Utilización de diferentes técnicas de biología molecular integradas en un algoritmo de identificación de micobacterias no tuberculosas / Use of different PCR-based techniques integrated into a non-tuberculous identification algorithm

Introducción El objetivo del presente trabajo fue demostrar la utilidad de un algoritmo de identificación de micobacterias no tuberculosas (MNT) que integra diferentes técnicas de biología molecular y características fenotípicas básicas. Además se ha realizado una actualización del algoritmo de interpretación del análisis del patrón de restrición de hsp65 (PRA hsp65).Métodos La manera elegida de trabajar consistió en la identificación mediante hibridación con sondas de ADN seguido de PRA hsp65 en aquellos aislados que no pudieron ser identificados mediante hibridación con sondas de ADN. En caso necesario se realizó secuenciación del 16S rDNA y hsp65.ResultadosSe aislaron 236 MNT. De ellos, 102 (43,2%) aislados fueron identificados mediante hibridación con sondas de ADN y 76 (32,2%) mediante PRA hsp65. En los 58 (24,5%) aislados restantes se secuenció 16S rDNA, lo cual permitió la identificación de 53 (22,4%). Para 5 (2,1%) aislados se secuenció hsp65 y permitió la identificación de un aislado más. Cuatro (1,7%) aislados no pudieron ser identificados. Tres nuevos patrones de PRA hsp65 fueron encontrados. Siete aislamientos hibridaron con la sonda AccuProbe Mycobacterium avium complex Identification pero no lo hicieron con las sondas específicas de especie incluidas en el MAC. Cinco y 2 aislados fueron identificados como M. intracellulare y Mycobacterium colombiense, respectivamente. Conclusión Este esquema de trabajo nos permitió la identificación de casi todas las MNT encontradas en este estudio, incluyendo especies recientemente descritas(AU)

Introduction The aim of the present work was to demonstrate the utility of a non-tuberculous mycobacteria (NTM) identification algorithm, which integrates different PCR-based techniques and basic phenotypic features. Moreover, the algorithm for pattern restriction analysis of hsp65 (hsp65 PRA) interpretation has been updated. Methods The workflow chosen consisted of the identification by a DNA hybridization probe method, followed by PCR-restriction enzyme analysis of hsp65 (hsp65 PRA) in those isolates that cannot be identified by hybridization probes. If necessary, 16S rRNA gene and hsp65 gene sequencing were used for speciation. Results A total of 236 NTM were collected, in which 102 (43.2%) isolates were identified by DNA specific probes and 76 (32.2%) isolates were identified with hsp65 PRA. Partial sequencing of the 16S rRNA gene was used for species identification of the remaining 58 (24.5%) isolates. Fifty-three (22.4%) were identified using this method. Five isolates (2.1%) were submitted for partial sequencing of hsp65 gene and one isolate was identified with this method. Four strains (1.7%) could not be identified at species level. Three new PRA patterns were found. Seven isolates tested positive with the AccuProbe Mycobacterium avium complex identification test but did not test positive with the M. avium or Mycobacterium intracellulare specific probes. Five and two of these isolates were identified as M. intracellulare and Mycobacterium colombiense, respectively. Conclusion This approach allowed us to identify almost all NTM isolates found in this study, including some recently described species(AU)

Bacteriemias por Escherichia coli productor de betalactamasas de espectro extendido (BLEE): significación clínica y perspectivas actuales / Bacteraemia due to Escherichia coli producing extended-spectrum beta-lactamases (ESBL): clinical relevance and today’s’ insights

La resistencia bacteriana es un problema antiguo pero de gran actualidad, ya que en un marco de “austeridad” en cuanto al número de nuevas moléculas de antibiótico disponibles en el mercado, la presencia de microorganismos multirresistentes es cada vez más frecuente. E. coli es el microorganismo más frecuentemente implicado en bacteriemias nosocomiales y comunitarias, y el aislamiento de cepas productoras de BLEE se sitúa en torno al 10% en nuestro país. Las infecciones por E. coli con BLEE han experimentado importantes cambios epidemiológicos en los últimos tiempos y actualmente la atención se centra en el aumento de infecciones y colonizaciones en pacientes procedentes de la comunidad, sobre todo en relación con instituciones sanitarias, y la mayor incidencia de las CTX-M frente a otros tipos de BLEE. El papel de estas enzimas como factor de virulencia que aumente por sí mismo la mortalidad en los pacientes con bacteriemia por E. coli no queda claro. La principal repercusión clínica de las BLEE parece ser la mayor frecuencia con la que estos pacientes con infecciones graves reciben un tratamiento empírico inadecuado, de ahí la importancia de identificar qué factores predicen la presencia de una cepa con BLEE para poder ofrecer un tratamiento adecuado lo antes posible. En cuanto a las medidas de control de la diseminación de BLEE, la eficacia del aislamiento de contacto y la actuación frente a pacientes colonizados por E. coli con BLEE no están claras, pero es incuestionable la necesidad de implementar un uso correcto y responsable de los antibióticos para evitar la expansión de cepas resistentes(AU)

Antibiotic resistance is an old problem with new face as the rate of infections due to multidrug resistant bacteria is higher everyday and the number of new antibiotics to overwhelm the problem is becoming smaller. E. coli is the most frequent agent causing nosocomial or community-acquired bacteraemia being in our country 10% of them extended-spectrum betalactamases (ESBL) producing E. coli isolates. Nowadays the number of community- acquired or health-related infections caused by these ESBL producing E. coli is increasing. CTX-M has also become the most frequent ESBL compared to other enzymes. The role of these enzymes as a virulence factor increasing mortality in patients with bacteraemia due to E. coli is not well defined. The relevance of ESBL- E. coli seems to be related with the higher frequency of inadequate treatment and therefore the importance of identifying factors or features that might predict that the patient’s infection is due to one of these isolates. In terms of prevention and control of infection measures, the role of patient’s isolation is not clear but a proper prescription of antibiotics and antibiotic control policies are probably important to reduce the problem(AU)

Utilidad diagnóstica de la detección de ácidos nucleicos mediante la reacción en cadena de la polimerasa realizada en tiempo real / Diagnostic utility of nucleic acid detection by real-time polymerase chain reaction

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A new set of DNA macrochips for the yeast Saccharomyces cerevisiae: features and uses / Nuevos macrochips para el genoma completo de la levadura Saccharomyces cerevisiae: características y usos

The yeast Saccharomyces cerevisiae has been widely used for the implementation of DNA chip technologies. For this reason and due to the extensive use of this organism for basic and applied studies, yeast DNA chips are being used by many laboratories for expression or genomic analyses. While membrane arrays (macroarrays) offer several advantages, for many laboratories they are not affordable. Here we report that a cluster of four Spanish molecular-biology yeast laboratories, with relatively small budgets, have developed a complete set of probes for the genome of S. cerevisiae. These have been used to produce a new type of macroarray on a nylon surface. The macroarrays have been evaluated and protocols for their use have been optimized (AU)

La levadura Saccharomyces cerevisiae ha sido muy utilizada para el desarrollo de las tecnologías de chips de DNA. Por ese motivo, y porque es un organismo muy utilizado en investigación básica y aplicada, hay muchos laboratorios que usan chips de DNA para estudios genómicos o de expresión. Aunque el uso de macrochips en membrana presenta varias ventajas, su precio los pone fuera del alcance de muchos laboratorios. Aquí mostramos que un grupo de cuatro laboratorios españoles de biología molecular de levaduras ha desarrollado, con presupuestos relativamente bajos, un lote completo de sondas del genoma de S. cerevisiae, que se han usado para fabricar un nuevo tipo de macrochips sobre superficie de nailon. Se han evaluado estos macrochips y se han optimizado los protocolos para su uso (AU)

Reacción en cadena de la polimerasa (PCR) a tiempo real / Real time PCR

Hoy en día, la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) se utiliza normalmente en la rutina asistencial de la mayoría de nuestros laboratorios, pero su empleo se ha limitado, con pocas excepciones, al campo de la virología y en especial a un reducido grupo de virus con gran interés económico, para los que se dispone de ensayos comerciales bien estandarizados. Por diversas razones, la PCR convencional se ha implementado poco en el diagnóstico de otras muchas enfermedades infecciosas a pesar de aportar indudables ventajas. La PCR a tiempo real combinada con los nuevos sistemas automáticos para la purificación de ácidos nucleicos, ofrece una plataforma ideal para el desarrollo de una gran variedad de pruebas moleculares para la identificación y cuantificación de los agentes infecciosos de interés clínico. Debido a sus indudables ventajas, como la facilidad de empleo, la mayor rapidez o el menor riesgo de contaminación, la PCR a tiempo real, irá reemplazando la PCR convencional y se extenderá a un amplio abanico de aplicaciones microbiológicas (AU)

Conjugative plasmid pEJH501-mediated inducible nickel resistance in Hafnia alvei 5-5 / Resistencia al níquel en Hafnia alvei 5-5 mediada por el plásmido conjugativo pEJH501

Hafnia alvei 5-5, isolated from a soil-litter mixture underneath the canopy of the nickel-hyperaccumulating tree Sebertia acuminata (Sapotaceae) in New Caledonia, was found to be resistant to 30 mM Ni(2+) or 2 mM Co(2+). The 70-kb plasmid, pEJH 501, was transferred by conjugation to Escherichia coli, Serratia marcescens, and Klebsiella oxytoca. Transconjugant strains expressed inducible nickel resistance to between 5 and 17 mM Ni(2+), and cobalt resistance to 2 mM Co(2+). A 4.8-kb Sal- EcoRI fragment containing the nickel resistance determinant was subcloned, and the hybrid plasmid was found to confer a moderate level of resistance to nickel (7 mM Ni(2+)) even to E. coli. The expression of nickel resistance was inducible by exposure to nickel chloride at a concentration as low as 0.5 mM Ni(2+). By random Tn phoA'-1 insertion mutagenesis, the fragment was shown to have structural genes as well as regulatory regions for nickel resistance. Southern hybridization studies showed that the nickel-resistance determinant from pEJH501 of H. alvei 5-5 was homologous to that of pTOM9 from Alcaligenes xylosoxydans 31A (AU)

Hafnia alvei 5-5, aislada en un vertedero bajo la copa del árbol hiperacumulante de níquel Sebertia acuminata (Sapoteacea) en Nueva Caledonia, resultó ser resistente a 30 mM Ni2+ y 2 mM Co2+. El plásmido de 70 kilopares de bases (kb), pEJH501 se transfirió por conjugación a Escherichia coli, Serratia marcescens y Klebsiella oxytoca. Las cepas transconjugantes expresaron resistencia inducible a entre 5 y 17 mM Ni2+, y a 2 mM Co2+. Se subclonó un fragmento Sal-EcoRI que contenía el determinante de resistencia al níquel, y el plásmido híbrido se descubrió que confería un nivel de resistencia moderado al níquel (7 mM Ni2+), incluso en E. coli. La expresión de la resistencia al níquel era inducible por exposición a concentraciones de cloruro de níquel de como mínimo 0,5 mM Ni2+. Mediante mutagénesis por inserción aleatoria de TnphoA'-1, se encontraron en el fragmento tanto genes estructurales como regiones reguladoras para la resistencia al níquel. Estudios de hibridación southern mostraron que el determinante de la resistencia al níquel del plásmido pEJH501 en H. alvei 5-5 era homólogo al de pTOM9 de Alcaligenes xylosoxydans 31A (AU)

Caracterización clínica de una familia numerosacon enfermedad vascular cerebral hereditaria en Colombia / Clinical characterization of hereditary cerebrovascular disease in a large family from colombia

Introducción. La arteriopatía cerebral autosómica dominante con infartos subcorticales y leucoencefalopatía (CADASIL) es causada por una mutación en el gen Notch3, cromosoma 19p13.1, y se caracteriza por alteración de las arterias cerebrales pequeñas. La presentación clínica consiste en migraña, infartos cerebrales recurrentes, cambios de comportamiento y demencia. Objetivo. Describir el fenotipo clínico de una familia colombiana con diagnóstico probable de CADASIL. Pacientes y métodos. Elaboramos una genealogía con 268 individuos, evaluación neurológica a 57 individuos y resonancia magnética craneal (RMN) a 25 de ellos. Resultados. El análisis clínico apoya fuertemente el diagnóstico de CADASIL ya que 12 individuos presentaron trombosis cerebral (TC) de repetición, que en cinco de ellos conllevó demencia subcortical. Dos pacientes presentaban demencia sin historia previa de TC. Todos los afectados por TC o demencia a los que se realizó RMN (nueve casos) tienen hiperintensidades de la sustancia blanca e infartos subcorticales. Otros siete individuos presentan anomalías típicas de CADASIL en la RMN, de los cuales cuatro son asintomáticos, uno tuvo episodios de isquemia cerebral transitoria y dos padecen migraña. Otros 22 pacientes presentan sólo migraña. Llama la atención la alta frecuencia de lesión del cuerpo calloso, encontrada en cinco individuos con TC o demencia, el paciente con isquemia cerebral transitoria y uno de los asintomáticos; además, resaltamos la presencia de hipoacusia en siete individuos con TC o demencia. Conclusiones. Describimos una familia con enfermedad vascular cerebral hereditaria caracterizada por episodios de TC, demencia vascular precoz, hipoacusia, migraña y leucoencefalopatía, infartos subcorticales y alteraciones del cuerpo calloso evidenciadas en la RMN. El análisis clínico apoya fuertemente el diagnóstico de CADASIL (AU)

Identificación de micobacterias mediante métodos de biología molecular / Identification of mycobacteria by molecular biology methos

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Análisis del patrón de fragmentación del ADN en enfermedades neuromusculares pediátricas / The pattern of DNA fragmentation in pediatric neuromuscular disorders

Introducción. La demostración de la presencia de muerte celular apoptótica en el músculo esquelético en desarrollo de diversas especies y su incriminación en la patogenia de la degeneración muscular que sufre el ratón mdx, deficiente en distrofina, han despertado un creciente interés por el posible papel de la apoptosis en las enfermedades neuromusculares humanas. Los contados estudios que han abordado esta cuestión ofrecen resultados contradictorios. Objetivo. Analizar la presencia de apoptosis en diferentes enfermedades neuromusculares de inicio en la edad pediátrica. Pacientes y métodos. Identificación de células con morfología apoptótica, detección in situ de la fragmentación del ADN (método TUNEL) y análisis del patrón de fragmentación del ADN mediante electroforesis y Southern blot en biopsias de 29 pacientes de edad pediátrica afectos de diversas enfermedades neuromusculares y en tres controles normales. Resultados. No se hallaron rasgos morfológicos de apoptosis en las muestras estudiadas. El método TUNEL no marcó mionúcleos en ninguna patología, aunque algunos mastocitos resultaron TUNEL-positivos. Mediante electroforesis del ADN e hibridación del Southern blot no se detectó fragmentación oligonucleosomal del ADN en ninguna muestra, aunque se evidenció un patrón de fragmentación del ADN al azar (smearing) en tres pacientes afectos de distrofia muscular de Duchenne, uno de distrofia muscular de Becker y otro de atrofia muscular espinal infantil. Conclusiones. Los resultados obtenidos no apoyan la hipótesis de que la apoptosis participe en la patogenia de las enfermedades neuromusculares pediátricas, si bien no descartan que este u otro modo de muerte celular programada tenga lugar de modo excesivo y/o anacrónico en etapas de estas patologías distintas a las analizadas (AU)