In vitro homeostasis of rat oral epithelial cell cultures following withdrawal of periodontal pathogens

Abstract Inflammation of periodontal tissues is the consequence of interaction between periodontal pathogens and immune system. This is associated with increased expression of inflammatory cytokines, which may exert destructive effect to the periodontal tissues when released over long period. The aim of this study was to chronologically track the homeostasis of oral keratinocytes following removal of periodontal pathogens. This was done by investigating expression of selected inflammatory markers and integrity of epithelial monolayers in vitro. Rat oral keratinocytes were stimulated with heat-killed Fusobacterium nucleatum and Porphyromonas gingivalis over 7-days then bacteria were washed away and epithelial cells re-cultured for 3-days. Expression of IL-1β, IL-6, and IL-8 was measured by ELISA while transcription of tissue inhibitor of metalloproteinase-1 (TIMP-1) and matrix metalloproteinase -8 (MMP-8) was measured by polymerase chain reaction before and after removal of bacteria. Integrity of epithelial sheet was investigated by using transepithelial electrical resistance. Data showed general downregulation of IL-1b, IL-6, and IL-8 associated with restoring transcription of TIMP-1 and MMP-8 to normal level following removal of bacteria from epithelial cultures. However, expression of IL-8 and MMP-8 remained significantly higher than unstimulated epithelial cells despite withdrawal of F. nucleatum and P. gingivalis respectively from oral keratinocytes cultures. In addition, integrity of epithelial barrier function remained compromised even after removal of P. gingivalis. Results suggest that even after three days following removal of periodontal pathogens, oral keratinocytes sustained persistent upregulation of certain inflammatory markers that could compromise integrity of epithelial barrier function.

Resumo A inflamação dos tecidos periodontais é a consequência da interação entre patógenos periodontais e o sistema imunológico. Isso está associado ao aumento da expressão de citocinas inflamatórias, que podem exercer efeito destrutivo nos tecidos periodontais quando liberadas por um longo período. O objetivo deste estudo foi rastrear cronologicamente a homeostase dos queratinócitos orais após a remoção dos patógenos periodontais. Isto foi feito através da investigação da expressão de marcadores inflamatórios selecionados e da integridade de monocamadas epiteliais in vitro. Os queratinócitos orais de rato foram estimulados com Fusobacterium nucleatum e Porphyromonas gingivalis destruídas pelo calor por 7 dias, depois as bactérias foram lavadas e as células epiteliais foram cultivadas novamente por 3 dias. A expressão de IL-1b, IL-6 e IL-8 foi medida por ELISA, enquanto a transcrição do inibidor tecidual de metaloproteinase-1 (TIMP-1) e matriz metalopeptidase-8 (MMP-8) foi medida por reação em cadeia da polimerase antes e após a remoção de bactérias. A integridade da folha epitelial foi investigada usando resistência elétrica transepitelial. Os dados mostraram uma regulação negativa geral de IL-1b, IL-6 e IL-8 associada à restauração da transcrição de TIMP-1 e MMP-8 para o nível normal após a remoção de bactérias de culturas epiteliais. No entanto, a expressão de IL-8 e MMP-8 permaneceu significativamente maior que as células epiteliais não estimuladas, apesar da retirada de F. nucleatum e P. gingivalis, respectivamente, das culturas de queratinócitos orais. Além disso, a integridade da função da barreira epitelial permaneceu comprometida mesmo após a remoção de P. gingivalis. Os resultados sugerem que, mesmo após três dias após a remoção dos patógenos periodontais, os queratinócitos orais sustentaram uma regulação positiva persistente de certos marcadores inflamatórios que poderiam comprometer a integridade da função da barreira epitelial.

Estudo da expressão imuno-histoquímica das proteínas MMP-9, MMP-13, e TIMP-1 em ameloblastomas e tumores odontogênicos ceratocistos / Study of immunohistochemical expression of MMP -9, MMP -13 protein, and TIMP - 1 in ameloblastomas and odontogenic keratocysts tumors

Os ameloblastomas e tumores odontogênicos ceratocísticos (TOC) representam lesões odontogênicas que, apesar de sua natureza benigna, se destacam por um comportamento biológico distinto, caracterizado pelo crescimento localmente agressivo e episódios recidivantes. A reabsorção dos ossos gnáticos provocada pelo crescimento dessas lesões constitui um fator determinante à expansão das mesmas, sendo mediada tanto por células osteoclásticas como pela ação enzimática de diversas metaloproteinases de matriz (MMPs). A expressão de fatores estimuladores e inibidores da reabsorção óssea vem sendo correlacionada com o desenvolvimento destas lesões, merecendo destaque algumas MMPs como as colagenases e as gelatinases e os inibidores teciduais de metaloproteinases (TIMPs), dentre outros. Baseados na premissa de que fatores estimuladores e inibidores de processos osteolíticos podem ser determinantes para o ritmo de crescimento de lesões odontogênicas intraósseas, o objetivo de estudo foi avaliar a imunoexpressão das proteínas MMP-9, -13 e TIMP-1 no epitélio e mesênquima de espécimes de ameloblastomas e TOC. A análise estatística foi realizada através dos testes de Mann-Whitney e Wilcoxon com nível de significância estabelecido em 5%. Através de uma análise quantitativa das células imunomarcadas, foi observada a expressão imuno-histoquímica das MMP-9, -13 e TIMP-1 em 100% dos casos, tanto no epitélio quanto no mesênquima tumoral. Mais de 76% das células epiteliais (escore 3) dos TOC e ameloblastomas apresentaram imunomarcação para MMP-9 (p=0,382) e MMP-13 (p=0,069), sendo estatisticamente significativa para o TIMP-1 (p=0,003) nos ameloblastomas. No mesênquima, observou-se maior escore de imunomarcação da MMP-13 (p=0,031) nos ameloblastomas em relação aos TOC, enquanto para a MMP-9 e TIMP-1 não se observou diferença estatisticamente significativa (p=0,403; p=1,000). O cálculo da razão entre os escores de expressão das proteínas revelou, de uma maneira geral, similaridade entre as lesões, sendo observado predomínio significante de igualdade de expressão do TIMP-1 e da MMP-9 apenas no epitélio dos ameloblastomas. A imunoexpressão marcante das MMP-9, MMP-13 e TIMP-1 no epitélio e mesênquima das lesões estudadas indica que estas proteínas participam na remodelação da MEC necessária à progressão tumoral, no entanto, as diferenças pontuais observadas na expressão de algumas destas proteínas, não são suficientes para sugerir diferenças no comportamento biológico dos ameloblastomas e dos TOCs. (AU)

Ameloblastomas and keratocystic odontogenic tumors (KOT) represent odontogenic lesions that, despite their benign nature, are distinguished by a distinct biological behavior, characterized by locally aggressive growth and recurrent episodes. The gnathic bone resorption caused by the growth of these lesions is a key to the expansion of the same, both being mediated by osteoclastic cells like enzymatic activity of various matrix metalloproteinases (MMPs) factor. The expression of stimulatory factors and inhibitors of bone resorption has been correlated with the development of these lesions, with emphasis to some MMPs such as collagenases and gelatinases and tissue inhibitors of metalloproteinases (TIMPs), among others. Based on the premise that stimulatory and inhibitory factors of osteolytic processes can be decisive for the growth rate of intraosseous odontogenic lesions, this experiment evaluated the immunoreactivity of MMP-9, -13 and TIMP-1 protein in the epithelium and mesenchyme of ameloblastoma and the KOT specimens, by a quantitative analysis of the immunoreactivity cells. Statistical analysis was performed using the MannWhitney and Wilcoxon tests with a significance level set at 5 %. Immunohistochemical expression of MMP-9, -13 and TIMP-1 was observed in 100% of cases both in the epithelium and in mesenchyme. The immunoreactivity in the epithelium of KOT and ameloblastomas revealed a predominance of score 3 for MMP-9 (p=0.382) and MMP-13 (p=0.069) and no statistically significance for TIMP-1, the latter being significantly higher immunoreactivity in ameloblastomas. In the mesenchyme, there was a higher score immunoreactivity of MMP-13 (p=0.031) in ameloblastomas in relation to KOT, whereas for MMP-9 and TIMP-1 no statistically significant difference (p=0.403 was observed, p=1.000). The calculation of the ratio of scores revealed expression of proteins in general, similarity of the lesions, a significant predominance of equal expression of TIMP-1 and MMP-9 was observed only in the epithelium of ameloblastoma. The marked immunostaining of MMP-9 , MMP-13 and TIMP-1 in epithelium and mesenchyme of the lesion indicate that these proteins involved in ECM remodeling required for tumor progression, however, specific differences in the expression of some of these proteins, are not sufficient to suggest differences in the biological behavior of ameloblastomas and KOTs. (AU)

Estudo da expressão imuno-histoquímica das MMps -2, -7, -9 e TIMPs -1 e -2 em adenomas pleomórficos e carcinomas adenóides císticos de glândulas salivares menores / Study of immunohistochemical expression of MMPs -2, -7, -9, and TIMPs -1 and -2 in pleomorphic adenomas and adenoid cystic carcinoma of minor salivary glands

0 balanço entre a expressão das metaloproteinases da matriz (MMPs) e seus inibidores teciduais (TIMPs) tem sido relacionado a vários processos fisiológicos e patológicos, incluindo a morfogênese de glândulas salivares e os processos de invasão e metástase tumoral. O adenoma pleomórfico (AP) e o carcinoma adenóide cístico (CAC) representam,respectivamente, neoplasias benignas e malignas de glândulas salivares que, embora compartilhem a mesma origem celular, apresentam comportamentos biológicos distintos. O propósito deste estudo foi comparar a expressão imuno-histoquímica das MMPs -2, -7, -9 e -26 e dos TIMPs -1 e -2 em casos de AP e CAC de glândulas salivares menores. Vinte casosde AP e vinte casos de CAC foram avaliados quanto à presença, intensidade e localização das MMPs e TIMPs no parênquima tumoral. A maioria dos APs e CACs apresentaram alta expressão das MMPs e dos TIMPs, predominantemente localizada nas células tumorais. Nãohouve diferença estatisticamente significativa na expressão das MMPs -2 (p=0,359), -7 (p=0,081) e -26 (p=0,553), bem como dos TIMPs -1 (p=0,657) e -2 (p=0,248), entre o parênquima dos APs e CACs. A MMP-9 demonstrou uma diferença significativa de expressão entre os dois tumores, apresentando o CAC uma marcação mais intensa para esta gelatinase(p=0,041). A forte expressão da MMP-9 observada no parênquima dos CACs sugere que esta gelatinase possa desempenhar um papel importante no comportamento biológico destes tumores. Por outro lado, apesar de não ocorrer uma diferença significativa entre as médias das MMPs -2, 7 e 26 nos tumores estudados, os dados quando analisados em conjunto sugeremque estas proteases podem estar participando de processos de remodelação tecidual em ambos os tumores, mas não apresentam uma relação direta com o padrão de agressividade do CAC...

Papel da MMP-8 na doença periodontal / MMP-8 E periodontal disease

As metaloproteinases da matriz (MMP) e os inibidores de metaloproteinase da matriz (TIMP) são enzimas extremamente importantes na remodelação do tecido conjuntivo durante o desenvolvimento, homeostase e cicatrização. O desequilibrio entre as MMPs ativadas e seus inibidores endógenos leva ao colapso patológico da matriz extracelular durante a doença periodontal provocando a degradação das fibras colágenas inseridas na raiz e a migração apical do epitélio com formação da bolsa periodontal. A MMP-8 destaca-se entre as MMPs predominantemente presentes no tecido gengival inflamado, fluido gengival crevicular e saliva bem como fluido sulcular e peri-implantar. O nível e grau de ativação desta enzima parecem aumentar com o aumento da atividade e gravidade da doença periodontal e diminuir em seguida ao tratamento. Diante da importância dessa enzima na evolução da doença periodontal, esse trabalho teve como objetivo desenvolver uma revisão de literatura sobre o papel da MMP- 8 e do seu principal inibidor, TIMP-1, na degradação de colágeno gengival durante a doença periodontal, destacando suas características, mecanismo de ação e inibição, expressão tecidual e níveis no fluido gengival crevicular.

Matrix metaloproteinase (MMP) and tissue inhibitor of matrix metalloproteinase (TIMP) are extremely important enzymes in connective tissue remodeling during development, homeostasis and healing. An imbalancebetween active MMPs and TIMPs create a pathological collapse of extracellular matrix during periodontal disease generating degradation of collagen fibers attached to the root surface and epithelial apical migration with pocket formation. MMP-8 is the major class among MMPs observed in inflammed gingival tissue, gingival crevicular fluid, saliva as well as dental and peri-implantar sulcular fluid. The levels and activation of this enzyme seems to increase with the activity and severity of periodontal disease, and decrease after treatment. Due to MMP-8 relevance in periodontal disease development, this paper aimed to review MMP-8 and TIMP-1 participation in gingival collagen degradation during periodontal disease, underlining the enzyme characteristics, action and inhibition mechanisms, tissular expression and gingival crevicular fluid levels.