Natural infection and molecular detection of Cytauxzoon felis in a free-ranging Puma concolor in the state of Goiás, Brazil / Infecção natural e detecção molecular de Cytauxzoon felis em Puma concolor de vida livre no estado de Goiás, Brasil

The puma (Puma concolor Linnaeus, 1771), the most widely distributed felid species in the Americas, can be found in all Brazilian biomes. Nevertheless, few studies have focused on hemoparasites in this species. Cytauxzoon felis, a hemoparasite that can infect domestic cats, has also been described in wild felids in Brazil. To the best of our knowledge, this study is the first to diagnose the natural infection and molecular detection of C. felis in a P. concolor in the state of Goiás. This animal presented non-regenerative anemia and inclusion suggestive of piroplasmids within red blood cells. The amplified 551 bp fragment of partial Piroplasmida 18S rRNA gene sequence was 100% identical to corresponding sequences of C. felis available in GenBank. No specific treatment for cytauxzoonosis was administered, and after rehabilitation, the animal was reintroduced into the wild. This finding provides some evidence that P. concolor may act as a natural host of the parasite. The epidemiology, vector and pathogenicity of this hemoparasite in wild and domestic cats in Brazil deserves further investigation.

O puma (Puma concolor Linnaeus, 1771) tem a maior distribuição entre os felídeos das Américas e é encontrado em todos os biomas do Brasil. No entanto, poucos estudos têm se concentrado nos hemoparasitos nesta espécie. Cytauxzoon felis, um hemoparasito que pode infectar gatos domésticos, também foi descrito em felídeos selvagens no Brasil. A saber, este estudo é o primeiro diagnóstico de infecção natural e detecção molecular de C. felis em um P. concolor do estado de Goiás. Este animal apresentou anemia arregenerativa e inclusão de piroplasmídeos nos glóbulos vermelhos. A amplificação do fragmento de 551 pb da sequência parcial do gene Piroplasmorida 18S rRNA foi 100% idêntica a sequências correspondentes de C. felis disponíveis no GenBank. Nenhum tratamento específico para citauxzoonose foi administrado e, após a reabilitação, o animal foi reintroduzido na natureza. Essa descoberta fornece algumas evidências de que P. concolor pode atuar como um hospedeiro natural do parasito. A epidemiologia, vetor e patogenicidade deste hemoparasito em gatos selvagens e domésticos no Brasil merecem uma investigação mais aprofundada.

Serological and molecular detection of Theileria equi in horses from Sinop, Mato Grosso state, Brazil / Detecção sorológica e molecular de Theileria equi em equinos oriundos de Sinop, Mato Grosso, Brasil

Equine piroplasmosis is the most important tick-borne disease to affect horses in Brazil. Theileria equi is one of the causative agents of equine piroplasmosis. Chronic cases are expected, in which the animals show no apparent signs of infection and remain asymptomatic but constitute a source of the infectious agent that ticks can spread. This study was conducted across 81 ranches located in the municipality of Sinop, State of Mato Grosso, Brazil. A sample calculation was performed to estimate the apparent prevalence of T. equi among horses. A total of 1,853 animals were included in the sampling analysis based on the information available from the Institute of Agricultural and Livestock Defense of Mato Grosso State. The serological analysis of 367 serum samples using an indirect enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) to detect anti-T. equi antibodies revealed that 337 animals were positive, representing a frequency of 90.70%. The molecular analysis to amplify the EMA-1 gene showed positivity in 20 of 89 tested samples. The fragments of four samples were sequenced and analyzed to determine their similarities to sequences from other species, based on sequences deposited at GenBank. All showed 100% similarity with T. equi. Our study represents the first report of T. equi antibodies among the equids in north-central region of Mato Grosso, revealing the widespread distribution of seropositive animals.

A piroplasmose equina é a doença transmitida por carrapatos mais importante em cavalos no Brasil. Theileria equi é um dos agentes causadores da piroplasmose equina. São esperados casos crônicos, nos quais os animais não apresentam sinais aparentes de infecção e permanecem assintomáticos, mas constituem uma fonte de infecção e disseminação por carrapatos. Este estudo foi realizado em 81 fazendas localizadas no município de Sinop, Estado de Mato Grosso, Brasil. Um cálculo amostral foi realizado para estimar a prevalência aparente de T. equi entre cavalos. No total, 1.853 animais foram incluídos na análise amostral com base nas informações disponíveis no Instituto de Defesa Agropecuária do Estado de Mato Grosso. A análise sorológica de 367 amostras de soro por meio de ensaio imunoenzimático indireto (ELISA) para detecção de anticorpos anti-T. equi revelou que 337 animais eram positivos, representando uma frequência de 90,70%. A análise molecular para o gene EMA-1 mostrou positividade em 20 das 89 amostras testadas. Os fragmentos de quatro amostras foram sequenciados e analisados para determinar suas semelhanças com sequências de outras espécies, a partir das sequências depositadas no GenBank. Todos mostraram 100% de similaridade com T. equi. Nosso estudo representa o primeiro relato de anticorpos contra T. equi entre os equídeos na região centro norte de Mato Grosso, revelando a ampla distribuição de animais soropositivos.

Extracellular vesicles in infectious diseases caused by protozoan parasites in buffaloes

Extracellular vesicles (EVs) are small membrane-bound vesicles of growing interest in vetetinary parasitology. The aim of the present report was to provide the first isolation, quantification and protein characterization of EVs from buffalo (Bubalus bubalis) sera infected with Theileria spp. Methods: Infected animals were identified through optical microscopy and PCR. EVs were isolated from buffalo sera by size-exclusion chromatography and characterized using western blotting analysis, nanoparticle tracking analysis and transmission electron microscopy. Subsequently, the proteins from isolated vesicles were characterized by mass spectrometry. Results: EVs from buffalo sera have shown sizes in the 124-140 nm range and 306 proteins were characterized. The protein-protein interaction analysis has evidenced biological processes and molecular function associated with signal transduction, binding, regulation of metabolic processes, transport, catalytic activity and response to acute stress. Five proteins have been shown to be differentially expressed between the control group and that infected with Theileria spp., all acting in the oxidative stress pathway. Conclusions: EVs from buffaloes infected with Theileria spp. were successfully isolated and characterized. This is an advance in the knowledge of host-parasite relationship that contributes to the understanding of host immune response and theileriosis evasion mechanisms. These findings may pave the way for searching new EVs candidate-markers for a better production of safe biological products derived from buffaloes.(AU)

Molecular survey of tick-borne pathogens in small mammals from Brazilian Amazonia / Levantamento molecular de patógenos transmitidos por carrapatos em pequenos mamíferos da Amazônia brasileira

Abstract Small non-volant mammals (marsupials and small rodents) were captured at three different timepoints from 23 forest fragments across three municipalities (Alta Floresta, Sinop and Cláudia) covering the Amazonian biome of the Mato Grosso State in Midwestern Brazil. The animal tissues (liver and spleen) and blood were screened using molecular tools for the detection of Babesia, Coxiella, Cytauxzoon, Hepatozoon, Theileria, and Anaplasmataceae agents. A total of 230 specimens (78 rodents and 152 marsupials) were trapped. Hepatozoon and Piroplasmorida agents were detected in the common opossums (Didelphis marsupialis). In turn, all samples (blood, liver, or spleen) collected from the small mammals were negative for the genus Coxiella and the family Anaplasmataceae, as detected by polymerase chain reaction (PCR). Phylogenetic analyses inferred from partial sequences of the 18S rRNA gene highlighted the occurrence of new Hepatozoon and Piroplasmorida haplotypes. Future studies determining the role of common opossum (D. marsupialis) in the epidemiological cycles of Hepatozoon and Babesia under natural conditions in the Amazonian biome are necessary.

Resumo Pequenos mamíferos não voadores (marsupiais e pequenos roedores) foram capturados em três diferentes períodos, ao longo de 23 fragmentos florestais de três municípios (Alta Floresta, Sinop e Cláudia), localizados no bioma amazônico do Estado de Mato Grosso, no centro-oeste do Brasil. Os tecidos dos animais (fígado e baço) e sangue foram selecionados e submetidos a ensaios moleculares para a detecção do DNA de Babesia, Coxiella, Cytauxzoon, Hepatozoon, Theileria e agentes Anaplasmataceae. Um total de 230 espécimes (78 roedores e 152 marsupiais) foram capturados. Hepatozoon e agentes Piroplasmorida foram detectados em gambás (Didelphis marsupialis). Ao contrário, todas as amostras (sangue, fígado ou baço) coletadas dos pequenos mamíferos foram negativas para o gênero Coxiella e a família Anaplasmataceae, conforme detectado pela reação em cadeia da polimerase (PCR). Análises filogenéticas inferidas pelas sequências parciais do gene 18S rRNA evidenciaram a ocorrência de novos haplótipos de Hepatozoon e Piroplasmorida. Futuros estudos determinando a importância do gambá-comun (D. marsupialis) nos ciclos epidemiológicos de Hepatozoon e Babesia em condições naturais, no bioma amazônico, são necessários.

Theileria sp. in water buffaloes from Maranhão State, northeastern Brazil / Theileria sp. em búfalos do Estado do Maranhão, nordeste do Brasil

Abstract Anaplasma marginale and piroplasm species are widespread among Brazilian cattle herds. Both of these tick-borne pathogens hamper livestock production and cause a significant economic impact. Although buffaloes have demonstrated a high level of adaptability, data on tick-borne pathogens are scarcely reported in Brazil. Thus, the aim of this study was to screen water buffaloes from the state of Maranhão for piroplasm and A. marginale occurrence using PCR assays. All samples were negative for A. marginale. One of the 287 (0.35%) water buffaloes tested was positive for Theileria sp. Sequencing of the 18S rDNA fragment (356 bp) showed that the Theileria sp. identified was closely related to the T. buffeli /orientalis group. Future studies on the clinical signs of infection and the main vector in this country are needed.

Resumo Anaplasma marginale e espécies de piroplasma são amplamente distribuídas no rebanho bovino brasileiro. Ambos os patógenos transmitidos por carrapatos dificultam a produção pecuária e causam um impacto econômico significativo. Embora os búfalos tenham demonstrado um alto nível de adaptabilidade, dados sobre patógenos transmitidos por carrapatos são raramente relatados no Brasil. Assim, o objetivo deste estudo foi investigar búfalos do estado do Maranhão para piroplasmas e A. marginale utilizando-se a técnica da PCR. Todas as amostras foram negativas para A. marginale . Um dos 287 (0,35%) búfalos testados foi positivo para Theileria sp. O sequenciamento de um fragmento do gene 18S rDNA (356 pb) demonstrou que Theileria sp. identificado estava relacionada ao grupo T. buffeli/orientalis . Estudos futuros sobre os sinais clínicos de infecção e o principal vetor neste país são necessários.

Molecular survey and genetic diversity of piroplasmids in equids from Midwestern Brazil / Levantamento molecular e diversidade genética de piroplasmídeos em equídeos do Centro-Oeste do Brasil

Abstract We evaluated the distribution of piroplasmids in equids from the Mato Grosso state in Midwestern Brazil using molecular methods and the interspecific genetic diversity. For this, 1,624 blood samples of equids from 973 farms were examined by PCR, using primer pairs that amplify a fragment of the genes rap-1 and ema-1 of Babesia caballi and Theileria equi, respectively. For molecular characterization and phylogenetic studies, 13 and 60 sequences of the rap-1 and ema-1 genes, respectively, were used to build a dendogram using maximum parsimony. B. caballi and T. equi were detected in 4.11% and 28.16% of the farms, respectively, and molecular prevalence was 2.74% for B. caballi and 25.91% for T. equi. The location of the farms and animals raised in the Pantanal ecoregion influence the probability of equids testing positive for B. caballi and T. equi . Moreover, age and herd purpose were variables significantly associated with T . equi infection. The sequences of B. caballi presented 1.95% intraspecific variability, contrasting with 2.99% in T. equi. Dendrograms for both species demonstrated the presence of subgroups with high values of support of branches. However, it is not possible to associate these groups with geographic origin and/or ecoregion.

Resumo Foi avaliada a distribuição de piroplasmídeos em equídeos do Estado de Mato Grosso, no Centro-Oeste do Brasil, utilizando-se métodos moleculares e a diversidade genética interespecífica. Para isso, 1.624 amostras de sangue de equídeos de 973 fazendas foram examinadas pela PCR, usando pares de oligonucleotídeos que amplificam um fragmento dos genes rap-1and ema-1 de Babesia caballi e Theileria equi, respectivamente. Para caracterização molecular e estudos filogenéticos, foram utilizadas 13 e 60 sequências dos genes rap-1 e ema-1, respectivamente, para construção de um dendograma utilizando máxima parcimônia. B. caballi e T . equi foram detectados em 4,11% e 28,16% das fazendas, respectivamente, e a prevalência molecular foi de 2,74% para B. caballi e 25,91% para T. equi. A localização das fazendas e animais criados na ecorregião do Pantanal influenciam a probabilidade de equídeos serem positivos para B. caballi e T. equi. Além disso, idade e propósito do rebanho foram variáveis, significativamente, associadas à infecção por T. equi. As sequências de B . caballi apresentaram variabilidade intraespecífica de 1,95%, contrastando com 2,99% em T. equi. Dendrogramas para ambas as espécies demonstraram a presença de subgrupos com altos valores de sustentação dos ramos. No entanto, não é possível associar esses grupos com origem geográfica e/ou ecorregião.

Dynamics of humoral immune response in pregnant mares and foals vaccinated with Theileria equi recombinant EMA-2 / Dinâmica da resposta imune humoral em éguas gestantes e potros vacinados com EMA-2 recombinante de Theileria equi

Theileria equi is an infectious hemoprotozoan agent of equine piroplasmosis, a disease that has severe economic and sanitary impact internationally. In addition to its common clinical features, piroplasmosis can cause gestational losses and neonatal damage, which makes neonates susceptible to this disease. The aim of this study was to evaluate the dynamics of humoral immune response to recombinant EMA-2 of T. equi in pregnant mares and foals, as well as the transfer of vaccine antibodies through the colostrum ingested by sucking foals. For vaccine production, the EMA-2 expression gene was cloned and expressed in the yeast species, Pichia pastoris. Thirty-six horses were used, of which 18 were pregnant mares and 18 were foals. The mares were divided into control and vaccinated groups, and the vaccinated group received three doses of rEMA-2 every 21 days starting at 300 days of gestation. Foals from vaccinated and control groups were evaluated until the sixth month of life. The production of antibodies by foals on the rEMA-2 vaccination schedule was also evaluated from the second month of life. Foals in the vaccinated group had received three doses of the vaccine every 21 days. The method used to evaluate serum and colostrum samples was indirect ELISA, and plates were sensitized with the rEMA-2 protein. At the end of the vaccination schedule, vaccinated mares showed a 2.3-fold increase in antibody levels when compared to baseline values. The colostrum of vaccinated mares presented antibody levels of 1.0432±0.33. Foals delivered by vaccinated mares presented levels of antibodies greater than those of foals delivered by control mares after their first time sucking (at about twelve hours after birth). Foals vaccinated in the second month of life showed an 8.3-fold increase in antibody levels when compared to baseline values. The vaccination schedule with rEMA-2 was able to stimulate humoral immunity in pregnant mares. Vaccine immunoglobins were concentrated in the colostrum of vaccinated mares and foals delivered by these mares showed an increase in serum levels of vaccine antibodies after the first-time sucking.(AU)

Theileria equi é um hemoprotozoário, agente da piroplasmose equina, doença de impacto sanitário e econômico internacional. Em éguas gestantes além da doença clínica, podem ocorrer abortos e danos ao neonato, caracterizando grande susceptibilidade à doença no período neonatal. O objetivo deste estudo foi avaliar a dinâmica da resposta imune humoral à EMA-2 recombinante de T. equi em éguas gestantes e potros, bem como a transferência de anticorpos vacinais no colostro. Foram utilizados 36 equinos, sendo 18 éguas gestantes e 18 potros. As éguas foram divididas em grupo controle e vacinado, que receberam rEMA-2 a partir dos 300 dias de gestação em três doses com intervalos de 21 dias. Para produção da vacina, o gene de expressão de EMA-2 foi clonado e a proteína expressa em Pichia pastoris. Os potros provenientes de éguas dos grupos vacinado e controle foram avaliados até o 6º mês de vida. Avaliou-se também a produção de anticorpos em potros submetidos ao esquema vacinal com rEMA-2 a partir do 2º mês de vida, que receberam três doses da vacina em intervalos de 21 dias. O método escolhido para a avaliação das amostras de soro e colostro foi ELISA indireto, com sensibilização pela proteína rEMA-2. Nas éguas gestantes vacinadas com rEMA-2 ocorreu o incremento de 2,3 vezes o valor basal ao final do esquema vacinal. O colostro de éguas vacinadas apresentou título médio de anticorpos de 1,0432±0,33, e potros provenientes de éguas vacinadas apresentaram média maior que os provenientes de éguas controle após a primeira mamada (12 horas). Os potros que passaram por esquema vacinal a partir do 2º mês de vida obtiveram incremento de 8,3 vezes o valor basal de anticorpos. O esquema vacinal com rEMA-2 foi capaz de estimular a imunidade humoral em éguas gestantes. Éguas gestantes vacinadas concentraram imunoglobulinas vacinais no colostro, e os potros provenientes destas obtiveram incremento nos níveis séricos de anticorpos vacinais após a primeira mamada.(AU)

Molecular and serological detection of Theileria equi, Babesia caballi and Anaplasma phagocytophilum in horses and ticks in Maranhão, Brazil / Detecção molecular e serológica de Theileria equi, Babesia caballi e Anaplasma phagocytophilum em equinos e carrapatos no Maranhão

Equine piroplasmosis is a tick-borne disease caused by the intraeytrhocytic protozoans Babesia caballi and Theileria equi. It has been reported as a main equine parasitic disease. In addition, Anaplasma phagocytophilum, the causative agent of granulocytic ehrlichiosis, causes a seasonal disease in horses. Both diseases, can be detrimental to animal health. In this sense, blood samples and ticks were collected from 97 horses raised in the microregion of Baixada Maranhense, Maranhão State, Brazil. Serum samples were subjected to Indirect Fluorescence Antibody Test (IFAT) and blood samples and ticks to Polymerase Chain Reaction (PCR) to evaluate the infection by Theileria equi, Babesia caballi and Anaplasma phagocytophilum. The overall seroprevalence was 38.14%, 18.55% and 11.34% for T. equi, B. caballi and A. phagocytophilum, respectively. The results of PCR from blood samples showed 13.40% and 3.09% positive samples to T. equi and B. caballi, respectively. A total of 170 tick specimens were collected and identified as Dermacentor nitens, Amblyomma cajennense sensu lato and Rhipicephalus (Boophilus) microplus. It was detected 2.35% (4/170) and 0.59% (1/170) positive tick samples by PCR for T. equi and B. caballi, respectively. All samples were negative to A. phagocytophilum. No statically difference (p>0.05) was observed when gender, age, use of ectoparasiticide and tick presence were analyzed. A BLASTn analysis of the sequenced samples indicated 97 to 100% similarity with T. equi 18S rRNA gene sequences in GenBank and 98 to 100% with B. caballi. Genetic analysis classified the obtained sequences as T. equi and B. caballi cluster, respectively. It can be concluded that these pathogens occur and are circulating in the studied area.(AU)

A piroplasmose equina é uma doença transmitida por carrapatos causada pelos protozoários intraeritrocitários Babesia caballi e Theileria equi. É relatada como uma doença parasitária comum em equinos. Além disso, Anaplasma phagocytophilum, o agente causal da ehrlichiose granulocítica, causa uma doença sazonal em equinos. Ambas as doenças, podem ser prejudiciais para a saúde animal. Nesse sentido, amostras de sangue e carrapatos foram coletadas de 97 cavalos criados na microrregião da Baixada Maranhense, estado do Maranhão, Brasil. As amostras de soro foram submetidas ao Teste de Imunofluorescência Indireta (RIFI) e amostras de sangue e os carrapatos a Reação da Polimerase em Cadeia (PCR) para avaliar a infecção por Theileria equi, Babesia caballi e Anaplasma phagocytophilum. A prevalência foi de 38,14%, 18,55% e 11,34% para T. equi, B. caballi e A. phagocytophilum, respectivamente. Os resultados da PCR para as amostras de sangue demonstraram 13,40% e 3,09% de positividade para T. equi e B. caballi, respectivamente. Um total de 170 specimens de carrapatos foi coletado e foram identificados Dermacentor nitens, Amblyomma cajennense sensu lato and Rhipicephalus (Boophilus) microplus. Obteve-se 2,35% (4/170) e 0,59% (1/170) positivos por PCR para T. equi e B. caballi, respectivamente. Todas as amostras foram negativas para A. phagocytophilum. Não houve diferença estatística significativa (p>0.05) em relação ao sexo, idade, uso de ectoparasiticida e presença de carrapatos. A análise BLASTn das amostras sequenciadas para gene 18S rRNA indicaram 97 a 100% de similaridade com T. equi e 98-100% com B. caballi no GenBank. Análises genéticas classificaram as sequencias obtidas no mesmo clado que T. equi e B. caballi, respectivamente. Podemos concluir que estes patógenos estão circulando na área de estudo.(AU)

Genetic diversity of piroplasmids species in equids from island of São Luís, northeastern Brazil / Diversidade genética de espécies de piroplasmídeos em equídeos na ilha de São Luís, Nordeste do Brasil

Abstract Equine piroplasmosisis, a tick-borne disease caused by the intra-erythrocytic protozoans Babesia caballi and Theileria equi, has economic importance due to the international trade and the increased movement of horses all over the world. The goal of this study was to evaluate the occurrence of phylogenetic diversity of T. equi and B. caballi genotypes among infected equids from São Luís Island, state of Maranhão, northeastern Brazil. Between December of 2011 and June of 2012, EDTA-blood and serum samples were collected from 139 equids (90 donkeys, 39 horses and 10 mules). From 139 serum samples submitted to ELISA assay, IgG antibodies to T. equi and B. caballi were detected in 19.4% (27/139) and 25.2% (35/139), respectively. Among sampled animals, 21.6% (30/139) and 55.4% (77/139) were positive for cPCR assays for T. equi and B. caballi, based on ema-1 and rap-1 genes, respectively. Overall, the T. equi sequences (n=7) submitted to Maximum Likelihood analysis (based on a 18S rRNA fragment of 1700 bp after alignment) grouped into three main groups, which were subdivided in eight clusters. The present work showed that different genotypes of T. equi and B. caballi circulate among equids in Brazil.

Resumo A piroplasmose equina, uma doença transmitida por carrapatos e causada pelos protozoários intra-eritrocíticos Babesia caballi e Theileria equi, tem importância econômica devido ao comércio internacional e ao aumento do movimento de cavalos em todo o mundo. O objetivo do presente estudo foi mostrar a diversidade filogenética de T. equi e B. caballi infectando cavalos, burros e jumentos na Ilha de São Luís, Estado do Maranhão, Nordeste do Brasil. Entre dezembro de 2011 e junho de 2012, amostras de sangue com EDTA e soro de foram coletadas de 139 equídeos (90 jumentos, 39 cavalos e 10 burros). Dentre as 139 amostras de soro submetidas ao ensaio de ELISA, foram detectados anticorpos IgG contra T. equi e B. caballi em 19,4% (27/139) e 25,2% (35/139), respectivamente. Entre os animais amostrados, 21,6% (30/139) e 55,4% (77/139) foram positivos por meio dos ensaios de cPCR para T. equi e B. caballi, com base nos genes ema-1 e rap-1, respectivamente. No geral, as sequências T. equi (n = 7) submetidas à análise de Máxima Verossimilhança (baseada em um fragmento do 18S rRNA de 1700 pb, após o alinhamento) foram agrupadas em três grupos principais, os quais foram subdivididos em oito grupos. O presente trabalho mostrou que diferentes genótipos de T. equi e B. caballi circulam entre equídeos no Brasil.

Detecção de Theileria equi e Babesia caballi e anticorpos anti-Ehrlichia spp. em equídeos do Pantanal Mato-Grossense, Brasil / Detection of Theileria equi, Babesia caballi and anti-Ehrlichia spp antibodies in equides from the Pantanal of Mato Grosso State

O presente estudo avaliou equídeos de 19 fazendas da região do Pantanal Mato-Grossense, sendo 121 equídeos testados pela reação em cadeia pela polimerase (PCR), para detectar fragmentos dos genes dos seguintes gêneros: Babesia, Theileria, Anaplasma, Ehrlichia, e Neorickettsia, e pela reação de imunofluorescência indireta (RIFI), para detectar anticorpos anti-Ehrlichia spp. Das amostras testadas na PCR, 17 (14,0%) animais de nove (47,3%) fazendas foram positivos. Das amostras positivas, 16 foram 100% idênticas a sequencias de Theileria equi e uma foi 99% similar à sequência de Babesia caballi, todas disponíveis no GenBank. Pela RIFI, 48 (39,6%) equídeos foram soropositivos para antígenos de E. canis, sendo 40 (83,3%) amostras com títulos de 40 e oito (16,6%) com títulos de 320. Todas as fazendas avaliadas (100%) apresentaram equídeos soropositivos. Os resultados do presente estudo demonstram que T. equi e B. caballi infectam equinos na região, e a presença de anticorpos anti-Ehrlichia spp. indica a circulação de espécies antigenicamente relacionadas aos gêneros Ehrlichia e Anaplasma, apesar de a negatividade nos exames de PCR indicar provável processo crônico desses agentes.

The present study evaluated 121 equids from 19 ranches in the Pantanal region of Mato Grosso State through Polimerase Chain Raction (PCR) to detect Babesia, Theileria, Anaplasma, Ehrlichia and Neorickettsia partial genes and the Imunofluorescent Antibody Test (IFAT) to evaluate anti-Ehrlichia spp. antibodies. From the total tested in PCR, 17 (14.0%) equids from 9 (47.3%) farms were positive, and 16 yielded amplicons 100% identical to Theileria equi and one presented 99% similarity to Babesia caballi available on GenBank. Forty eight (39.6%) equids were positive by IFAT and 40 showed titers of 40 (83.3%) and 8 showed titers of 320 (16.6%). All ranches (100%) presented seropositive equids. Our results showed that T. equi and B. caballi are infecting equids in the region and the presence of anti-Ehrlichia antibodies suggests that species closely related to the genera Ehrlichia and Anaplasma are circulating among the equid local population. Moreover, the negative results in PCR is possibly related to the chronic infection phase.

Reproductive efficiency of asymptomatic Theileria equi carriers mares submitted to an embryo transfer program / Eficiência reprodutiva de éguas portadoras assintomáticas de Theileira equi submetidas a um programa de transferência de embriões

This study aimed to assess and evaluate the effects of Theileria equi infection on embryonic recovery, gestation and early embryonic loss. Thirteen Mangalarga Marchador Theileria equi positive donors (diagnosed through nested-PCR) and 40 embryos receptors were used. Donors were submitted to two embryo collections in two consecutive estrous cycles (GId); after, the same mares were treated with imidocarb dipropionate (1.2mg/kg IM.) in order to collect more embryos in two more estrous cycles (GIId). Receptors were divided into two groups (control and with treated) with 20 animals each, where one group was the control (GIr) and the other one (GIIr) treated with 1.2mg/kg IM of imidocarb dipropionate assessing the gestation rate at 15, 30, 45 and 60 days. After 52 embryo collections, the embryonic recovery rates were 53.84% (14/26) and 65.38% (17/26) (p> 0.05) for GId and GIId, respectively. The gestation rate was 70% (14/20) (p>0.05) at 15, 30, 45 and 60 days in group GIr and for GIIr was 85% (17/20) (p>0.05) at 15 days, 80% (16/20) (p>0.05) at 30, 45 and 60 days. The treatment with imidocarb dipropionate did not cause significant improvement in the reproductive efficiency at an ET program.

Este estudo teve por objetivo avaliar a influência da infecção por Theileria equi nas taxas de recuperação embrionária, gestação e perda embrionária precoce. Foram utilizadas 13 doadoras e 40 receptoras de embrião da raça Mangalarga Marchador, positivas para Theileria equi através da técnica de nested-PCR. Nas doadoras foram realizados duas coletas de embriões em dois ciclos estrais consecutivos (GId), em sequência, esses mesmos animais foram tratados com dipropionato de imidocarb (1,2mg/kg IM.) para realização de mais duas coletas de embriões em dois ciclos estrais (GIId). As receptoras foram divididas em dois grupos de 20 animais cada, onde um grupo foi o controle (GIr) e, o outro grupo, foi tratado (GIIr) com 1,2mg/ Kg IM de dipropionato de imidocarb, com intuito de avaliar a taxa de gestação aos 15, 30, 45 e 60 dias. Após a realização de 52 coletas de embrião, as taxas de recuperação embrionária foram de 53,84% (14/26) e 65,38% (17/26) (p> 0,05) para GId e GIId, respectivamente. A taxa de gestação foi de 70% (14/20) (p>0,05) aos 15, 30, 45 e 60 dias no grupo GIr e para o GIIr foi 85% (17/20) (p>0,05) aos 15 dias, 80% (16/20) (p>0,05) aos 30, 45 e 60 dias. O tratamento com dipropionato de imidocarb não promoveu melhora significativa na eficiência reprodutiva em um programa de TE.

Seroprevalence rates of antibodies against Theileria equi in team roping horses from central-western region of Paraná / Soroprevalência de anticorpos contra Theileria equi em equinos atletas da região centro-oeste do Paraná

The purpose of this study was to estimate the prevalence of Theileria equi in horses from central western region of Paraná state, Brazil. The presence of antibodies IgG against T. equi was determined in serum samples obtained from 400 team roping horses of the district of Guarapuava by the enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Results showed that 242 (61%) animals were positive which demonstrates that equine piroplasmosis is widespread and therefore it might be a contributing factor for the irregular performance among athletes horses in the region studied. No association regarding age and sex were observed (p>0.05). To our knowledge, this is the first report describing a serological survey on equine piroplasmosis in the state of Paraná, Brazil.

O objetivo deste estudo foi estimar a prevalência de Theileria equi em equinos da região centro-oeste do Estado do Paraná, Brasil. A presença de anticorpos IgG contra T. equi foi determinada em amostras de soro obtidas a partir de 400 cavalos atletas do distrito de Guarapuava pelo ensaio imunoenzimático (ELISA). Os resultados mostraram que 242 (61%) animais foram positivos, o que demonstra que a piroplasmose equina apresenta ampla distribuição e, portanto, poderá contribuir para a performace irregular de cavalos que participam de eventos desportivos na região. Não foi observada associação com a idade ou sexo dos equinos (p>0,05). Pelo que se sabe, este é o primeiro relato de levantamento sorológico sobre piroplasmose equina no Estado do Paraná, Brasil.

Occurrence of Theileria equi in horses raised in the Jaboticabal microregion, São Paulo State, Brazil / Ocorrência de Theileria equi em equinos criados na microrregião de Jaboticabal, Estado de São Paulo, Brasil

Blood and serum samples from 170 horses raised in the Jaboticabal microregion, São Paulo State, Brazil, were collected and tested by microscopic examination of blood smears, indirect fluorescent antibody test (IFAT) and nested polymerase chain reaction (nPCR) for Theileria equi infections. The association among the test results was verified by the McNemar test. During the examination of thin blood smears, parasites were detected in six (3.52 percent) horses. Anti-T. equi antibodies were detected in 100 percent sera samples, with titers ranging between 1:80 and 1:5120. The nPCR based on the T. equi merozoite antigen gene (EMA-1) allowed the visualization of specie-specific amplified product in 108 (63.53 percent) horses. All six samples judged positive microscopically were also positive for nPCR. Statistical analysis indicated general disagreement (p < 0.0001) between IFAT and nPCR; IFAT and blood smear; and nPCR and blood smear on the detection of parasite carriers. The results of the present study indicate that T. equi is widely spread among horses in the Jaboticabal microregion, Northeast region of São Paulo State, Brazil.

Amostras de sangue e soro de 170 equinos criados na microrregião de Jaboticabal, Estado de São Paulo, Brasil, foram coletadas e avaliadas pelo exame direto em esfregaço sanguíneo, reação de imunofluorescência indireta (RIFI) e nested reação em cadeia da polimerase (nPCR) para a detecção de infecções por Theileria equi. A concordância dos resultados entre os testes de diagnóstico foi verificada pelo teste de McNemar. Durante o exame dos esfregaços sanguíneos, parasitos foram detectados em seis (3,52 por cento) equinos. Anticorpos anti-T. equi foram detectados em 100 por cento das amostras de soros, com títulos variando entre 1:80 e 1:5120. O nPCR, baseado na sequência do gene do antígeno de merozoíto de T. equi (EMA-1), permitiu a visualização de produtos de amplificação espécie-específico em 108 (63,53 por cento) equinos. Houve diferença altamente significativa (p < 0,0001) entre RIFI e nPCR; RIFI e esfregaço sanguíneo; e nPCR e esfregaço na detecção do parasito. O resultado do presente estudo indica que a infecção por T. equi está amplamente distribuída entre os equinos na microrregião de Jaboticabal, região Nordeste do Estado de São Paulo, Brasil.

Prevalence of equine Piroplasmosis and its association with tick infestation in the State of São Paulo, Brazil / Prevalência da Piroplasmose equina e sua associação com infestação por carrapatos no Estado de São Paulo

Serum samples were collected from 582 horses from 40 stud farms in the State of São Paulo and tick (Acari: Ixodidae) infestations were evaluated on them. Serum samples were subjected to the complement fixation test (CFT) and a competitive inhibition ELISA (cELISA) for Babesia caballi and Theileria equi. Logistic regression analyses were performed to construct multivariate models that could explain the dependent variable (horses positive for B. caballi or T. equi) as a function of the independent variables (presence or abundance of each one of the tick species found on the farms). A higher overall prevalence of B. caballi (54.1 percent) than of T. equi (21.6 percent) was found by the two tests. The ticks Dermacentor nitens Neumann, 1897, Amblyomma cajennense (Fabricius, 1787) and Rhipicephalus (Boophilus) microplus (Canestrini, 1887) were present on horses on 38 (95 percent), 20 (50 percent), and 4 (10 percent) farms, respectively. Infestations by D. nitens were statistically associated with B. caballi-positive horses on the farms by either the CFT or cELISA. Infestations by A. cajennense were statistically associated with T. equi-positive horses on the farms by either CFT or cELISA.

Amostras de soro sanguineo foram coletadas de 582 equinos de 40 haras no estado de São Paulo, onde as infestações por carrapatos foram avaliadas nos animais. Os soros foram testados por reação de fixação do complemento (RFC) e ELISA competitivo por inibição (cELISA) com antígenos de Babesia caballi e Theileria equi. Análises de regressão logística foram realizadas para construir modelos multivariados que pudessem explicar as variáveis dependentes (equinos positivos para B. caballi ou T. equi) em função de variáveis independentes (presença e abundância de cada uma das espécies de carrapatos encontradas nos equinos dos haras). Em geral, os dois testes sorológicos indicaram uma prevalência maior para B. caballi (54,1 por cento) do que para T. equi (21,6 por cento). Os carrapatos Dermacentor nitens Neumann, 1897, Amblyomma cajennense (Fabricius, 1787) e Rhipicephalus (Boophilus) microplus (Canestrini, 1887) estiveram presentes em equinos de 38 (95 por cento), 20 (50 por cento) e 4 (10 por cento) haras, respectivamente. As infestações por D. nitens estiveram estatisticamente associadas com equinos positivos para B. caballi tanto pela RFC como pelo cELISA. As infestações por A. cajennense estiveram estatisticamente associadas com equinos soropositivos para T. equi, tanto pela RFC como pelo cELISA.

Immunogenicity and antigenicity of the recombinant EMA-1 protein of Theileria equi expressed in the yeast Pichia pastoris / Imunogenicidade e antigenicidade da proteína recombinante EMA-1 de Theileria equi expressa em Pichia pastoris

The equine piroplasmosis caused by Theileria equi is one of the most important parasitic diseases of the equine, causing damage to animal health and economic losses. In T. equi, 2 merozoite surface proteins, equi merozoite antigen EMA-1 and EMA-2, have been identified as the most immunodominant antigens. This suggests that these antigens might be used as immunobiological tools. The EMA-1 of Theileria equi was cloned and expressed in the yeast Pichia pastoris. The transformed yeast was grown at high cell density, expressing up to 389 mg.L-1 of recombinant protein. The protein was concentrated and detected in Dot blot. The recombinant product was antigenically similar to the native protein as determined using monoclonal antibodies, and polyclonal antibodies obtained from equines naturally infected with T. equi. The immunogenicity of rEMA-1 protein was demonstrated by IFAT using sera from recombinant-protein-immunized mice using aluminum hydroxide as adjuvant. All animals vaccinated with rEMA-1 developed a high specific antibody response. This results suggest that rEMA-1expressed in P. pastoris might be a strong candidate to be used as an antigen for immune diagnostics as well as a vaccine antigen.

A piroplasmose equina causada por Theileria equi é uma das mais importantes doenças parasitárias de equídeos, causando danos a saúde animal e perdas econômicas. Em T. equi, 2 proteínas de superfície de merozoítos, equi merozoite antigen EMA-1 e EMA-2, têm sido identificadas como antígenos imunodominantes. Sugerindo que estes antígenos possam ser usados como produtos imunobiológicos. O gene EMA-1 de T. equi foi clonado e expressado na levedura Pichia pastoris. As leveduras transformadas foram cultivadas a altas densidades celulares expressando 389 mg.L-1 de proteína recombinante. A proteína foi concentrada e detectada em Dot blot. O produto recombinante foi antigenicamente similar à proteína nativa quando determinado usando anticorpo monoclonal e anticorpos policlonais obtidos de equinos naturalmente infectados com T. equi. A imunogenicidade da proteína rEMA-1 foi demonstrada por RIFI utilizando soro de camundongos imunizados com proteína recombinante usando hidróxido de alumínio como adjuvante. Todos os animais vacinados com rEMA-1 desenvolveram uma alta resposta específica de anticorpos. Esses resultados sugerem que rEMA-1 expressa em P. pastoris possa ser um candidato para ser usado como antígeno para diagnóstico imunológico bem como antígeno para vacinas.

Detección molecular de patógenos emergentes de importancia médica y veterinaria en garrapatas capturadas sobre caballos domésticos / Molecular detection of emerging pathogens of medical and veterinary importance in ticks found in domestic horses

En la actualidad son varias las especies de patógenos emergentes de importancia médica y veterinaria transmitidos por garrapatas. Los estudios sobre estos agentes y sus enfermedades han sido escasos en Cuba. Conocer la presencia de algunos de estos patógenos en garrapatas cubanas que afectan el ganado equino. Se procesaron 95 garrapatas colectadas de caballos domésticos, conservadas en alcohol e identificadas taxonómicamente según claves convencionales. A cada una se le realizó extracción de ADN y posteriormente diferentes reacciones en cadena de la polimerasa utilizando cebadores específicos para los grupos microbianos Borrelia burgdorferi sensu lato, Anaplasma-Ehrlichia, y Babesia-Theileria. Cada uno de los productos de las reacciones en cadena de la polimerasa fue sometido a hibridaciones en línea reversa utilizando sondas para cada grupo en cuestión, así como específicas para las principales especies de estos. Las garrapatas estudiadas pertenecían a las especies Dermacentor (Anocentor) nitens (60 por ciento), Amblyomma cajennense (38 por ciento) y Rhipicephalus (Boophilus) microplus (2 por ciento). Se detectaron 7 garrapatas Dermacentor (Anocentor) nitens infectadas con bacterias del grupo Anaplasma/Ehrlichia, y no se pudo identificar la especie en cuestión con las sondas utilizadas. Una de estas garrapatas estaba además coinfectada con Babesia bovis. Se sugiere la circulación de una nueva especie de Anaplasma o Ehrlichia no reportada antes en Cuba, por lo que se necesita estudiar un número mayor de garrapatas, así como la incorporación de nuevas sondas en la hibridación en línea reversa u otras metodologías que permitan conocer con exactitud las especies que pudiesen afectar hoy día los caballos domésticos.

At present, there are several tick-borne emerging pathogen species of medical and veterinary importance. Few studies on these agents and its diseases have been made in Cuba. To determine the presence of some of these pathogens in Cuban ticks existing in the equine cattle. Ninety five ticks collected from domestic use horses were processed, preserved in alcohol and taxonomically identified according to the set classifications. Their DNA was extracted and subjected to several polymerase chain reactions with specific primers for microbial groups Borrelia burgdorferi sensu lato, Anaplasma-Ehrlichia, y Babesia-Theileria. Each of the products from polymerase chain reactions underwent reverse line blot hybridation using probes for each group as well as specific probes for the main species included in these groups. The studied ticks belonged to Dermacentor (Anocentor) nitens (60 percent), Amblyomma cajennense (38 percent) y Rhipicephalus (Boophilus) microplus (2 percent). Seven Dermacentor (Anocentor) nitens ticks infested with Anaplasma/Ehrlichia bacteria were detected but the species in question could not be detected by the used probes. One of these ticks was also co-infested with Babesia bovis. It is suggested that a new species of Anaplasma o Ehrlichia, not reported in Cuba before now, is circulating, so studying a higher number of ticks is needed and new probes in reverse line blot hybridation or other methodologies must be incorporated to allow exactly determining the species that may affect the Cuban domestic horses at present.

Estudo comparativo de três métodos de diagnóstico para detecção de anticorpos anti-Theileria equi em eqüinos de áreas endêmicas do estado do Rio de Janeiro / Comparative studies of three methods for detection Theileria equi antibody in endemic areas horses from Rio de Janeiro state

Este trabalho teve o objetivo de avaliar a reação de imunofluorescência indireta (RIFI), ensaio imunoenzimático (ELISA) e a reação de fixação do complemento (RFC) no diagnóstico de Theileria equi em amostras de soro de 79 equinos na Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro(UFRRJ), Seropédica, RJ, Brasil. Houve reação positiva para Theileria equi em 74,7, 75,9 e 60,8% das amostras testadas pela RIFI, ELISA eRFC, respectivamente. Observou-se discrepância em 16,45% (n=13) das amostras de soro testadas pelo ELISA indireto e RIFI. Quando comparado a RIFI e a RFC, a discrepância observada entre os soros testados foi de 36,70% (n=29). O teste ELISA indireto e a RFC apresentaram discordância em 37,97% (n=30) das amostras de soros. Os resultados do presente estudo sugerem que a melhor alternativa para o diagnóstico sorológico de T. equi em eqüinos portadores é aassociação dos testes de RIFI e ELISA indireto, especialmente para a realização de estudos soroepidemiológicos

This study was carried out to evaluate indirect fluorescent antibody test (IFAT), enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) and complement fixation test (CFT) of Theileria equi diagnosis in sera samples of 79 horses at Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro(UFRRJ), Seropédica, RJ, Brazil were tested. Positive reaction was obtained in 74.7, 75.9 and 60.8% of samples tested by IFAT, indirect ELISA and CFT, respectively. Discrepancy was observed in 16.45%(n=13) of serum samples tested by ELISA and IFAT. While IFAT and CFT were compared, the discrepancy observed among the samples tested were 36.71% (n=29). Indirect ELISA and CFT test presented disagreement in 37.97% (n=30) of serum samples tested. Results of present study suggests that the best alternative for serological diagnosis T. equi in carriers horses is the combined use of IFAT and indirect ELISA test, especially for accomplishment of seroepidemiological studies.

Frequency of seropositive equines for Theileria equi in the Southern Rio Grande do Sul State, Brazil

Foi realizado um levantamento sobre theileriose equina em uma propriedade da região sul do estado do Rio Grande do Sul (RS). Amostras de sangue foram coletadas de 108 éguas de um haras localizado no municipio de Bagé, latitude 31°30' Sul e longitude 54Ú10' Oeste. A sorologia foi realizada com o uso da imunofluorescência indireta (IFAT) e utilizou-se a técnica de Nested Reacão em Cadeia Polimerase (nPCR). Do total de amostras examinadas, 22 por cento (24) foram positivas por IFAT e 15 por cento (16) por nPCR). Na análise por raca, 15.05 por cento (14) dos animais Puro Sangue Inglês (PSI) foram soro-positivos, e dos animais da raça Crioula (RC), 55 por cento (11) foram positivos por IFAT.

A study on equine theileriosis was carried out in the southern region of the Brazilian state of Rio Grande do Sul (RS). Blood samples were collected from 113 mares from an equine breeding farm located in the city ofBagé, latitude 31 "30'S and a longitude of 54 U10' W. The serological testing was carried out with the use of indirect fluorescence test (IFAT) and compared with Nested Polimerase Chain Reaction (nPCR). Among the sera collected from 118 horses, 25 were found positive to Theileria equi by the IFAT, while by nPCR 17 positive for T. equi was observed, corresponding to a frequency of22.1 percent> and 15.0 percent, respectively. The racial analysis showed 15.05 percent (14) thoroughbred and 55 percent (11) Crioulo breed horses to be positive by IFAT.

Alterations in muscular enzymes of horses competing long-distance endurance rides under tropical climate / Alterações em enzimas musculares de cavalos em competições de enduro de longa distância em clima tropical

This study tried to monitor the alterations of muscle enzymes activity - creatinokinase (CK), lactate dehydrogenase (LDH), and aspartate aminotransferase (AST) - in a group of horses that participated of 70 and 100km distance rides in five competitions of an annual endurance championship under tropical climate. Pre ride levels (U/l) were 245.13±9.84 for CK, 496.61±14.76 for LDH, and 328.95±8.65 for AST. When compared to these levels, the results revealed a significant decrease in all enzymes activities in the first moment of the rides. Peak levels, significantly different, were reached, immediately after rides by CK (413.591±50.75); 24 hours post rides by LDH (628.61±33.30); and 48 hours after rides by AST (389.89±16.96). Monitoring of recovery period revealed different behavior among enzymes activities with CK values returning to pre ride values (279.61±23.05) 24 hours post rides, while LDH and AST values returned to pre ride values (505.25±33.78 and 359.35±24.90, respectively) 72 hours post rides. These data revealed different alterations in concentration of muscular enzymes in endurance horses directly related to the duration of the effort.

Estudaram-se as alterações de atividade das enzimas musculares creatino quinase (CK), lactato desidrogenase (LDH) e aspartato aminotransferase (AST) em um grupo de cavalos que utilizados em provas de enduro de 70 e 100km de distância, em cinco competições. Os valores (U/l) basais (antes da largada) foram 245,13±9,84 para CK, 496,61±14,76 para LDH e 328,95±8,65 para AST. Todas as atividades das enzimas decresceram no primeiro momento das provas (~30km). Valores de pico, significativamente diferentes, foram alcançados para CK (413,59±50,75) imediatamente após 70km de distância; 24 horas após para LDH (628,61±33,30); e 48 horas após as provas para AST (389,89±16,96). A monitoração do período de recuperação revelou diferente comportamento entre as concentrações enzimáticas com CK retornando aos valores basais 24 horas pós-provas (279,61 ± 23,05). LDH e AST retornaram aos valores basais, 72 horas pós-provas (505,25±33,78 e 359,35±24,90, respectivamente). Os dados obtidos revelaram diferentes alterações na concentração de enzimas musculares de cavalos de enduro, diretamente relacionadas com a duração do esforço.

In vitro culture, PCR, and nested PCR for the detection of Theileria equi in horses submitted to exercise / Cultivo in vitro, PCR e nested PCR na detecção de Theileria equi em eqüinos submetidos a exercícios

This study compared the usefulness of in vitro culture, PCR, and nested PCR for the diagnosis of Theileria equi in horses submitted to stress during exercise. Blood samples from 15 apparently healthy horses, previously conditioned to a high-speed equine treadmill, were taken prior to and after exercise. The animals were divided into two experimental groups: 30-day training schedule (G1) and 90-day training schedule (G2). Statistical analysis was performed using a chi-square test and kappa statistic was used in order to assess agreement. No significant difference was observed between samples collected at resting or after exercise. In G1, merozoites of T. equi were detected in the blood smears of four horses before in vitro culture, whereas 14 samples were positive, confirmed by culture. In G2, five and 11 horses were positive before and after culture, respectively. No PCR amplified product was observed in any of the tested animals although the PCR system based on the 16S rRNA gene of T. equi detected DNA in blood with an equivalent 8x10-5 percent parasitaemia. The nested PCR based on the T. equi merozoite antigen gene (EMA-1) allowed the visualization of amplified products in all the horses. Therefore, nested PCR should be considered as a means of detection of sub-clinical T. equi infections and in vitro culture could be used as a complement to other methods of diagnosis.

Comparou-se a utilização do cultivo in vitro, PCR e nested PCR no diagnóstico de Theileria equi em eqüinos submetidos ao estresse induzido por exercícios. Amostras de sangue foram obtidas de 15 eqüinos submetidos a treinamento em esteira rolante de alto desempenho, sendo as amostras colhidas antes e após os exercícios. Os animais foram divididos em dois grupos experimentais: 30 dias de treinamento (G1) e 90 dias de treinamento (G2). O teste do qui-quadrado foi empregado para as análises estatísticas e o índice kappa utilizado para avaliar a concordância. Não houve diferença significativa entre as amostras obtidas em repouso e após exercícios. Merozoítas de T. equi foram detectados em apenas quatro eqüinos do G1 pela microscopia direta realizada antes do cultivo, enquanto 14 animais apresentaram-se positivos pelo cultivo in vitro. No G2, cinco e 11 eqüinos foram positivos antes e após o cultivo, respectivamente. Nenhum produto de amplificação foi observado pela técnica de PCR, apesar do PCR baseado no gene 16S rRNA de T. equi ter detectado DNA em sangue com parasitemia equivalente a 8x10-5 por cento. O nested PCR, baseado na seqüência do gene do antígeno de merozoíta de T. equi (EMA-1,) permitiu a visualização de produtos de amplificação em todos os eqüinos testados. O nested PCR deve ser considerado para a detecção de infecções subclínicas de T. equi e o cultivo in vitro pode ser utilizado como uma ferramenta complementar a outros métodos de diagnóstico.