Expressão imunoistoquímica das proteínas p53 e MDM2 em carcinoma espinocelular de boca / p53 and MDM2 proteins immunohistochemical expression in oral squamous cell carcinoma

A proposta deste estudo foi avaliar a correlação entre duas proteínas associadas ao ciclo celular com grau histológico de malignidade dos carcinomas orais. Por meio da técnica imunoistoquímica, 30 casos de carcinoma espinocelular de boca foram estudados . Anticorpos monoclonais DO-7 e 1B10, direcionados à p53 e MDM2, respectivamente, foram utilizados. O acúmulo nuclear da proteína p53 foi encontrado em aproximadamente 80% dos carcinomas orais. A proteína MDM2 foi detectada em 90% dos casos. foi observada correlação estatística significante entre ambos os marcadores (p = 0,046), mas não foi encontrada associação significante entre estes e o grau histológico de malignidade. Não foi encontrada correlação entre p53 e MDM2 com o grau histológico de malignidade. Em adição, embora alterações na expressão da p53 representem um evento bem estabelecido em carcinogênese oral, outros mecanismos distintos podem ser considerados, como aqueles envolvendo seu principal regulador, o gene MDM2

Avaliação do comportamento biológico de materiais endodônticos utilizando duas linhagens celulares / Cytotoxicity and genotoxicity of endodontic materials in two cell lines

Alguns materiais endodônticos são capazes de liberar componentes tóxicos que podem interagir com o tecido pulpar e/ou periapical. A proposta deste estudo foi avaliar in vitro, em nível molecular, os possíveis efeitos citotóxicos e genotóxicos de materiais endodônticos sobre cultura de células pulpares humanas transformadas (tHPC) e fibroblastos V79. Os espécimes de hidróxido de cálcio (HC, Hydro C, Dentsply, Brasil), MTA cinza (Angelus, Brasil), MTA branco (Angelus, Brasil) e polímero da mamona (POM, Poliquil, Brasil) foram misturados e colocados em meio de cultura (91,6 mm2 superfície /ml) por 24h em 37°C.Vitrebond (3M ESPE) foi utilizado como grupo controle positivo. As tHPC foram expostas aos extratos e diluições dos materiais e após 24h, a sobrevivência celular foi determinada pelo teste de cristal violeta. A liberação de espécies reativas de oxigênio (ROS) em tHPC foram mensuradas após 1h de exposição aos materiais. ROS foram detectados pelo manchamento das células com H2DCF-DA e a fluorescência foi mensurada por citometria de fluxo (FACS). A genotoxicidade foi determinada pela formação de micro núcleos em células V79 após 24h de exposição ao HC, MTA cinza, POM e etilmetano sulfanato (controle positivo). O atraso do ciclo celular normal de células V79 foi analisado, após a exposição ao MTA cinza, HC, POM e TEGDMA (controle positivo) por FACS. As diferenças entre a taxa de sobrevivência celular, fluorescência, número de micronúcleos e distribuição de células no ciclo celular foram estatisticamente analisadas pelo teste de Mann-Whitney-U (p<0,05). A citotoxicidade em relação ao grupo controle decresceu na seguinte ordem Vitrebond > HC > MTA branco =MTA cinza >>> POM. O POM causou indução da proliferação celular, enquanto o HC diminuiu a sobrevivência celular significativamente (p<0,05). Nenhum material experimental causou aumento de níveis de ROS significativamente (p>0,05). O Vitrebond aumentou os níveis de ROS em até 7 vezes (p<0,05).

Perfil de atividade da proteína tirosina fosfatase de baixa massa molecular relativa e da fosfatase ácida resistente ao tartarato em osteoblastos humanos durante o ciclo e diferenciação celular / Low molecular weight protein tyrosine phosphatase and tartrate resistant acide phosphatase activity in human osteoblasts during cell cycle and differentiation

O objetivo deste trabalho foi determinar o perfil de atividade enzimática da proteína tirosina fosfatase de baixa massa molecular relativa (PTPBMr) e da fosfatase ácida resistente ao tartarato (TRAP) em osteoblastos humanos durante o ciclo e a diferenciação celular, correlacionando com os níveis de estresse oxidativo intracelulares. A atividade enzimática das fosfatases foi determinada nos períodos de 6, 18, 24, 48 e 72 horas (ciclo celular) e 7, 14, 21, 28 e 35 dias (diferenciação) utilizando o p-nitrofenilfosfato e na presença do inibidor específico phidroximercuribenzoato (pHMB) para a PTP-BMr, e na presença de tartarato e pHMB para a TRAP. A caracterização da diferenciação celular foi determinada medindo o nível de atividade da fosfatase alcalina e a coloração de Von Kossa. O estresse oxidativo foi determinado através da quantificação da glutationa reduzida e oxidada através dos ensaios de cromatografia líquida de alta performance eletroquímica e DTNB. Durante o ciclo celular a atividade específica (AE) da fosfatases foi fortemente diminuída, especificamente da TRAP e PTP-BMr, sendo praticamente zero após 18 horas da adição de soro, sugerindo que a diminuição na atividade destas enzimas seja necessária para a entrada na fase S. Durante a diferenciação celular observou-se um aumento progressivo da expressão de FALC, TRAP e PTP-BMr nos períodos de 7 e 14 dias, sendo máxima no 21o dia, declinando a seguir. Durante a proliferação, os estados mais reduzidos foram observados nos períodos de 18 e 48 horas e durante a diferenciação o estado mais reduzido foi observado no 21o dia. Desta forma, o presente trabalho mostra que as células da linhagem hFOB 1.19 representam um adequado modelo de estudo para análise da participação de fosfatase no ciclo e diferenciação celular, bem como que as atividades da PTP-BMr e TRAP são claramente moduladas durante o ciclo celular e a diferenciação de osteoblastos humanos, esta última dependente de adequado nível de glutationa reduzida

Papel da proteína tirosina fosfatase de baixa massa molecular relativa (LMW-PTP) no controle da proliferaçäo celular e na origem de neoplasias / Involvement of low molecular weight protein tyrosine phosphatase in cell transformation

A fosfotirosina proteina fosfatase de baixa massa molecular relativa (LMW-PTP) é uma fosfohidrolase de distribuiçäo ubíqua na natureza, presente nas células como duas isoenzimas (IF1 e IF2), as quais säo codificadas por três alelos. Estas isoenzimas diferem entre si na regiäo compreendida entre os resíduos de aminoácido de 40-73, exibindo diferentes afinidades pelo substrato, sensibilidade a moduladores e inibidores. A IF2 está envolvida na mitogênese e rearranjo do citoesqueleto induzido pelo fator de crescimento derivado de plaquetas (PDGF). Em fibroblastos normais, o aumento da IF2 resulta em decréscimo na taxa de proliferaçäo celular. Neste trabalho realizamos a clonagem e expressäo da IF2. O RNA total extraído de pâncreas humano foi usado para RT-PCR com "primers" oligo-dT. O fragmento da LMW-PTP foi amplificado utilizando os "primers" 5'-GAAATGCAGGATCCTCAGG-3' e 5'-GGACCATGGCGGAACAGGCTACCAAGTCCG-3' e clonado no vetor pUC18. A seqüência da IF2 foi confirmada pelo seqüênciamento automático de DNA (Sistema ABI). A LMW-PTP foi sub-clonada no vetor pRSET B (sem cauda de Histidina) e usado para transformar bactérias BL21 DE3 para produçäo em larga escala. A expressäo da IF2 foi induzida por IPTG, sendo as colônias positivas confirmadas por PCR, SDS-PAGE e atividade enzimática. A fim de avaliar o papel da LMW-PTP na reversäo fenotípica tumoral-normal e na transformaçäo maligna induzida por oncogenes foram utilizados os sistemas: 1) as linhagens celulares C6/ST1 e C6/P7 derivadas de glioma de rato quimicamente induzido, sendo a variante ST1 sensível e a P7 resistente a glucocorticóides (GC); 2) linhagens celulares expressando oncoproteinas do vírus polioma (antígenos "middle" e "large" T), mutadas ou näo. A atividade enzimática foi determinada em pH 5,0 usando o p-nitrofenil fosfato como substrato ('37 graus C', 20 min), nas seguintes condiçöes: a) ausência de inibidores (fosfatase ácida total, FAT);...