Técnicas para el diagnóstico molecular de enfermedades hereditarias / Techniques for molecular diagnosis of hereditary diseases

El diagnóstico de muchas enfermedades hereditarias necesita una confirmación a nivel molecular del defecto genético que presenta el paciente. Una vez detectada la mutación y confirmado el diagnóstico clínico, podemos determinar cuál es el efecto de dicha mutación en la proteína codificada(cambio de conformación, alteración o pérdida defunción, localización errónea, disminución en su expresión, etc.), y así poder abrir puertas a nuevas terapias dirigidas al defecto específico. En esta revisión, primero consideraremos algunos conceptos básicos de genética molecular, incluyendo estructura y expresión del gen, intrones y exones, códigos genéticos, transcripción, traducción, procesamiento del RNA y mutaciones y sus tipos. También explicaremos algunos métodos para extraer DNA y RNA de sangre u otros tejidos del paciente. A continuación discutiremos los métodos que se emplean para detectar mutaciones en genes asociados a enfermedades hereditarias. El principio en el que se basa un ensayo de detección de mutaciones es que la secuencia de nucleótidos del gen de un individuo afecto será distinta de la secuencia de un individuo con fenotipo normal. Además, describiremos dos métodos para analizar el efecto de algunas mutaciones en la maduración del pre-mRNA (RT-PCR a partir de RNA de sangre y análisis de minigenes). Por último, mencionaremos algunos métodos informáticos que sirven para determinar si las mutaciones detectadas son patológicas o no, y para predecir el efecto de mutaciones en la maduración del pre-mRNA (AU)

The diagnoses of many hereditary diseases must be confirmed on a molecular level of a genetic defect that the patient has. Once the mutation is detected and the clinical diagnoses confirmed, we can determine which is the effect of said mutation in the coded protein (changing shape, alteration or loss of function, erroneous location, decrease of its expression, etc.) and just be able to open the doors to new therapies aimed at the specific defect. In this article, we first consider some basic concepts of molecular genetics, including the gene structure and expression, introns and exons, genetic codes, transcription, translation, RNA processing, and mutations and its types. We will also give some explanations of methods to extract DNA and RNA from the blood and other tissues of the patient. After that, we will discuss the methods used to detect mutations in genes associated to hereditary diseases. The principal on which a mutation detection trial is based is that this sequence of gene nucleotides of an individual affected will be different from the sequence of an individual with normal phenotype. In addition, we will describe two methods to analyze the effect of some mutations in the maturation of pre-mRNA(RT-PCR from RNA of the blood and analysis of minigenes). Finally, we will mention some computer methods that serve to determine if the mutations detected are pathological or not and to predict the effect of the mutations in the maturation of the pre-mRNA (AU)

Validación de la reacción en cadena de la polimerasa basada en generador universal de heterodúplex para la identificación de Mycobacterium tuberculosis resistente a rifampicina y multirresistente en Lima, Perú / Validation of the PCR-based universal heteroduplex generator assay for identification of rifampicin-resistant and multiresistant Mycobacterium tuberculosis in Lima, Peru

Objetivo. Validar el ensayo de reacción en cadena de la polimerasa basada en generador universal de heterodúplex (PCR UHG-Rif) para la identificación de Mycobacterium tuberculosis resistente a rifampicina y multirresistente (MDR, resistente a isoniazida y rifampicina) en pacientes con diagnóstico de tuberculosis pulmonar procedentes de comunidades de elevada incidencia de tuberculosis resistente en Lima, Perú. Diseño. Comparar la determinación de la sensibilidad a fármacos antituberculosos mediante el método de las proporciones y el PCR UHG-Rif a partir de muestras clínicas, y en función de eso, analizar la capacidad diagnóstica del ensayo de PCR UHG-Rif. Resultados. La concordancia en la identificación de la sensibilidad a fármacos antituberculosos fue 0,95 (k 5 0,899; p < 0,05) mostrando una sensibilidad y especificidad del 0,973 y 0,922 p < 0,05), respectivamente. El valor predictivo positivo fue 0,939 (IC 95%: 0,879-0,970) y el valor predictivo negativo fue 0,965 (IC 95%: 0,902-0,988). Sin embargo, la posibilidad de predicción de MDR fue 0,981 (p < 0,05). Este método permite la detección de poblaciones mixtas y las discordancias pueden explicarse por la presencia de mutaciones silenciosas y no incluidas en la región "caliente" del gen rpoB asociada a la resistencia a rifampicina. Conclusión. El ensayo de PCR UHG-Rif detectó mutaciones en el gen rpoB y mostraba sensibilidad y especificidad excelente y adecuados valores predictivos en comparación con el método estándar en la determinación de la sensibilidad a fármacos antituberculosos. Por lo tanto, este ensayo puede ser considerado como una excelente herramienta cuya aplicación contribuirá al control de la tuberculosis, identificando correcta y oportunamente a los pacientes infectados con bacilos resistentes y MDR, permitiendo la reducción de casos de tuberculosis y tuberculosis resistente (AU)

Objective. To validate the polymerase chain reaction-based universal heteroduplex generator (PCR UHG-Rif) assay for identifying rifampin-resistant and multidrug-resistant (MDR, resistant to isoniazid and rifampin) Mycobacterium tuberculosis in patients with pulmonary tuberculosis from communities in Lima (Peru) with a high incidence of resistant tuberculosis. Design. To compare the results of antituberculosis drug susceptibility testing in clinical samples performed by the proportion method with those obtained by the PCR UHG-Rif assay, with the aim of analyzing the diagnostic capability of PCR UHG-Rif. Results. Concordance for the identification of antituberculosis drug susceptibility was 0.95 (k 5 0.899; P < .05), with a sensitivity and specificity of 0.973 and 0.922 (P < .05), respectively. The positive predictive value was 0.939 (95% CI: 0.879-0.970) and the negative predictive value was 0.965 (95% CI: 0.902-0.988). Nevertheless, the probability for MDR prediction was 0.981 (P < .05). PCR UHG-Rif allows the detection of mixed populations; discordant results can be explained by the presence of point mutations, missense mutations and mutations outside the rpoB "hot" region associated with rifampin-resistance. Conclusions. The PCR UHG-Rif assay detects mutations in the rpoB gene with excellent sensitivity and specificity, and suitable predictive values when compared with the standard method for determining susceptibility to antituberculosis drugs. This test can be considered an excellent tool that can contribute to tuberculosis control by correctly identifying patients infected with resistant and MDR bacilli, leading to a reduction in the cases of tuberculosis and resistant tuberculosis (AU)