eletroforese, em um gel de poliacrilamida copolimerizado com gelatina, para a avaliação da atividade gelatinolítica das MMPs, por zimografia. Esta análise foi realizada em triplicada e os zimogramas obtidos ao final foram avaliados por densitometria. A quantificação das bandas observadas nos zimogramas foi realizada pelo programa de imagens ImageJ e os dados avaliados de maneira descritiva e qualitativa. Para a avaliação do conteúdo de colágeno solubilizado, o pó de dentina parcialmente desmineralizado e incubado nos respectivos pHs (n = 8) foi mantido em um tampão de incubação durante 24h, e o conteúdo de hidroxiprolina (HYP) liberado neste meio foi mensurado em espectrofotômetro

Os dados obtidos foram avaliados estatisticamente por ANOVA 1 fator, seguido do teste de Tukey, com 5% de significância. A análise por zimografia mostrou bandas evidentes correspondente a MMP-2 na sua forma ativa (66kDa) e bandas menos expressivas relacionadas a sua forma latente (72kDa), tanto para a dentina coronária quanto para a radicular, em todos os grupos experimentais. Não foram identificadas bandas correspondentes a MMP-9, para nenhum dos substratos avaliados. As soluções com os menores pHs (2.5, 4.5 e 5.0) resultaram na maior atividade funcional da MMP-2, em comparação as soluções com os maiores pHs (6.0 e 7.0), em ambos os substratos. Para a análise de HYP, os grupos pH 2.5 e pH 4.5 mostraram valores de absorbância abaixo do limite de detecção do aparelho. Para os demais grupos experimentais, tanto para a dentina coronária quanto para a radicular, foram encontradas diferenças estatisticamente significantes entre eles (p < 0,05). O conteúdo de HYP liberada foi maior para o pH 7.0, comparado aos demais grupos (p < 0,05), exceto para o pH 6.0. Não foi encontrada diferença estatisticamente significante entre os grupos pH 6.0, pH 5.0 e controle (p > 0,05). Conclui-se que a atividade funcional da MMP-2 é dependente do pH. Os menores pHs promoveram um aumento na ativação da MMP-2 da dentina coronária e radicular humana

Matrix metalloproteinases (MMPs) are a family of endopeptidades calcium and zinc dependent that participate in the degradation of pratically all components of the extracellular matrix. With the assumption that these enzymes may be related to the progression of dental erosion and acidic agents that cause erosion can influence the activation of MMPs, the aim of this in vitro study was to evaluate the pH-influence on the functional activity of MMP-2 and -9 present in human coronal and root dentin. The powder of root and coronal dentine, from freshly extracted third molars was separately obtained and subjected to protein extraction protocol, with 1% phosphoric acid. After, the extract containing proteins and the partially demineralized powder were incubated in one of the following solutions: 2 mM APMA (4-aminophenylmercuric acetate / control) or one of the buffer solutions (0.1 M potassium phosphate) with different pHs (2.5, 4.5, 5.0, 6.0 and 7.0). After incubation, the proteins were separated by electrophoresis in a polyacrylamide gel copolymerized with gelatin, to evaluate the gelatinolytic activity of MMPs by means of zymography. This analysis was performed in triplicate and the zymograms obtained were evaluated by densitometry. Quantification of the bands observed in zymograms was performed by ImageJ software and the data were evaluated descriptively and qualitatively. To assess the solubilized dentin collagen, the partially demineralized dentin powder treated with different pHs (n=8) was incubated in an artificial saliva for 24 h, and the amount of hydroxyproline (HYP) released in media was measured by spectrophotometer

Data were statistically analyzed by ANOVA one factor, followed by the Tukey's test, with 5% significance. Zymography showed evident bands corresponding to active MMP-2 (66kDa) and less expressed bands related to its latent form (72kDa), for both coronal and root dentin, in all experimental groups. No bands corresponding to MMP-9 were identified, for both substrates. The lowest pH solutions (2.5, 4.5 and 5.0) yielded the higher functional activity than did the highest pH solutions (6.0 and 7.0), for both substrates. For HYP analysis, the groups pH 2.5 and pH 4.5 showed absorbance values below the detection limit of the equipment. For the other groups, for both coronal and root dentin, statistically significant diferences were found between them (p<0.05). The amount of HYP was higher for pH 7.0 than all other groups (p<0.05), except for pH 6.0. No statistical difference was found between pH 6.0, pH 5.0 and control (p>0.05). It can be concluded that the functional activity of MMP-2 is pH-dependent. Low pH solutions are able to increase the activation of human coronal and root MMP-2

Expressão gênica de moléculas da matriz extracelular e da membrana celular durante a diferenciação de células-tronco adultas da polpa dentária humana / Gene expression of extracellular matrix and cell membrane molecules during cellular differentiation from human dental pulp stem cells

As células-tronco mesenquimais (MSCs) são células multipotentes que tem o potencial de se diferenciarem em várias linhagens celulares in vitro e in vivo. Estas são encontradas em nichos específicos em muitos órgãos e tecidos adultos, tais como medula óssea, tecido adiposo, músculo, dente, cordão umbilical, pele, cartilagem articular, sendo facilmente isoladas, expandidas e com alta capacidade proliferativa in vitro. Assim, estas características têm despertado grande interesse na sua utilização como uma potencial fonte de células para o reparo e regeneração tecidual de diversos órgãos e tecidos. Pouco se conhece sobre as moléculas que são secretadas pelas MSCs para a matriz extracelular (MEC) e que estão na interface célula-matriz e estão presentes em vias de transdução de sinais intracelulares. Desta forma, o objetivo deste trabalho foi avaliar o perfil de expressão gênica de enzimas que remodelam a MEC (metaloproteinases de matriz MMPs: 15 membros) e seus inibidores (inibidores teciduais das metaloproteinases de matriz TIMPs: 4 membros e RECK) e proteína da membrana plasmática (Caveolina-1) durante a diferenciação osteogenica in vitro a partir de células-tronco mesenquimais da polpa dentária humana (DPSCs). Para tanto, utilizamos polpas dentárias humanas provenientes de terceiros molares de indivíduos adultos (18-32 anos n=3) e as DPSCs isoladas foram imunofenotipadas por citometria de fluxo, avaliada a taxa de proliferação, induzidas as diferenciações osteogênica (1, 7, 14, 21 e 28 dias) e adipogênica (28 dias) e os transcritos avaliados por PCR em tempo real. Estas células foram positivas para o marcadores CD29, CD105, STRO-1, CD44, CD90 negativas os marcadores para CD31, CD45, CD34 e CD14 e são capazes de se diferenciarem em osteoblastos e adipócitos.

Verificamos que as MMP-2, MMP-3, MMP-13, MMP-14, MMP-25, TIMP-3, TIMP-4 e Caveolina-1 foram diferencialmente expressas durante a diferenciação osteogênica, sendo reguladas positivamente apenas no período de 28 dias pós indução e a TIMP-1 regulada positivamente desde o primeiro dia de indução. A MMP-11 e MMP-16 não foram detectadas nas DPSCs e nem durante a diferenciação osteogênica. Desta forma, concluímos que MMPs encontradas bem como a Caveolina-1 e as TIMP-3 e TIMP-4 podem estar participando dos dos eventos de diferenciação óssea em DPSCs, a TIMP-1 pode estar participando de eventos biológicos relacionados as propriedades do estado indiferenciado das DPSCs e da diferenciação óssea e que as MMP-11 e MMP-16 não são expressas pelas DPSCs e também não estão envolvidas na diferenciação osteogênica.

Mesenchymal stem cells (MSCs) are multipotent cells that have the potential to differentiate into various cell lineages in vitro and in vivo. These are found in specific niches in many adult organs and tissues, such as bone marrow, adipose tissue, muscle, tooth, umbilical cord, skin, cartilage, being easily isolated, expanded and high proliferative capacity in vitro. Thereby, these features have attracted great interest in its use as a potential source of cells for tissue repair and regeneration of various organs and tissues. Little is known about the molecules secreted by MSCs into the extracellular matrix (ECM), present at cell-matrix interface and present on intracellular signal transduction. Thus, the aim of this study was to evaluate gene expression profile of ECM remodeling enzymes (matrix metalloproteinases MMPs: 15 members) and their inhibitors (tissue inhibitors of matrix metalloproteinases TIMPs: 4 members and RECK) and plasma membrane proteins (Caveolin-1) that participate in signaling pathways during osteogenic differentiation in vitro from human dental pulp stem cells (DPSCs). Normal human impacted third molars were collected from adults (18-32 years-old n=3) and DPSCs isolated were immunophenotyping by flow cytometry, evaluated the proliferation ratio, induced to osteogenic (1, 7, 14, 21 and 28-days) and adipogenic differentiation (28-days) and the transcript levels evaluated by Real Time PCR.

These cells are positive for CD29, CD105, STRO -1, CD44, and CD90 markers and negative for CD31, CD45, CD34, and CD14 markers and are capable of differentiating into osteoblasts and adipocytes. We found that MMP- 2, MMP -3, MMP -13, MMP -14, MMP -25, TIMP-3, TIMP-4 and Caveolin-1 were differentially expressed during osteogenic differentiation, being upregulated only at 28 days post-induction and TIMP-1 upregulated from the first day of induction. MMP-11 and MMP-16 were not detected in DPSCs neither during differentiation. Thus, we conclude that MMPs, Caveolin-1 found as well as TIMP-3 and TIMP-4 may be participating in the event of bone differentiation in DPSCs, TIMP-1 may participate in biological events related to the properties of the undifferentiated state DPSCs and osteogenic differentiation, MMP-11 and MMP-16 are not also expressed by DPSCs and are not involved in osteogenic differentiation.

Influência in vitro da clorexidina e do chá verde na longevidade de união adesiva resina composta – dentina / In vitro influence of chlorhexidine and green tea on the longevity of resin-dentin bond strength

O objetivo deste estudo foi avaliar a interface adesiva de amostras de dentina bovina / adesivo e resina variando as estratégias adesivas e o tempo de armazenamento. Foram selecionados 80 incisivos bovinos, limpos e seccionados 2,0 mm além da junção amelocementária, desgaste da superfície vestibular do esmalte, com exposição de uma área plana de dentina, a qual foi submetida a diferentes protocolos adesivos. Aleatoriamente, as amostras foram divididas em 4 grupos (n= 20), submetidos às estratégias adesivas: SB – controle: sistema adesivo Adper Single Bond 2 aplicado segundo instruções do fabricante; CLX – clorexidina: aplicação de solução de digluconato de clorexidina 0,2% previamente a aplicação do sistema adesivo semelhante ao SB; EGCG – EGCG10: aplicação da solução em gel de EGCG 10μM – principal componente ativo do chá verde – por 30 s previamente a aplicação do sistema adesivo semelhante ao SB; e CV – solução aquosa de chá verde: aplicação do chá verde – preparado após infusão da erva acondicionada em sachê – previamente a aplicação do sistema adesivo semelhante ao SB. Em todos os grupos foi aplicada resina composta (RC) Amelogen Plus com o auxílio de matriz de silicone, com fotopolimerização por 20 s cada incremento. Posteriormente, os grupos foram redivididos em dois subgrupos (n= 10) de acordo com o tempo de armazenamento em água destilada por 24 h e 6 meses, a 37ºC em estufa bacteriológica. Em seguida, todos os corpos-de-prova foram seccionados no sentido mésio-distal e cérvico-incisal em cortes paralelos de espessura aproximada de 0,8 mm2 em cortadeira Labcut (Extec Technologies – EUA) com refrigeração em baixa velocidade. Desta forma, foram obtidos em média 9 palitos por dente, sendo cada um deles fixado com cola de cianoacrilato, no dispositivo para microtração e submetidos ao ensaio em máquina de teste universal (DL-1000, EMIC, São José dos Pinhais- PR- Brasil), com carga de 10 kgf e velocidade de 1,0 mm/min, sendo os dados expressos em MPa. Os ...

The aim of this study was evaluate the adhesive interface of bovine dentin samples / adhesive and resin varying adhesive strategies and time of storage. Eighty bovine incisors were selected, cleaned and sectioned 2.0 mm beyond the cementoenamel junction; the labial surface of the enamel was worn to obtain a flat area of exposed dentin. The dentin was subjected to different adhesives protocols. Samples were randomly divided into 4 groups (n = 20), according to the adhesive strategies: SB - control: Adper Single Bond 2 (SB) system was applied according to manufacturer's instructions; CHX - chlorhexidine: application of 0.2% chlorhexidine gluconate solution prior to adhesive system similar to SB; EGCG - EGCG10: application 10 μM EGCG gel - the main active component of green tea - for 30 s prior to application of the adhesive system similar to SB; and GT - aqueous green tea: application of green tea - prepared after infusion of the herb sachet - prior to application of the adhesive system similar to SB. The composite resin Amelogen Plus was applied in all groups with aid of silicone matrix, and lightcured for 20 s. Subsequently, groups were re-divided into two subgroups (n = 10) in accordance with the time of storage in distilled water, for 24h or 6 months at 37°. Specimens were sectioned to obtain parallel cuts and beams of approximately 0.8 mm2. Cut procedure was performed in Labcut cutting machine (Extec Technologies - USA) at low speed with cooling. Nine beams per tooth were obtained. Each beam was attached with cyanoacrylate glue to a device prepared for submission to the microtensile test, using a universal testing machine (DL-1000, EMIC, Pinhais-PR-Brazil) with 10 kgf load and speed of 1.0 mm / min. Results were expressed in MPa. Data were analyzed by two-way ANOVA and Tukey's test. Results: Mean (SD) values (in MPa) were as follow: 24h – SB 40.81(8.20); CHX 41.76(6.28); CV 37.38(7.98); EGCG 35.91(13.43) 6-month period – ...

Perfil de expressão das metaloproteinases de matriz (MMPs) e seus inibidores (TIMP e RECK) em tumores odontogênicos benignos / Expression profile of matrix metalloproteinases (MMPs) and their inhibitors (TIMP and RECK) in odontogenic tumors benign

Os tumores odontogênicos benignos compreendem um grupo de neoplasias originárias dos tecidos dentários. Pesquisas vêm buscando identificar moléculas envolvidas nos mecanismos moleculares que regulam a remodelação da matriz extracelular (MEC) e como isto influencia no comportamento localmente invasivo presente em alguns destes tumores. A Transição Epitélio-Mesenquimal (TEM conversão do fenótipo epitelial em mesenquimal) é bem caracterizada em diversos carcinomas, culminando em mestástase. MMPs são enzimas que degradam os componentes da MEC, geram moléculas bioativas, participam da TEM e o controle da remodelação da MEC dá-se pelo balanço entre elas, seus inibidores (TIMPs e RECK) e seu ativador (EMMPRIN). Assim, o objetivo deste trabalho foi delinear o perfil de expressão das MMPs (-2, -7, -9 e -14), seus inibidores (TIMPs -2, -3, -4 e RECK), seu ativador (EMMPRIN) e marcadores da TEM (Snail, Slug, N-caderina, Fibronectina, a-Actina de músculo liso e Vimentina) em Ameloblastomas (AB) e Tumores Odontogênicos Cístico Calcificantes (TOCC). Ainda, realizamos a comparação da expressão de cada molécula avaliada em cada compartimento celular (epitélio e estroma) e correlação entre as moléculas avaliadas no mesmo tumor. Utilizamos 19 casos de AB e 18 casos de TOCC (Serviço de Anatomia Patológica da FOUSP), localização das enzimas/proteínas por imunoistoquímica e analisadas nos compartimentos epitelial e estromal

Todas as proteínas/enzimas analisadas foram detectadas tanto nos AB quanto nos TOCC, sendo a maioria expressa em ambos os compartimentos. A N-caderina foi localizada apenas no epitélio dos AB e a Vimentina somente no estroma em ambos os tumores. Na comparação entre o epitélio x estroma dos ameloblastomas, verificamos que houve diferença estatisticamente significante (p<0,05) para a MMP-2, MMP-7, EMMPRIN/CD147, Fibronectina, a-Actina de músculo liso, N-caderina, Vimentina, Snail e Slug. Na comparação entre o epitélio x estroma dos TOCC, verificamos que houve diferença estatisticamente significante (p<0,05) para a MMP-9, RECK, EMMPRIN/CD147, Vimentina, N-caderina, Snail e Slug. Assim, entre o epitélio x estroma dos ameloblastomas e TOCC, verificamos que houve diferença estatisticamente significante (p<0,05) para a MMP-2, MMP-7, MMP-9, RECK, EMMPRIN/CD147, Fibronectina, Vimentina, a-Actina de músculo liso, N-caderina, Snail e Slug. Esta é a primeira vez que a EMMPRIN, RECK, TIMP-3, TIMP-4, Ncaderina, Snail e Slug são descritas em TOCC e TIMP-3, TIMP-4, Snail e Slug em ameloblastomas. Concluímos que estas proteínas/enzimas estão diferencialmente expressas tanto no epitélio quanto no estroma destes tumores e sugerimos que estes podem participar do comportamento localmente invasivo.

Odontogenic tumors comprise a group of benign neoplasms originating from dental tissues. Research looking for identify molecules involved in the molecular mechanisms that regulate extracellular matrix remodeling (ECM) and how this impacts on locally invasive behavior present in some of these tumors. Epithelial-Mesenchymal Transition (EMT - conversion of epithelial phenotype into mesenchymal phenotype) is well characterized in several carcinomas, leaving to metastasis. MMPs are enzymes that degrade ECM components, generate bioactive molecules, participating in the EMT and control ECM remodeling is given by the balance between them, their inhibitors (TIMPs and RECK) and its activator (EMMPRIN). The aim of this study was evaluate expression profile of MMPs (-2, -7, -9 and - 14), their inhibitors (TIMPs -2, -3, -4 and RECK), its activator (EMMPRIN) and EMT markers (Snail, Slug, N-cadherin, Fibronectin, -smooth muscle actin and Vimentin) in ameloblastomas (AB) and Calcifying Cystic Odontogenic Tumor (CCOT). We also compared the expression of each molecule assessed in each cellular compartment (epithelium and stroma) and correlation between molecules evaluated in the same tumor. We used 19 AB cases and 18 CCOT cases from files of Pathology Laboratory (FOUSP), localization of enzymes/proteins and analyzed by immunohistochemistry in epithelial and stromal compartments

All proteins/enzymes were detected in both AB and CCOT, mostly expressed in both compartments. N-cadherin was localized only in the epithelium of AB and Vimentin only in stromal in both tumors. Comparing "epithelium vs stroma" of AB, we observed a statistically significant difference (p <0.05) for MMP-2, MMP-7, EMMPRIN/CD147, Fibronectin, -smooth muscle actin, N-cadherin, Vimentin, Snail and Slug. Comparing "epithelium vs stroma" of CCOT, we observed a statistically significant difference (p <0.05) for MMP-9, RECK, EMMPRIN/CD147, Vimentin, N-cadherin, Snail and Slug. Analizing epithelium vs stroma" between AB and CCOT, we observed a statistically significant difference (p <0.05) for MMP-2, MMP-7, MMP-9, RECK, EMMPRIN/CD147, Fibronectin, Vimentin , -smooth muscle actin, N-cadherin, Snail and Slug. This is the first time that EMMPRIN, RECK, TIMP-3, TIMP-4, N-cadherin, Snail and Slug are described in CCOT and TIMP-3, TIMP-4, Snail and Slug in AB. We conclude that these proteins/enzymes are differentially expressed in both epithelium and stroma of these tumors and suggest that they may participate locally invasive behavior.

Estudo da influência das soluções desmineralizadoras na atividade proteolítica da dentina humana sadia / The influence of demineralizing solutions in the proteolytic activity of human dentin healthy

A degradação da interface adesiva em dentina pode acometer tanto a porção resinosa como a porção orgânica da camada híbrida. Evidências indicam que a degradação da porção orgânica pode ocorrer em parte devido a atividade enzimática de proteases da própria dentina. As metaloproteinases da matriz (MMPs) constituem a primeira classe de enzimas relacionada com a degradação da matriz orgânica. É possível que as MMPs, possam ser reativadas durante o procedimento adesivo em conseqüência da queda do pH do meio. Objetivo: Esta investigação teve como objetivos avaliar a influência de soluções desmineralizadoras com diferentes concentrações de ácido fosfórico (AF1%, AF10% e AF37%) na atividade proteolítica da dentina humana sadia, na degradação do colágeno exposto pela desmineralização, além de identificar imunologicamente as metaloproteinases. Material e Métodos: Vinte dentes molares permanentes foram triturados para obtenção de um pó de dentina. Alíquotas de 1g do pó foram acondicionadas em tubos plásticos para que a desmineralização do substrato pudesse ser realizada de acordo com as três diferentes concentrações de ácido fosfórico testadas. Após a neutralização do ácido com NaOH, as amostras foram centrifugadas. O sobrenadante foi utilizado para mensuração espectrofotométrica do conteúdo de Cálcio (Ca) liberado pela desmineralização. O precipitado obtido foi incubado com tampão de extração de proteínas por 24h a 4°C sob agitação. Nova centrifugação foi realizada e o sobrenadante utilizado para avaliação da atividade da MMP-2 e MMP-9 por zimografia e para a identificação imunológica das metaloproteinases por western blot. O precipitado obtido pela centrifugação foi liofilizado e separado em alíquotas de 40mg (n=10) de pó de dentina para cada condição experimental. As alíquotas foram incubadas em saliva artificial por 24h a 37°C sob agitação e hidrolisadas em autoclave. Após incubação a 65°C por 40 min, as amostras foram avaliadas por espectrofotometria para que a mensuração da concentração do aminoácido hidroxiprolina (HYP) liberado pela degradação do colágeno exposto pudesse ser obtida. Fatias de 0.3 mm da dentina coronária de outro dente foram obtidas e desmineralizadas, de acordo com as diferentes concentrações de ácido fosfórico para avaliação da atividade enzimática através do método da zimografia in situ. Os resultados foram submetidos à análise de variância de um fator sem vinculação ou teste de Kruskal-Wallis para identificação das diferenças existentes entre os grupos experimentais. Para contraste das médias foi realizado o teste de Student-Newman-Keuls com nível de significância de 5% (=0,05). Resultados: A atividade enzimática de MMP-2 foi estatisticamente maior quando a dentina foi desmineralizada com AF 1% ou 10%. O uso do ácido fosfórico 37% diminuiu consideravelmente a atividade desta enzima, em relação ao AF10% (<0,05). Em nenhuma das amostras desmineralizadas com AF foi detectada a atividade enzimática da MMP-9. A identidade da MMP-2 foi confirmada pelo immunoblotting da enzima com anticorpo específico. A MMP-9 não foi expressa nos extratos analisados. A expressão de MMP-2 foi maior quando utilizado AF 1% ou 10% e menor quando foi utilizado o AF 37%.

The dentin adhesive interface degradation can occur in resin and in organic portion of the hybrid layer. Evidence indicates that the degradation of organic matrix may partially occur due to the enzymatic activity of proteases own dentin. The matrix metalloproteinases (MMPs) have been described as the first class of enzymes associated with degradation of the organic matrix. It is possible that MMPs may be reactivated during the adhesive procedure as a result of the fall of pH. Purpose: The objectives of the present investigation are to evaluate the influence of different demineralizing phosphoric acid solutions (PA1%, PA10% and PA37%) on the proteolytic activity of human sound dentin, on the collagen degradation that was exposed after demineralization, as well as to identify the metaloproteases immunologically. Material and Methods: Dentin powder was obtained from twenty human molars. One gram aliquots were placed in polyestyrene tubes and the dentin demineralization was performed using the three different phosphoric acid concentrations tested in this study. After neutralization with NaOH, the samples were centrifuged. The supernatant was used for the spectrophotometrically quantification of calcium (Ca) released by the demineralization while the precipitate was re-suspended and incubated with a protein extraction buffer for 24h at 4ºC under agitation. The sample was centrifuged and the supernatant was used for the identification of MMP-2 and MMP-9 by western blot and for the evaluation of gelatinolytic activity by zymography. The pellet was lyophilized and 40 mg aliquots of the dentin powder (n=10) were incubated in artificial saliva for 24h at 37°C under agitation and hydrolysed in autoclave after incubation at 65°C for 40 min. The samples were analyzed spectrophotometrically to measure the hydroxyproline (HYP) released after collagen degradation.

Avaliação temporal e espacial da expressão das metaloproteinases de matriz tipo de membrana (MT2, MT3, MT4, MT5 e MT6-MMP) durante a ossificação endocondral em camundongos / Temporal and spatial expression of membrane type-MMPs (MT2, MT3, MT4, MT5, and MT6-MMPs) during endochondral ossification in mice

As MMPs são endopeptidases zinco dependentes que, em conjunto, podem degradar todos os componentes da MEC e gerar moléculas bioativas. São as principais responsáveis pelo remodelamento tecidual durante eventos fisiológicos normais como a embriogênese e organogênese e também em eventos patológicos como a invasão tumoral nos tecidos. As pesquisas na área de mineralização biológica têm buscado identificar os genes envolvidos nos mecanismos moleculares que regula o processo de ossificação endocondral. As MMPs e seus inibidores são responsáveis pelo controle da degradação desta matriz, como os inibidores teciduais das MMPs (TIMPs) e a proteína RECK, que, muito provavelmente, determinam o grau de remodelação da matriz extracelular. Desta forma, nosso objetivo foi delinear o perfil temporal e espacial da expressão das MMP-15/MT2-MMP, MMP-16/MT3- MMP, MMP-17/MT4-MMP, MMP-24/MT5-MMP e MMP-25/MT6-MMP durante a ossificação endocondral em embriões de camundongos e em animais recémnascidos através das técnicas de PCR em tempo real e imunohistoquímica. Por imunohistoquímica, nós não encontramos imunomarcação para a MMP-15/MT2- MMP em nenhum dos períodos analisados, apesar da padronização do anticorpo primário. Tanto a MMP-16/MT3-MMP quanto a MMP-24/MT5-MMP foram imunolocalizadas, principalmente, nos osteoblastos do fronte de ossificação da placa de crescimento

Para a MMP-17/MT4-MMP, durante a diferenciação condrocítica (E13) os condrócitos proliferativos foram imunocorados, bem como os condrócitos hipertróficos no centro da cartilagem do molde cartilaginoso (E14). Durante a invasão celular e vascular (E15), as células mesenquimais oriundas do colar ósseo, provavelmente pré-osteoblastos, foram imunocorados na cavidade medular primitiva e osteoblastos fronte de ossificação foram imunocorados, de E16 a PN1. Observamos para a MMP-25/MT6-MMP o mesmo padrão de imunomarcação das demais MT-MMPs, exceto no molde cartilaginoso, onde apenas as células do periósteo e pericôndrio foram imunocoradas, diferentemente da demais que foram localizadas apenas no centro do molde cartilaginoso. A análise da expressão dos transcritos para todas as MT-MMPs revelou o mesmo perfil de expressão, sendo alta durante a fase de diferenciação condrocítica (E13), tendo queda de expressão de E14 a E16. Em E16 há um aumento de expressão até E18 e, novamente, queda até E20 e pouca ou nenhuma expressão em PN7. Apesar deste perfil semelhante, houve uma expressão diferencial entre elas, sendo a MMP-15/MT2-MMP > MMP- 17/MT4-MMP > MMP-16/MT3-MMP > MMP-24/MT5-MMP > MMP-25/MT6/MMP. Os resultados obtidos mostram, pela primeira vez, que as MT-MMPs estão diferencialmente expressas durante a ossificação endocondral normal em camundongos, sugerindo que a atividade biológica destas enzimas esteja atuando na degradação da matriz extracelular pericelular tanto durante a fase de desenvolvimento quanto de formação óssea

MMPs are zinc-dependent endopeptidases that, collectivelly, degrade all components of the ECM and generate bioactive molecules. They are able to remodelate the ECM during normal developmental processes such as embryogenesis and organogenesis, as well as in pathological processes such as tumoral invasion. The biological mineralization research looking for discovering the genes involved in the molecular mechanisms that control the endochondral ossification process. MMPs and their inhibitors (TIMPs and RECK) are responsable for bone matrix remodeling and, probably, determinate the level of its turnover. Thus, our goal was to evaluate the temporal-spatial expression of MMP-15/MT2-MMP, MMP-16/MT3-MMP, MMP-17/MT4-MMP, MMP-24/MT5-MMP, and MMP-25/MT6- MMP in mice embryos and newborns during endochondral ossification by Real Time PCR and immunohistochemistry. By immunohistochemistry, MMP-15/MT2-MMP signal was not detected. Both MMP-16/MT3-MMP and MMP-24/MT5-MMP were immunostained, mainly in osteoblasts at ossification front of growth plate. For MMP- 17/MT4-MMP, proliferative chondrocytes were immunopositive during chondrocyte differentiation (E13) as well as in hipertrophyc chondrocytes at the middle of cartilaginous template (E14)

During cellular e vascular invasion (E15), mesenchymal cells from bone collar, probable pre-osteoblasts, were immunostained at primary bone marrow and osteoblasts at ossification front from E16 e PN1. For MMP- 25/MT6-MMP, perichondrial and periostal cellls were immunostained at cartilaginous template. All MT-MMPs evaluated showed the same transcript levels profile, being high in chondrocyte differentiation (E13), decreasing from E14 to E16. mRNA levels increased from E16 to E18 and, once more, decreasing from E18 to E20. Despite this profile, we observed difference levels: MMP-15/MT2-MMP > MMP-17/MT4-MMP > MMP-16/MT3-MMP > MMP-24/MT5-MMP > MMP-25/MT6/MMP. Our findings show, for the first time, that MT-MMPs are differentially expressed during normal endochondral ossification in mice, suggesting their biological activity act in pericellular extracellular matrix degradation in both development and bone formation

Caracterização química da proantocianidina e avaliação longitudinal da aplicação de substâncias inibidoras da ação das metaloproteinases na resistência de união a dentina / Chemical characterization of the proanthocyanidin and longitudinal evaluation of the application of metalloproteinase inhibitors in dentin bond strength

Tendo em vista a necessidade de inibir a atividade enzimática das metaloproteinases (MMPs) para postergar a durabilidade de restaurações de resina composta, aliada à escassezde conhecimento sobre os efeitos destas substâncias na estrutura do colágeno, o presente estudo objetivou, em um primeiro momento, caracterizar quimicamente diferentes extratosde proantocianidina comercialmente disponíveis, buscando-se selecionar aquele que apresentasse características mais favoráveis para adsorção em colágeno. Em um segundomomento, objetivou-seavaliar as interações químicas do extrato selecionado, correlacionando-se com outras soluções inibidoras de MMPs e diferentes agentes condicionadores teciduais, na estrutura molecular e integridade do colágeno. Em umterceiro momento, objetivou-se avaliar os efeitos das diferentes substâncias testadas anteriormente na durabilidade de restaurações de resina composta, por meio de teste demicrotração em diferentes tempos de armazenamento, além de se testar o uso do hipoclorito de sódio como uma alternativa para envelhecimento dos corpos-de-prova. Para aprimeira fase experimental, os extratos MegaNatural-BP, MegaNatural Gold, Leucoselect e GNC foram caracterizados por cromatografia líquida de alta eficiência em fase reversa(HPLC-RF), espectrometria de massas com ionização por spray de elétrons (ESI-MS) e por espectroscopia de absorção no Infravermelho por transformada de Fourier (FTIR). Foipossível analisar os diferentes constituintes químicos dos extratos, por meio da identificação de monômeros e oligômeros de proantocianidinas, além de quantificar o teor deproantocianidina e dos demais constituintes dos produtos avaliados. Desta forma, determinou-se que o produto MegaNatural-BP foi o que apresentou melhores característicaspara uso clínico, sendo o extrato selecionado para as fases posteriores deste estudo, com poucas quantidades de lipídios e açúcares e com teor de proantocianidina aproximado de91%. Em seguida, foram avaliadas diferentes soluções inibidoras de MMPs (clorexedina 2%, extrato MegaNatural:'BP e solução inibidora com íons metálicos), assim como dois agentes condicionantes superficiais (ácido fosfórico a 35% e solução de EDTA O,lM), na integridade da tripla hélice do colágeno por meio da técnica da reflexão total atenuada da espectroscopia de absorção no infravermelho por transformada de Fourier (ATR-FTIR). Observou-se, por meio da análise das bandas 1235 cm-l e 1450 cm-l de membranas detendão profundo de Aquiles bovino, que nenhuma das substâncias testadas modificou significativamente a estrutura helicoidal da molécula de colágeno, sendo indicadas para posterior uso clínico em dentina.

Given the need to inhibit the enzymatic activity of matrix metalloproteinases (MMPs) to postpone the longevity of composite resin restorations, combined with the lack ofknowledge about the effects of these substances on the collagen structure, this study aimed, at first to chemically characterize different commercially available proanthocyanidinextracts, aiming to select the one with the more favorable characteristics for adsorption on collagen. In a second step, aimed to evaluate the chemical interactions of the selectedextract and to correlate with other inhibitors of MMPs and different tissue conditioners inthe molecular structure and integrity of collagen. In a third step, aimed to evaluate the effects of different substances previously tested on the longevity of composite restorationsby microtensile test at different storage periods, in addition to test the use of sodium hypochlorite as an alternate specimens aging. For the first phase, the extracts MegaNatural¬BP, MegaNatural Gold, Leucoselect and GNC were characterized by reverse phase high performance liquid chromatography (HPLC-RF), mass spectrometry with electron sprayionization (ESI-MS) and by absorption spectroscopy by Fourier transform infrared (FTIR). It was possible to analyze the chemical constituents of different extracts, throughidentification of monomers and oligomers of proanthocyanidins, as well as quantify the amount of proanthocyanidin and other constituents of the tested products. Thus, the selected extract for the later phases of this study was MegaNatural-BP that showed the best characteristics for clinical use, with lesse r amounts of fats and sugars and approximately 91%of proanthocyanidin contento In the second phase, we evaluated different MMPs inhibitors (chlorhexidine 2%, proanthocyanidin extract and inhibitor solution with metal ions) and twosurface conditioning agents (phosphoric acid 35% and EDTA 0.1 M) in the integrity of the collagen triple helix by the technique of attenuated total reflection spectroscopy absorptionby Fourier transform infrared (ATR-FTIR). It was observed through the analysis of the bands 1235 cm-l and 1450 cm-l from membranes of bovine deep Achilles tendon, that none of thecompounds tested significantly altered helical structure of collagen molecule, being recommended for clinical use in dentin.

A Influência das Metaloproteinases da Matriz (MMPs) na Doença Periodontal e Perimplantar: [revisão] / The Influence of The Matrix Metalloproteinases (MMPs) in Periodontal and Peri-Implantar Disease: [review]

As metaloproteinases da matrix (MMPs) são consideradas as proteinases primárias envolvidas na destruição dos tecidos periodontais, através da degradação de moléculas da matriz extracelular. Na presença da doença periodontal e perimplantar, os níveis dessas enzimas se elevam e podem alterar o curso da resposta inflamatória ao redor dos dentes e impantes. O objetivo deste trabalho foi realizar uma revisão da literatura, considerando a importância das metaloproteinases da matriz na modulação da resposta inflamatória nos tecidos periodontais e perimplantares.

The matrix metalloproteinases are considered fundamental proteinases involved into destruction of periodontal tissues, through degradation of extracellular matrix proteins. In the presence of periodontal and peri-implantar disease, the enzymes levels increase and may change the path of inflammatory activity surrounding the teeth and peri-implants. The purpose of this study was to practice a literature review, compairing matrix metalloproteinases and their importance in the modulation of the inflammatory activity involved in periodontal and peri-implantar disease.

Papel da MMP-8 na doença periodontal / MMP-8 E periodontal disease

As metaloproteinases da matriz (MMP) e os inibidores de metaloproteinase da matriz (TIMP) são enzimas extremamente importantes na remodelação do tecido conjuntivo durante o desenvolvimento, homeostase e cicatrização. O desequilibrio entre as MMPs ativadas e seus inibidores endógenos leva ao colapso patológico da matriz extracelular durante a doença periodontal provocando a degradação das fibras colágenas inseridas na raiz e a migração apical do epitélio com formação da bolsa periodontal. A MMP-8 destaca-se entre as MMPs predominantemente presentes no tecido gengival inflamado, fluido gengival crevicular e saliva bem como fluido sulcular e peri-implantar. O nível e grau de ativação desta enzima parecem aumentar com o aumento da atividade e gravidade da doença periodontal e diminuir em seguida ao tratamento. Diante da importância dessa enzima na evolução da doença periodontal, esse trabalho teve como objetivo desenvolver uma revisão de literatura sobre o papel da MMP- 8 e do seu principal inibidor, TIMP-1, na degradação de colágeno gengival durante a doença periodontal, destacando suas características, mecanismo de ação e inibição, expressão tecidual e níveis no fluido gengival crevicular.

Matrix metaloproteinase (MMP) and tissue inhibitor of matrix metalloproteinase (TIMP) are extremely important enzymes in connective tissue remodeling during development, homeostasis and healing. An imbalancebetween active MMPs and TIMPs create a pathological collapse of extracellular matrix during periodontal disease generating degradation of collagen fibers attached to the root surface and epithelial apical migration with pocket formation. MMP-8 is the major class among MMPs observed in inflammed gingival tissue, gingival crevicular fluid, saliva as well as dental and peri-implantar sulcular fluid. The levels and activation of this enzyme seems to increase with the activity and severity of periodontal disease, and decrease after treatment. Due to MMP-8 relevance in periodontal disease development, this paper aimed to review MMP-8 and TIMP-1 participation in gingival collagen degradation during periodontal disease, underlining the enzyme characteristics, action and inhibition mechanisms, tissular expression and gingival crevicular fluid levels.

Avaliação imunoistoquímica das proteínas metalotioneína, pAKT e NF-kB como marcadores de prognóstico de carcinomas / Immunohistochemical evaluation of Metallothionein, pAkt and NF-kB proteins as prognostic factors of Oral Squamous Cell Carcinoma

O carcinoma epidermóide é a neoplasia malígna que ocorre com maior freqüência na boca. Os pacientes portadores desta neoplasia ainda apresentam um pobre prognóstico com índices de sobrevida, em cinco anos, variando de 20 a 40% em vários estudos. Um grande número de trabalhos tem sido direcionado para identificar marcadores que auxiliem no direcionamento do tratamento e melhorem o prognóstico. A metalotioneína (MT) é uma proteína de baixo peso molecular, com alto conteúdo de cisteína e que está associada à resistência neoplásica a várias modalidades de tratamento, e que por isso tem sido estudada como fator prognóstico em uma variedade de neoplasias malígnas humanas. O Fator nuclear kB desempenha um importante papel na ativação de genes que estão relacionados à imunidade, inflamação, sobrevida, apoptose, proteção celular à radiação e à quimioterapia. A proteína serina/treonina quinse Ak é um alvo downstream da quimase 3-fosfaditilinostol, desempenhando um importante papel na proliferação e no bloqueio da apoptose de células cancerígenas. Neste estudo, nós examinamos a expressão das proteínas MT, NF-kB e pAKT em 51 casos de carcinomas epidemóides de boca, através de imunoistoquímica, com a finalidade de investigar suas influências prognósticas, assim como estudar as correlações entre alguns fatores clínicos com a sobrevida. Os resultados mostraram uma associação estatisticamente significante entre a expressão pAkt e NF-kB e entre MT E nf-kB...

Oral squamous cell carcinoma (OSCC) is the most frequent malignant tumor of the oral cavity. In spite of improved therapeutic procedures, patients with OSCC in advanced stage generally present a poor prognosis, with an overall 5-year survival rate that ranges from 20% to 40%. An extensive effort has started to identify features of the oral tumors that predict treatment response and prognosis. The metallothionein (MT), a low-molecular weight protein high cysteine content, seems to be related to neoplastic resistance to oncologic treatment and therefore has been studied as a prognostic factor for a variety of human malignant tumors...

Análise in vitro da expressão de proteínas da matriz extracelular (MEC) e de metaloproteinases da matriz (MMPs) em células-tronco adultas de polpa dentária humana / Analysis of ECM proteins and MMPs expression in human dental pulp stem cells

Células-tronco adultas podem ser isoladas de vários tecidos, dentre eles a polpa dentária humana, tecido originado na papila dentária do dente em desenvolvimento. Estas linhagens multipotentes podem ser estudadas sob vários aspectos, como na elucidação da histogênese de tumores. O objetivo deste estudo foi inferir a histogênese do mixoma odontogênico, neoplasia odontogênica benigna, analisando a expressão de proteínas da matriz extracelular (MEC) e de metaloproteinases da matriz (MMPs) em células-tronco adultas de polpa dentária humana. Três linhagens diferentes de células-tronco originadas de polpas dentárias humanas IDPSCs (DL-1, DL-2 e DL4) foram utilizadas. As proteínas analisadas foram as mesmas expressas na neoplasia: vimentina, colágeno tipo I, fibronectina, tenascina, ácido hialurônico e MMPs (MMP-1, MMP-2 e MMP-9). Imunofluorescência e ensaios enzimáticos foram utilizados para analisar a presença de proteínas nas células cultivadas e no meio de cultura condicionado por estas células, respectivamente. Todas as linhagens celulares expressaram a vimentina e nenhuma expressou o ácido hialurônico. A linhagem celular DL-1 expressou todas as outras proteínas da matriz extracelular estudadas, enquanto que na linhagem DL-2 apenas não foi observada a expressão do colágeno tipo I. Fibronectina e tenascina não foram observados na linhagem DL-4. Todas as linhagens expressaram todas as MMPs, sendo...

Adult stem cells can be isolated from different tissues including the human dental pulp, a structure originated from the dental papillae. These cell lineages are of importance in a series of studies, as the analysis of tumors histogenesis. The aim of this study was to infer the histogenesis of odontogenic myxoma, a benign odontogenic neoplasia by analyzing the ECM and MMPs molecules expressed in human dental pulp stem cells. Three different lineages of immature dental pulp stem cells (IDPSCs) (DL-1, DL-2 and DL-4) were used. The proteins searched were those expressed by the tumoral cells: vimentin, type I collagen, fibronectin, tenascin and hialuronic acid (HA) and the matrix metalloproteinases (MMP-1, MMP-2 and MMP-9). Immunofluorecence and enzymatic assays were used for analyzing the presence of the proteins in the cells and in the culture media conditioned by the cells, respectively. All the lineages expressed vimentin; however none expressed HA. DL-1 lineage expressed all the other ECM proteins, and the expression of type I collagen was not observed in the DL-2 lineage. Fibronectin and tenascin were not observed in the DL-4 lineage. All the lineages expressed all the MMPs. The release of MMP-2 from all cell lineages was significantly higher than those of all other MMPs. Based on the conditions of this study its possible to conclude that the overall expression of MEC proteins and MMPs in the lineages of human dental pulp stem cells...

Principais mediadores inflamatórios envolvidos na fisiopatologia da periodontite: papel de moduladores farmacológicos / Main inflammatory mediators involved in the physiopathology of periodontitis: role of pharmacological modulators

A periodontite é uma doença inflamatória caracterizada por infiltrado leucocitário, perda de tecidos de sustentação, reabsorção do osso alveolar e formação de bolsas periodontais. A gravidade da doença está associada com os mecanismos de resposta do hospedeiro a fatores microbianos uma vez que componentes dessas bactérias são capazes de ativar as células de defesa do hospedeiro determinando a liberação de mediadores que estimulam o dano tecidual. Esses mediadores incluem uma variedade de moléculas tais como citocinas, especialmente IL-1β e TNF-α; prostaglandinas, como PGE2; enzimas hidrolíticas, como as metaloproteinase de matriz (MMP) e o óxido nítrico (NO), um mediador importante que determina eventos de sinalização extra e intracelular, produzindo dentre outros efeitos biológicos, relaxamento da musculatura lisa, com a conseqüente vasodilatação e broncodilatação. Além disso, o NO atua em eventos inflamatórios afetando o metabolismo ósseo. Em conjunto, esses mediadores são responsáveis pela extensão e gravidade da doença. O objetivo dessa revisão foi discutir os principais mediadores inflamatórios envolvidos na patogênese da doença periodontal e o papel de moduladores farmacológicos nesse processo, na perspectiva de contribuir para a compreensão dos fenômenos associados com a lise óssea e a busca de tratamentos que possam alterar o curso evolutivo da doença periodontal.

Periodontitis is an inflammatory disease characterized by leukocyte infiltration, connective tissue loss, alveolar boneresorption and periodontal pocket formation. The disease severity is associated with host resistance to microbial factors since bacteria have the capacity to activate host defense cells, which in turn produce and release mediators that stimulate connective tissue breakdown. These mediators are a wide array of molecules including cytokines, especially IL-1β and TNF-α; prostaglandins, such as PGE2; hydrolytic enzymes, such matrix metalloproteinases (MMP) and nitric oxide (NO), a key mediator which elicits both extra and intracellular signaling events, producing among other effects relaxation of smooth musculature, causing vase and broncodilation asbiological action. Furthermore, NO is considered to act during inflammatory process affecting bone metabolism. Together, those mediators determine the extent and duration of degradative activity. The objective of this review was to discuss the main inflammatory mediators involved in periodontitis pathogenesis and the role of pharmacological modulators in severity disease making an effort to understand the mechanism involved in bone destruction highlighting treatments that may change the periodontal disease severity.

Expressão das MMPs -1, -2 e -9 em cistos radiculares com e sem tratamento endodôntico / Expression of the MMP-1, -2, and -9 in radicular cysts with presence and absence endodontic treatment

Foi avaliada a expressão das MMPs -1, -2 e -9 em cistos radiculares, numa amostra de 30 espécimes, sendo 15 com tratamento endodôntico prévio e 15 sem tratamento endodôntico prévio, através da utilização da técnica imuno-histoquímica. A imunomarcação foi analisada no componente epitelial e no tecido conjuntivo visando estabelecer correlação entre a expressão das MMPs estudadas e a intensidade do infiltrado inflamatório. A marcação das MMPs estudadas no epitélio císticos não exibiu significância estatística; no entanto, houve tendência geral a maior imunomarcação, ligeiramente concentrada nos casos com tratamento endodôntico. No tecido conjuntivo, constatou-se imunomarcação estatisticamente significativa para MMP-1 em células endoletiais nos casos com tratamento endodôntico. As MMPs-2 e -9 exibiram ausência de marcação ou baixa intensidade da mesma nas referidas células da cápsula cística, independente da presença de tratamento endodôntico. Quanto à intensidade da inflamação, observou-se significância estatística apenas quanto à expressão da MMP-2 nos casos sem tratamento endodôntico e com inflamação mais intensa. Os achados demonstraram que a imunomarcação das MMPs em cistos radiculares reflete a exitência de fatores relativos à terapêutica e ao hospedeiro os quais podem interferir positiva ou negativamente na expressão destas proteinases. Portanto, o nível de expressão das MMDPs pode ser útil no monitoramento da efetividade da terapia endodôntica.