Expression of grape class IV chitinase in Spodoptera frugiperda (Sf9) insect cells

INTRODUCTION: Most of pathogenesis related (PR) proteins possess complicated structures; hence their active recombinant forms are usually produced in eukaryotic systems. In this study, we employed an insect cell line to express a recombinant form of a previously identified grape PR3 allergen categorised as class IV chitinase. METHODS: Grape chitinase cDNA was amplified by RT-PCR and inserted into pFastBacHTA using restriction enzymes. The recombinant pFastBacHTA was applied for the transformation of Escherichia coli DH10Bac cells. The purified recombinant bacmid was used for transfection of Sf9 cells. Finally, the IgE-immunoreactivity of purified recombinant protein was evaluated using grape allergic patient's sera. Moreover, polyclonal anti-6His-tag and monoclonal anti-chitinase antibodies were used for further assessment of recombinant protein. RESULTS: SDS-PAGE analysis of the transfected Sf9 cells showed expression of a monomeric 25 kDa and a dimeric 50 kDa recombinant protein. Western blotting revealed considerable IgE reactivity of the recombinant protein with grape allergic patients' sera. Furthermore, confirmatory assays showed specific reactivity of the recombinant protein with anti-His tag and anti-chitinase antibodies. CONCLUSION: This study showed that, in contrast to E. coli, insect cells are suitable hosts for the production of a soluble and IgE-reactive recombinant form of grape class IV chitinase. This recombinant allergen could be used for component resolved diagnosis of grape allergy or other immunodiagnostic purposes

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Detección de alérgenos de cacahuete mediante un sensor de ADN / Detection of peanut allergens by a DNA sensor

En el presente trabajo se propone un genosensor electroquímico para la detección de un segmento de ADN que codifica parte de la proteína alergénica Ara h 2 del cacahuete. El genosensor se basa en un ensayo tipo sándwich, el analito hibrida con dos secuencias de bases, una de ellas inmovilizada sobre un electrodo de oro serigrafiado, formando una monocapa autoensamblada. La optimización del dispositivo se realizó utilizando la metodología de Superficies de Respuesta. La máxima respuesta se encontró para concentraciones de sonda de captura y agente bloqueante, 1 mM y 2,5 mM respectivamente

In the present work an electrochemical genosensor for detecting a DNA segment encoding part of the allergenic protein peanut Ara h 2 is proposed. Genosensors is based on a sandwich assay format, the analyte hybridized with two base sequences, one immobilized onto a screen printed gold electrode, forming a self-assembled monolayer. The optimization of the device was performed using Response Surface Methodology. The maximum response was found to be 1 µM of capture probe concentration and 2,5 mM of blocking agent concentration

Role of acetosyringone in the accumulation of a set of RNAs in the arbuscular mycorrhiza fungus Glomus intraradices

Plant root exudates contain a range of low molecular weight metabolites that trigger many of the structural and physiological changes associated with the progression and establishment of mycorrhizal symbiosis. Here, the physiological response triggered by acetosyringone (AS) was studied in Glomus intraradices. Incubation of G. intraradices spores with AS resulted in an overall increase in hyphal respiration. A G. intraradices cDNA library was then screened with a total cDNA probe obtained from the AS-treated spores and mycelium. cDNAs from genes induced in AS-treated G. intraradices were assigned to different functional categories, such as protein synthesis, membrane transport, signal transduction, and general metabolism, but without further information regarding their function or identity. A cDNA coding a fragment of a histidine kinase was also induced by AS, suggesting a two-component mediated response to the metabolite. In addition, the differential accumulation of a cruciform DNA-binding protein mRNA, termed as GiBP1, was also observed. Time-course experiments demonstrated the rapid accumulation of GiBP1 within 2 h of AS induction. These results indicate the presence of a set of fungal genes that are induced by AS. These findings are discussed in terms of the possible molecular events that follow the exchange of signals between mycorrhizal symbionts (AU)

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Yeast on drugs: saccharomyces cerevisiae as a tool for anticancer drug research

The budding yeast Saccharomyces cerevisiae is being widely used as a model for investigating fundamental processes relevant to all living organisms. Many of these processes are affected by genetic and epigenetic alterations in cancer such as cell cycle progression, DNA replication and segregation, maintenance of genomic integrity and stress responses. Therefore, yeast emerges as an attractive model for anticancer drug research. The genetic tractability of budding yeast, its ease of manipulation and the wealth of functional genomics tools available in this organism makes it ideal for genome-wide analysis of biological functions and chemical screenings. The present review will discuss some of the innovative advantages based on yeast genetics and genomics for antitumour drug target identification and drug discovery (AU)

Valoración prospectiva del test de tolerancia hiperbárica en el diagnóstico de hipertensión gestacional y preeclampsia / Prospective evaluation of the tolerance-hyperbaric test for the diagnosis of gestational hypertension and preeclampsia

FUNDAMENTO Y OBJETIVO: Estudios recientes han tratado de superar los pobres resultados obtenidos a partir de medidas clínicas de presión arterial en la detección de preeclampsia a través de la utilización de monitorización ambulatoria. La baja sensibilidad de la media diaria de la presión arterial ha llevado a concluir que la monitorización ambulatoria no tiene utilidad en obstetricia. Por ello, hemos valorado prospectivamente la sensibilidad y especificidad en el diagnóstico de hipertensión gestacional del test de tolerancia hiperbárica, prueba basada en la construcción de un intervalo de tolerancia para la variación circadiana de la presión arterial en función de la edad gestacional, así como en el cálculo del índice hiperbárico, área de exceso de presión arterial por encima del límite superior de tolerancia.PACIENTES Y MÉTODO: Se estudió a 328 gestantes que proporcionaron 2.014 series de presión arterial monitorizadas automáticamente durante 48 h cada 4 semanas desde la primera visita obstétrica hasta el parto. El índice hiperbárico de cada serie de presión arterial se calculó con respecto a unos límites de tolerancia establecidos previamente a partir de 497 series de monitorización ambulatoria en una muestra independiente de 189 gestantes normotensas.RESULTADOS: La sensibilidad en la identificación de hipertensión gestacional y preeclampsia del índice hiperbárico fue del 91 por ciento en el primer trimestre, para aumentar hasta el 99 por ciento en el tercer trimestre de gestación. La especificidad fue superior al 99 por ciento en todos los trimestres. Los valores predictivos positivo y negativo fueron superiores al 96 por ciento en todos los trimestres. Por otra parte, el cálculo del índice hiperbárico proporcionó, en promedio, una identificación temprana de complicaciones hipertensivas en el embarazo 23 semanas antes de la confirmación clínica de la enfermedad.CONCLUSIONES: El test de tolerancia hiperbárica representa una prueba reproducible, no invasiva y de alta sensibilidad para la identificación precoz de las gestantes que desarrollarán complicaciones hipertensivas a lo largo de su embarazo, y también puede utilizarse para indicar la necesidad de establecer medidas preventivas o terapéuticas (AU)

Resistencia genotípica del virus de la inmunodeficiencia humana tipo 1 en pacientes con fracaso terapéutico / Genotypic resistance of human immunodeficiency virus type 1 in patients with therapeutic failure

FUNDAMENTO Y OBJETIVO: El objetivo del presente estudio es analizar tanto la frecuencia y secuencia de aparición de resistencias a los distintos tipos de antirretrovirales como la implicación en éstas de las principales mutaciones asociadas a resistencia en un grupo de pacientes infectados por el virus de la inmunodeficiencia humana tipo 1 en los que el tratamiento antirretroviral parece haber fracasado. PACIENTES Y MÉTODO: Se examinaron las secuencias de la proteasa y de la retrotranscriptasa del virus de la inmunodeficiencia humana tipo 1 aislado de muestras de plasma sanguíneo en un total de 284 pacientes. La carga viral de las muestras debía estar comprendida entre 500 y 106 copias/ml. La genotipificación se realizó con el sistema TrugeneTM HIV-1, que se basa en la síntesis de ADNc mediante reacción en cadena de la polimerasa previa transcripción inversa y posterior secuenciación de este ADNc mediante reacción en cadena de la polimerasa. RESULTADOS: El 39,78 por ciento de los pacientes estaban siendo tratados eficazmente, es decir, no tenían mutaciones que confiriesen resistencia a ninguno de los antirretrovirales usados en el tratamiento, incluidos 73 pacientes que no presentaban ninguna mutación relacionada con resistencia genotípica a algún tipo de antirretroviral, mientras que el 60,2 por ciento de los pacientes presentaba mutaciones que conferían resistencia a alguno de los antirretrovirales del tratamiento. En los pacientes en seguimiento, el 88,2 por ciento presentó resistencia a algún antirretroviral y el 53 por ciento presentó resistencia genotípica o posible resistencia a algún fármaco del tratamiento antirretroviral de gran actividad que recibía. CONCLUSIONES: La prevalencia de mutaciones de resistencia en pacientes con fracaso terapéutico es mayor del 50 por ciento con ambos genes (AU)

Estudio molecular de los genes BRCA1 y BRCA2 en 153 familias con cáncer de mama de Castilla y León (España): identificación de nueve variantes de efecto desconocido no descritas / Molecular study of the BRCA1 and BRCA2 genes in 153 breast cancer families from Castilla y León (Spain): new nine unclassified variants identified

FUNDAMENTO: El cáncer de mama hereditario representa un 5-10 por ciento de todos los cánceres de mama. En la actualidad dos genes están asociados a la enfermedad, el BRCA1 y el BRCA2. Se sabe que mutaciones en estos genes aumentan el riesgo de padecer cáncer de mama hasta en un 80 por ciento en las portadoras. El objetivo de este estudio es la detección y caracterización de mutaciones en estos genes, en pacientes con cáncer de mama seleccionadas según criterios de moderado-alto riesgo pertenecientes a la Comunidad Autónoma de Castilla y León. PACIENTES Y MÉTODO: Se analizaron 207 muestras seleccionadas pertenecientes a 153 familias. Se realizó extracción de ADN de sangre periférica y para la detección de mutaciones se emplearon técnicas de PCR múltiplex-heterodúplex-CSGE y secuenciación. RESULTADOS: Se detectaron 45 cambios nucleotídicos distintos (23 en BRCA1 y 22 en BRCA2) en 74 familias (48,4 por ciento del total), que corresponden a 13 polimorfismos (29 familias), 19 variantes de efecto desconocido (26 familias), de las que 9 son descritas por primera vez en este trabajo, y 13 patológicas (19 familias; 12,42 por ciento de las familias). De las mutaciones patológicas, 8 (42,1 por ciento) afectan a BRCA1 y 11 (57,9 por ciento) a BRCA2. La mutación más frecuente es la 3036delACAA de BRCA2, presente en 4 familias no relacionadas. CONCLUSIONES: El alto porcentaje de mutaciones, polimorfismos y variantes de efecto desconocido detectado revela la alta resolución del método de análisis mutacional utilizado, así como la validez de los criterios de selección aplicados. Existe un gran número de variantes de significado desconocido cuyo papel en la enfermedad debe ser clarificado mediante diferentes tipos de estudios, entre los que se incluye su tipificación en poblaciones control. (AU)

Prueba de hipoglucemia insulínica en la exploración del eje hipotálamo-hipófisis-suprarrenal / Hypoglycemia insulin test in the assessment of the hypothalamic-pituitary-adrenal function

FUNDAMENTO: Los recientes avances en la sensibilidad y especificidad de los inmunoanálisis hormonales y su progresiva automatización han introducido cambios en los laboratorios clínicos que obligan a replantear la necesidad de algunas pruebas funcionales endocrinas. El objetivo de este trabajo es determinar las concentraciones basales de cortisol que predicen una respuesta normal o patológica a la prueba de hipoglucemia insulínica (ITT).SUJETOS Y MÉTODO: En un estudio retrospectivo hemos analizado la respuesta de cortisol a la ITT en 320 pacientes. Asimismo se ha analizado, mediante cálculo de unidades relativas de valor (URV), el impacto en el coste económico del uso de una nueva estrategia. RESULTADOS: Ningún paciente con cortisol basal inferior a 6 µg/dl (13 por ciento) respondió a la prueba y aquellos con un cortisol basal mayor de 18 µg/dl respondieron en su totalidad (30 por ciento). Los restantes pacientes presentaron cortisol basal entre 6-18 µg/dl, de ellos el 39 por ciento respondió y el 16 por ciento no lo hizo. Se observó una buena correlación entre el cortisol basal y el pico de respuesta (r = 0,74; p < 0,0001). El coste de una ITT es de 131,6 URV frente a 17,8 URV del de cortisol. CONCLUSIONES: Las concentraciones de cortisol basal inferiores a 6 µg/dl o superiores a 18 µg/dl hacen innecesaria la prueba de hipoglucemia insulínica. La medida de cortisol mediante métodos automatizados, con la consiguiente disminución del tiempo de respuesta, permite aplicar nuevas estrategias diagnósticas. Considerando que el coste económico de una ITT es 15 veces superior al de una determinación de cortisol, el ahorro que se puede generar es elevado. (AU)