Pharmacological characterization of the calcium influx pathways involved in nitric oxide production by endothelial cells / Caracterização farmacológica das vias de influxo de cálcio envolvidas na produção de óxido nítrico por células endoteliais

ABSTRACT Objective: To characterize the calcium influx pathways implicated in the sustained elevation of endothelial intracellular calcium concentration, required for the synthesis and release of relaxing factors. Methods: We evaluated the effect of the newly synthesized pyrazole derivatives, described as selective inhibitors for ORAI (BTP2/Pyr2 and Pyr6) and TRPC3 (Pyr3 and Pyr10) channels, upon endothelium- and extracellular calcium-dependent relaxations stimulated by acetylcholine and thapsigargin, in pre-constricted rat thoracic aortic rings. Results: Acetylcholine and thapsigargin responses were completely reverted by Pyr2 and Pyr6 (1 to 3μM). Pyr3 (0.3 to 3μM) caused a rapid reversal of acetylcholine (6.2±0.08mg.s−1) and thapsigargin (3.9±0.25mg.s−1) relaxations, whereas the more selective TRPC3 blocker Pyr10 (1 to 3μM) had no effect. The recently described TRPC4/5 selective blocker, ML204 (1 to 3μM), reverted completely acetylcholine relaxations, but minimally thapsigargin induced ones. Noteworthy, relaxations elicited by GSK1016790A (TRPV4 agonist) were unaffected by pyrazole compounds or ML204. After Pyr2 and Pyr6 pre-incubation, acetylcholine and thapsigargin evoked transient relaxations similar in magnitude and kinetics to those observed in the absence of extracellular calcium. Sodium nitroprusside relaxations as well as phenylephrine-induced contractions (denuded aorta) were not affected by any of pyrazole compounds (1 to 3μM). Conclusion: These observations revealed a previously unrecognized complexity in rat aorta endothelial calcium influx pathways, which result in production and release of nitric oxide. Pharmacologically distinguishable pathways mediate acetylcholine (ORAI/TRPC other than TRPC3/TRPC4 calcium-permeable channels) and thapsigargin (TRPC4 not required) induced calcium influx.

RESUMO Objetivo: Caracterizar as vias do influxo de cálcio envolvidas no aumento sustentado da concentração intracelular de cálcio na célula endotelial, essencial para a síntese e a liberação de fatores relaxantes. Métodos: Analisamos o efeito de derivados pirazólicos sintetizados recentemente, descritos como inibidores seletivos para canais ORAI (BTP2/Pyr2 e Pyr6) e TRPC3 (Pyr3 e Pyr10), nos relaxamentos dependentes de endotélio e cálcio extracelular, produzidos por acetilcolina e tapsigargina, em anéis pré-contraídos da aorta torácica de rato. Resultados: As respostas de acetilcolina e tapsigargina foram completamente revertidas por Pyr2 e Pyr6 (1 a 3μM). Pyr3 (0,3 a 3μM) produziu reversão rápida dos relaxamentos de acetilcolina (6,2±0,08mg.s−1) e tapsigargina (3,9±0,25mg.s−1), enquanto o bloqueador mais seletivo para TRPC3, Pyr10 (1 a 3μM), não apresentou efeito. ML204 (1 a 3μM), bloqueador seletivo de TRPC4, descrito há pouco tempo, reverteu os relaxamentos induzidos por acetilcolina de forma completa, mas afetou minimamente aqueles produzidos por tapsigargina. Os derivados pirazólicos ou ML204 não afetaram os relaxamentos estimulados com GSK1016790A (TRPV4-agonista). Ainda, após pré-incubação com Pyr2 e Pyr6, acetilcolina e tapsigargina provocaram relaxamentos transitórios semelhantes em magnitude e cinética àqueles observados na ausência de cálcio extracelular. Os relaxamentos do nitroprussiato de sódio e as contrações induzidas pela fenilefrina (aorta sem endotélio) não foram afetados pelos compostos pirazólicos (1 a 3μM). Conclusão: Essas observações revelaram uma complexidade desconhecida das vias de influxo de cálcio no endotélio da aorta de rato, que resultam na produção e na liberação de óxido nítrico. Vias distinguíveis farmacologicamente medeiam o influxo estimulado por acetilcolina (ORAI TRPC, diferentes de TRPC3 TRPC4) e tapsigargina (TRPC4 não requerido).

Successful application of virtual screening and molecular dynamics simulations against antimalarial molecular targets

The main challenge in the control of malaria has been the emergence of drug-resistant parasites. The presence of drug-resistant Plasmodium sp. has raised the need for new antimalarial drugs. Molecular modelling techniques have been used as tools to develop new drugs. In this study, we employed virtual screening of a pyrazol derivative (Tx001) against four malaria targets: plasmepsin-IV, plasmepsin-II, falcipain-II, and PfATP6. The receiver operating characteristic curves and area under the curve (AUC) were established for each molecular target. The AUC values obtained for plasmepsin-IV, plasmepsin-II, and falcipain-II were 0.64, 0.92, and 0.94, respectively. All docking simulations were carried out using AutoDock Vina software. The ligand Tx001 exhibited a better interaction with PfATP6 than with the reference compound (-12.2 versus -6.8 Kcal/mol). The Tx001-PfATP6 complex was submitted to molecular dynamics simulations in vacuum implemented on an NAMD program. The ligand Tx001 docked at the same binding site as thapsigargin, which is a natural inhibitor of PfATP6. Compound TX001 was evaluated in vitro with a P. falciparum strain (W2) and a human cell line (WI-26VA4). Tx001 was discovered to be active against P. falciparum (IC50 = 8.2 µM) and inactive against WI-26VA4 (IC50 > 200 µM). Further ligand optimisation cycles generated new prospects for docking and biological assays.

ß-Citronellol, an alcoholic monoterpene with inhibitory properties on the contractility of rat trachea

β-Citronellol is an alcoholic monoterpene found in essential oils such Cymbopogon citratus (a plant with antihypertensive properties). β-Citronellol can act against pathogenic microorganisms that affect airways and, in virtue of the popular use of β-citronellol-enriched essential oils in aromatherapy, we assessed its pharmacologic effects on the contractility of rat trachea. Contractions of isolated tracheal rings were recorded isometrically through a force transducer connected to a data-acquisition device. β-Citronellol relaxed sustained contractions induced by acetylcholine or high extracellular potassium, but half-maximal inhibitory concentrations (IC50) for K+-elicited stimuli were smaller than those for cholinergic contractions. It also inhibited contractions induced by electrical field stimulation or sodium orthovanadate with pharmacologic potency equivalent to that seen against acetylcholine-induced contractions. When contractions were evoked by selective recruitment of Ca2+ from the extracellular medium, β-citronellol preferentially inhibited contractions that involved voltage-operated (but not receptor-operated) pathways. β-Citronellol (but not verapamil) inhibited contractions induced by restoration of external Ca2+ levels after depleting internal Ca2+ stores with the concomitant presence of thapsigargin and recurrent challenge with acetylcholine. Treatment of tracheal rings with L-NAME, indomethacin or tetraethylammonium did not change the relaxing effects of β-citronellol. Inhibition of transient receptor potential vanilloid subtype 1 (TRPV1) or transient receptor potential ankyrin 1 (TRPA1) receptors with selective antagonists caused no change in the effects of β-citronellol. In conclusion, β-citronellol exerted inhibitory effects on rat tracheal rings, with predominant effects on contractions that recruit Ca2+ inflow towards the cytosol by voltage-gated pathways, whereas it appears less active against contractions elicited by receptor-operated Ca2+ channels.

Novel identification and characterisation of Transient receptor potential melastatin 3 ion channels on Natural Killer cells and B lymphocytes: effects on cell signalling in Chronic fatigue syndrome/Myalgic encephalomyelitis patients

BACKGROUND: Transient receptor potential melastatin 3 (TRPM3) cation channels are ubiquitously expressed by multiple cells and have an important regulatory role in calcium-dependent cell signalling to help maintain cellular homeostasis. TRPM3 protein expression has yet to be determined on Natural Killer (NK) cells and B lymphocytes. Multiple single nucleotide polymorphisms have been reported in TRPM3 genes from isolated peripheral blood mononuclear cells, NK and B cells in Chronic fatigue syndrome/Myalgic encephalomyelitis (CFS/ME) patients and have been proposed to correlate with illness presentation. The object of the study was to assess TRPM3 surface expression on NK and B lymphocytes from healthy controls, followed by a comparative investigation examining TRPM3 surface expression, and cytoplasmic and mitochondrial calcium influx in CD19+ B cells, CD56bnght and CD56dim cell populations from CFS/ME patients. RESULTS: TRPM3 cell surface expression was identified for NK and B lymphocytes in healthy controls (CD56bright TRPM3 35.72 % ± 7.37; CD56dim 5.74 % ± 2.00; B lymphocytes 2.05 % ± 0.19, respectively). There was a significant reduction of TRPM3 surface expression on CD19+ B cells (1.56 ± 0.191) and CD56bright NK cells (17.37 % ± 5.34) in CFS/ME compared with healthy controls. Anti-CD21 and anti-IgM conjugated biotin was cross-linked with streptavidin,and subsequently treatment with thapsigargin. This showed a significant reduction in cytoplasmic calcium ion concentration in CD19+ B lymphocytes. CD56bright NK cells also had a significant decrease in cytoplasmic calcium in the presence of 2-APB and thapsigargin in CFS/ME patients. CONCLUSIONS: The results from this preliminary investigation identify, for the first time, TRPM3 surface expression on both NK and B lymphocytes in healthy controls. We also report for the first time, significant reduction in TRPM3 cell surface expression in NK and B lymphocytes, as well as decreased intracellular calcium within specific conditions in CFS/ME patients. This warrants further examination of these pathways to elucidate whether TRPM3 and impaired calcium mobilisation has a role in CFS/ME.

The Ca2+ pump inhibitor, thapsigargin, inhibits root gravitropism in Arabidopsis thaliana

Thapsigargin, a specific inhibitor of most animal intracellular SERCA-type Ca2+ pumps present in the sarcoplasmic/endoplasmic reticulum, was originally isolated from the roots of the Mediterranean plant Thapsia gargancia L. Here, we demonstrate that this root-derived compound is capable of altering root gravitropism in Arabidopsis thaliana. Thapsigargin concentrations as low as 0.1 µM alter root gravitropism whereas under similar conditions cyclopiazonic acid does not. Furthermore, a fluorescently conjugated thapsigargin (BODIPY FL thapsigargin) suggests that target sites for thapsigargin are located in intracellular organelles in the root distal elongation zone and the root cap, regions known to regulate root gravitropism.

Inhibition of the sarcoplasmic reticulum Ca2+ pump with thapsigargin to estimate the contribution of Na+-Ca2+ exchange to ventricular myocyte relaxation

Relaxation in the mammalian ventricle is initiated by Ca2+ removal from the cytosol, which is performed by three main transport systems: sarcoplasmic reticulum Ca2+-ATPase (SR-A), Na+-Ca2+ exchanger (NCX) and the so-called slow mechanisms (sarcolemmal Ca2+-ATPase and mitochondrial Ca2+ uptake). To estimate the relative contribution of each system to twitch relaxation, SR Ca2+ accumulation must be selectively inhibited, usually by the application of high caffeine concentrations. However, caffeine has been reported to often cause changes in membrane potential due to NCX-generated inward current, which compromises the reliability of its use. In the present study, we estimated integrated Ca2+ fluxes carried by SR-A, NCX and slow mechanisms during twitch relaxation, and compared the results when using caffeine application (Cf-NT) and an electrically evoked twitch after inhibition of SR-A with thapsigargin (TG-TW). Ca2+ transients were measured in 20 isolated adult rat ventricular myocytes with indo-1. For transients in which one or more transporters were inhibited, Ca2+ fluxes were estimated from the measured free Ca2+ concentration and myocardial Ca2+ buffering characteristics. NCX-mediated integrated Ca2+ flux was significantly higher with TG-TW than with Cf-NT (12 vs 7 æM), whereas SR-dependent flux was lower with TG-TW (77 vs 81 æM). The relative participations of NCX (12.5 vs 8 percent with TG-TW and Cf-NT, respectively) and SR-A (85 vs 89.5 percent with TG-TW and Cf-NT, respectively) in total relaxation-associated Ca2+ flux were also significantly different. We thus propose TG-TW as a reliable alternative to estimate NCX contribution to twitch relaxation in this kind of analysis.

Influxo de Ca2+ modulado pelo esvaziamento de estoques intracelulares em fundus de estômago de rata: papel do retículo sarcoendoplasmático / Ca2+ influx modulated by de emptying of stocks intracellulares in fundus of female rat stomach: paper of reticulo sarcoendoplasmatic

A TP e o CPA, antagonista da Ca2+-ATPase do Retículo Sarcoplasmátíco, promoveu uma contração tônica devido principalmente ao influxo de cálcio do meio extracelular. Estes compostos ativam dois tipos de influxos: nas concentrações de 3nM-1OnM e 1OOnM- 1mM, a TP e o CPA, respectivamente, ativam influxo de cálcio através de canais de cálcio do subtipo L, ao passo que, a TP e o CPA, na concentração à partir de 30 nM e 3 mM, respectivamente, ativam influxos de cálcio através de canais de cálcio alternativos aos de dihidropiridinas. Em fundus de estômago incorporado com o FURA 2 em meio Tyrode com Ca2+ (1,8 mM), a adição da TP (2 mM) e do CPA (30 mM) induziram uma lenta resposta contrátil, de natureza tônica, e estas respostas foram associadas a um aumento nos níveis da razão do FURA 2. Como a contração sustentada desencadeada por estes compostos apenas foi revertida quando lavamos a preparação em meio Tyrode nominal sem cálcio e na ausência de TP e CPA, podemos inferir, indiretamente, que o Retículo Sarcoplasmático participa ativamente nos processos de extrusão de Ca2+ em fundus do estômago de rata, modulando assim o tônus muscular. Ao expormos o tecido em meio nominal sem cálcio, estes compostos falharam em promover aumento nos níveis intracelulares da [Ca2+]i, ou de tensão mecânica. É provável que, em meio Tyrode nominal sem cálcio, a quantidade de cálcio acumulado no citosol do tecido devido a inibição da Ca2+-ATPase do RS desencadeado pela TP ou pelo CPA, é insuficiente para ativar a maquinaria contrátil. Dessa forma, a presença de Ca2+ no meio extracelular, bem como a depleção dos estoques intracelulares promovida pela TP e pelo CPA, e o subsequente influxo de cálcio pela membrana plasmática em resposta a depleção, são necessários para ativar a maquinaria contrátil com conseqüente contração muscular. Com o intuito de verificar se o esvaziamento de estoques intracelulares de Ca2+ induzido por TP, CPA e Cafeína, promove entrada de Ca2+ regulada por estoques e se este influxo altera a resposta contrátil, estudamos simultaneamente a contração e os níveis de [Ca2+ ]i em fundus de estômago de rata incorporado com o FURA 2. A readição de Ca2+ (1,8 mM) induziu um aumento da [Ca2+]i associado a um aumento de tensão em fundus de estômago incubado com o CPA e Isradipina em meio Tyrode nominal sem cálcio. Em contrapartida, o aumento da [Ca2+]i sustentado observado na presença de TP não foi acompanhado de um aumento de tensão significa...

Estudo da expressão dos antígenos de superficíe celular, CD25 e CD69, em linfócitos ativados por PHA e TPA, e tratados com tapsigargina, trifluoperazina e ouabaína

Neste trabalho estudamos a ação de TG, TFP e OUA (substâncias conhecidas por alterar o "fluxo iônico" da célula) sobre a expressão de dois antígenos de membrana, o CD25 e o CD69, em células ativadas por PHA e por TPA. O CD25 é a cadeia do receptor de IL-2 que se expressa na membrana algumas horas após a ativação. O CD69, membro da família das selectinas, é rapidamente expresso após a ativação. Além do PHA e TPA, outra substância que por si só levou à expressão de CD25 e de CD69 foi a TG. Em células ativadas por PHA, TG promoveu um aumento na expressão destas moléculas; em células ativadas por TPA este efeito foi verificado sobre a expressão de CD25, não havendo modificação na expressão de CD69. Esta substância apresentou efeitos diversos sobre a proliferação e citotoxidade celular: inibiu a proliferação celular induzida por PHA, mas não por TPA; inibiu a citotoxcidade mediada por células NK em repouso, mas as células LAK mostraram-se mais resisitentes ao seu efeito. Estes resultados sugerem a existência de diferentes vias para a proliferação e para a expressão de CD25, demonstrando que a inibição da proliferação não está necessariamente relacionada com a presença de CD25; também demonstraram um mecanismo de citotoxidade distinto atuando em células NK em repouso e ativadas (LAK). Os efeitos de TFP inibindo a proliferação, de células ativadas por PHA E tpa, e a citotoxidade mediada por células NK e LAK, já são conhecidos. TFP também inibiu a expressão CD69 e de CD25 em células ativadas por PHA, excetuando a expressão de CD25, nas primeiras horas após estímulo. A última substância estudada foi a OUA, conhecida por inibir a proliferação celular de células ativadas por PHA e por TPA, e não interferir na citotoxidade de células NK e LAK. Nossos resultados mostraram que OUA inibiu a expressão de CD25, em células ativadas por PHA, OUA promoveu aumento na expressão de CD69; embora em células ativadas por TPA, OUA não tenha interferido no número de células expressando esta molécula, em momentos tardios OUA promoveu um aumento percentual na expressão de CD69 nestas células. A inibição de CD25 por OUA, em células ativadas por PHA, pode ser uma das justificativas para a inibição da proliferação nestas células; mas não se aplica à inibição da proliferação em células ativadas por TPA. Nós demonstramos que OUA inibiu a progressão da fase de G1 para a S. Já está descrito na literatura que a ativação linfocitária via CD69 leva a um aumento no c-myc. Dados do nosso laboratório demonstraram que células ativadas por PHA e tratadas com OUA também promovem um aumento de c-myc e levam a apoptose. Estes dados parecem indicar um possível papel para o CD69 também na morte celular. Nós verificamos que um mesmo sinal (PHA) pode levar a dissociação de resposta para a aexpressão de CD25 e CD69, em uma mesma célula. Os nossos resultados, aliados aos dados da literatura, demonstraram o envolvimento de diferentes vias de ativação conduzindo à proliferação, à citotoxidade e provavelmente à morte celular e a possibilidade de que um mesmo estímulo seja capaz de ativar mais de uma dessas vias.

In the present work the action of TG, TFP and OUA (substances known to alter ion fluxes) was studied with regard to the expression of two membrane antigens CD25 and CD69 in cells activated by PHA and TPA. CD25 is the a chain of the IL-2 receptor which is expressed hours after activation. CD69, a member of the selectin family is rapidly expressed following activation. Besides PHA and TPA, another substance TG was also capable of inducing the expression of CD25 and CD69. TG promoted an increase in the expression of these molecules on cells activated by PHA whereas cells activated by TPA showed an increase in CD25 with no modification of CD69 expression. This substance produced diverse effects on proliferation and cellular cytotoxicity, it inhibited cellular proliferation induced by PHA but not by TPA and inhibited NK cells cytotoxicity but LAK cells were more resistance to its inhibitory effect. These results suggest the existence of different signaling pathways for proliferation and CD25 expression, demonstrating that proliferation inhibition is not necessarily related to the presence of CD25, they also suggest distinct cytotoxic mechanism in resting and activated NK cells. The inhibitory effect of TFP on proliferation induced by PHA and TPA; and on cytotoxicity mediated by NK and LAK cells is already known. TFP also inhibited CD69 and CD25 expression on PHA-activated cells, with the exception of the expression of CD25 on the first hours after activation with remains unchanged. The last substance studied by us was OUA, known to inhibit cellular proliferation of following activation by PHA and TPA and not to interfere with NK and LAK cytotoxicity. Our results shown that OUA inhibited CD25 expression on PHAactivated cells but not on TPA. OUA produced an increase of CD69 expression on PHA-activated cells. However, although OUA did not interfere in the number of cells expressing this molecule it augmenting at latter times the percentage of cells expressing high levels of CD69. CD25 inhibition on PHA activated cells not clarify inhibition of TPA-activated cells. Our results demonstreted that OUA inhibited the progression from G1 to S phase in both cultures. It has been already described that lymphocyte activation via CD69 leady to an increase of c-myc. Data from our laboratory demonstrated that PHA activated cells treated with OUA also promoted an increase in c-myc leading to apoptosis. This results seem to indicated a possible role of CD69 in cell death. We have seem that the same stimulus (PHA) may produce in the same cell a dissociated response with regard the expression of CD25 and CD69. Our results together with the datas from literature indicated the involvement of different activation pathways inducting to proliferation, cytotoxicity and cell death, and the possibility that the same stimulus may activate more than one pathway.

Estudo da expressão dos antígenos de superfície celular, CD25 e CD69 em linfócitos ativados por PHA e TPA e tratados com tapsigargina, trifluoperazina e ouabaína / Study of the expression of cell surface antigens, CD25 and CD69 on activated lymphocytes by PHA and TPA and treated with Thapsigargin, Trifluoperazine and ouabain

Neste trabalho estudados a ação de TG, TFP e OUA (substâncias conhecidas por alterar o fluxo iônico da célula) sobre a expressão de dois antígenos de membrana, o CD25 e o CD69, em células ativadas por PHA e por TPA. O CD25 é a cadeia alfa do receptor de II-2 que se expressa na membrana algumas horas após a ativação. O CD69, membro da família das selectinas é rapidamente expresso após a ativação. Além do PHA e TPA,outra substância que que por si só levou a expressão de CD25 e de CD69 foi a TG...Estes dados parecem indicar um possível papel para o CD69 também na morte celular. Nós verificamos que um mesmo sinal PHA pode levar a dissociação de resposta para a expressão de CD25 e CD69 em uma mesma célula. Os nossos resultados, aliados aos dados da literatura, demonstrem o envolvimento de diferentes vias de ativação conduzindo à proliferação, à citotoxicidade e provavelmente à morte celular e a possibilidade de que um mesmo estímulo seja capaz de ativar mais de uma dessas vias.