Caracterização de dois pares efetor/inibidor associados ao sistema de secreção tipo IV de Xanthomonas citri / Characterization of the two effector/inhibitor pair associated with the type IV secretion system of Xanthomonas citri

O sistema de secreção tipo IV (T4SS) da família de bactérias Xanthomonadaceae transfere efetores (X-Tfes) com a capacidade de matar outras bactérias, conferindo uma vantagem em comunidades bacterianas mistas para colonizar diferentes nichos como o solo ou as superfícies das plantas. Os X-Tfes possuem diferentes domínios putativos com atividades hidrolíticas contra componentes do envelope celular bacteriano do tipo: glicohidrolases, transglicosilases, amidases e lipases. Os X-Tfes por sua atividade biológica inata podem ocasionar dano intracelular para a bactéria que os produz. Para se proteger contra estas atividades, também são produzidas lipoproteínas com função inibitoria (X-Tfis) localizadas no periplasma. Os genes que codificam os X-Tfes e os X-Tfis estão organizados em operons, o que permite gerar os pares efetor/inibidor simultaneamente. Entre os potenciais X-Tfes do fitopatógeno Xanthomonas citri estão Xac1918 e Xac0574. Xac1918 é uma proteína com um domínio da superfamília da lisozima e um domínio conhecido como RTX (Repeats in Toxin) de ligação ao cálcio, enquanto Xac0574 tem um domínio da superfamília da lipase 3. Os seus possíveis inibidores, Xac1917 e Xac0573 respectivamente, apresentam um peptídeo sinal no N-terminal contendo o lipobox representativo das lipoproteínas. As proteínas Xac0574 e Xac0573 são monômeros em solução que formam um complexo estável 1:1, favorecido termodinamicamente (ΔG°= -12 Kcal/mol) com uma constante de dissociação de 2,45 nM, garantindo que a bactéria fique protegida contra os efeitos nocivos de Xac0574 quando é produzida intracelularmente. Xac0574 é uma fosfolipase A1, sem atividade lisofosfolipase, com a capacidade de hidrolisar os três fosfolipídios majoritários que compõem a membrana celular bacteriana, fosfatidilglicerol (PG), cardiolipina e fosfatidiletanolamina (PE), mostrando uma aparente preferência pelo último. A atividade enzimática de Xac0574 explica a forte inibição do crescimento celular em E. coli após da sua indução heteróloga, já que gera uma diminuição de quase 10 vezes da população celular comparada com a cultura não induzida com a mesma construção. Poroutro lado, Xac0573 inibe efetivamente a atividade enzimática de Xac0574 ao formar o complexo, além de não ter atividade fosfolipase nem lisofosfolipase. Foram produzidos cristais da Xac1918 e Xac0573 que difrataram com uma resolução de 3,0 e 2,5 Å, respectivamente. Porém, só foi gerado um modelo de Xac0573. Xac0573 está composta por duas folhas ß antiparalelas com uma topologia característica de ß sanduíche Com uma pequena hélice e duas voltas. Um alinhamento de homólogos de Xac0573 identificou nas extremidades da proteína as regiões conservadas, constituindo duas possíveis interfaces de interação que podem ser as responsáveis por bloquear o acesso dos fosfolipídios ao sítio catalítico ou impedir os rearranjos estruturais de Xac0574 que são necessários para a sua atividade enzimática. Adicionalmente, a topologia da Xac0573 é semelhante do domínio C2, conhecido em eucariotos como domínio de ligação ao lipídio e ao cálcio, e está envolvido em processos de sinalização de segundos mensageiros lipídicos, proteínas de trafego de membranas e mecanismos de fusão de membranas. Nossos resultados apontam para uma nova função biológica do domínio C2 como um inibidor enzimático intracelular em bactérias

The type IV secretion system (T4SS) of the bacteria family Xanthomonadaceae transfers effectors (X-Tfes) with that can kill other bacterial cells, conferring an advantage to the bacterial community during colonization of different niches in the soil or on the plant surface. The X-Tfes possess different putative domains with hydrolytic activity against components of the bacterial cellular envelope, including glycohydrolase, transglycolase, amidase and lipase domain. The innate biological activity of X-Tfes can cause intracellular damage. Therefore, the bacteria that produce them also produce lipoproteins with inhibitor function (X-Tfis) located in the periplasm for their protection. The genes that code for X-Tfes and X-Tfis are organized in operons that allow for their simultaneous expression. Among the X-Tfes of the phytopathogen Xanthomonas citri are Xac1918 and Xac0574. Xac1918 is carries a lysozyme superfamily domain, as well as a domain known as RTX (Repeats in Toxic) predict to bind calcium, while, Xac0574 has a domain belonging to the lipase 3 superfamily. Their possible inhibitors, Xac1917 e Xac0573 respectively, carry an N-terminal signal peptide containing a lipobox found in bacterial lipoproteins. The Xac0574 and Xac0573 proteins are both monomers in solution, They can form a stable 1:1 complex, that is thermodynamically favored (ΔG°= -12 Kcal/mol) with a dissociation constant of 2,45 nM. This affinity ensure that the bacterium is protected against the harmful effects of Xac0574 when it is produced intracellularly. We show that Xac0574 is a phospholipase A1, without lisophospholipase activity, and is able to hydrolyze the three most common phospholipids found in the membranes of Gram negative bacteria, namely phosphatidylglycerol (PG), cardiolipin and phosphatidylethanolamine (PE), presenting an apparent preference for PE. The enzymatic activity of Xac0574 explains the strong inhibition of growth of E. coli cells after its heterologous induction: a nearly 10-fold decrease in the cell population is observed when compared to the non-induced culture with the same construct. On the other hand, Xac0573 effectively inhibits the enzymatic activity of Xac0574. Furthermore, Xac0573 does not possess when forming the complex, besides not having phospholipase nor lysophospholipase activity.Crystals of Xac1918 and Xac0573 were produced which diffracted with to resolution of 3.0 and 2.5 Å, respectively. However, we were able to resolve the structure of only Xac0573. Xac0573 is composed of two anti-parallel sheet that form a ß-sandwich with three small helices. An alignment to Xac0573 homologs identified conserved regions at the ends of the protein that constitute two possible interfaces of interaction that may be responsible for blocking the access of the phospholipids to the catalytic site or impede the structural rearrangements of Xac0574 that are necessary for its enzymatic activity. Additionally, the topology of Xac0573 is similar to that to C2 domains, known in eukaryotes to bind lipids and calcium and to be involved in signaling processes mediated by lipid second messengers, membrane trafficking and membrane fusion mechanisms. Our results point to a new biological function of the C2 domain as an intracellular enzyme inhibitor in bacteria

Estudos funcionais e bioquímicos sobre o reconhecimento e inibição de efetores de um sistema de secreção tipo IV de Xanthomonas citri subsp. citri. / Functional and biochemical son the recognition and Inhibition of effectors of a Type IV secretion System of Xanthomonas citri subsp. citri

Sistemas de Secreção Tipo IV (T4SSs), normalmente compostos por 12 proteínas (VirB1-VirB11 e VirD4) são tipicamente associados às funções de conjugação bacteriana e transferência de fatores de patogenicidade para células hospedeiras. Mas também, muitas espécies da ordem Xanthomonadales possuem um T4SS associado a matar bactérias. O modelo atual de morte de uma célula-alvo mediada pelo T4SS é baseado na secreção de toxinas denominadas XVIPs ("Xanthomonas VirD4 interacting proteins") ou X-Tfe (Xanthomonadaceae-T4SS effector) no qual cada XVIP/X-Tfe apresenta uma proteína de imunidade cognata denominada X-Tfi (Xanthomonadaceae-T4SS immunity protein). Demonstramos que um XVIP, XAC2609, é secretado através do T4SS de modo que depende de contato célula-célula e do seu domínio XVIPCD ("XVIP conserved domains"). A porção N-terminal de XAC2609 codifica um domínio GH19 que cliva a peptideoglicana de E. coli, mas perde a sua atividade na presença do seu inibidor cognato, o X-Tfi XAC2610. Portanto, XAC2609/XAC2610 formam um par de proteínas efetora/imunidade associado ao T4SS de X. citri. Através de diferentes técnicas de microscopias utilizando a cepa Δxac2610, foi observado que XAC2610 protege o envelope celular de X. citri contra efeitos de autólise celular promovidos pela atividade de XAC2609. Ensaios funcionais baseados nas observações de fenótipos de colônias e de formação de biofilme mostraram que XAC2610 confere imunidade para X. citri contra uma atividade 7 intrínseca de XAC2609. A proteína com o papel de reconhecer os substratos através da interação com os sinais de secreção do T4SS é VirD4. No T4SS de X. citri, existe a hipótese de que o domínio XVIPCD seja o sinal de secreção presente nas XVIPs. Logo, os aspectos bioquímicos e biofísicos da interação VirD4-XVIPCD foram investigados através de experimentos de co-purificação por cromatografia de afinidade e exclusão molecular, RMN e SAXS. Demonstramos que o domínio AAD de VirD4 (VirD4AAD) está associado a interagir especificamente com o domínio XVIPCD de XAC2609 (XAC2609XVIPCD), formando um heterodímero em solução. VirD4AAD é um domínio globular e monomérico e XAC2609XVIPCD é desenovelado mas se enovela concomitante à interação com VirD4AAD. Construções de XAC2609 contendo mutações pontuais no domínio XVIPCD foram utilizadas em ensaios in vivo de secreção pela X. citri e ensaios in vitro de interação com VirD4AAD por titulação monitorada por calorimetria isotérmica (ITC). Através desses experimentos, observamos que uma forte interação entre VirD4AAD-XAC2609XVIPCD é essencial para secreção de XAC2609 via o T4SS. Esses resultados permitem concluir que o domínio XVIPCD é o sinal de secreção dos substratos do T4SS de X. citri e que o AAD confere especificidade à VirD4 por interagir com o XVIPCD. Finalmente, através de ensaios de competições bacterianas entre E. coli e X. citri, foram observados diferentes fenótipos associados à função do T4SS: i) nocautes gênicos das subunidades estruturais VirB5, VirB11 abolem a função do T4SS em X. citri.; ii) nocautes de xac2611, apresentaram uma maior vantagem adaptativa do que a cepa selvagem de X. citri em competições e a expressão epissomal de XAC2611 inibe fortemente a função do T4SS e iii) a atividade ATPásica de VirD4 é essencial para a função do sistema e a expressão de mutantes 8 de VirD4 exerce um fenótipo de dominância negativa sobre a função do T4SS em X. citri

The Type IV secretion System (T4SS) is typically associated with the function of bacterial conjugation and as a pathogenicity factor. T4SSs are normally composed of 12 proteins, VirB1-VirB11 and VirD4. Many species of the order Xanthomonadales possess a T4SS associated with killing bacteria. The current model of the T4SS killing is based on the secretion of toxins denominated XVIPs/X-Tfes (Xanthomonas VirD4 interacting proteins) /(Xanthomonadaceae-T4SS effector) in which each XVIP/X-Tfe has a cognate immunity protein denominated X-Tfi (Xanthomonadaceae-T4SS immunity protein). We demonstrate that an XVIP, XAC2609, is secreted through the T4SS so that it depends on cell-cell contact and its XVIPCD domain ("XVIP conserved domains"). The N-terminal portion of XAC2609 encodes a GH19 domain which cleaves the E. coli peptidoglycan but loses its activity in the presence of its cognate inhibitor, X-Tfi XAC2610. Therefore, XAC2609 /XAC2610 form a pair of effector/immunity proteins associated with X. citri T4SS. By using the X. citri Δxac2610 strain, has been shown through different microscopic techniques that XAC2610 protects the cell envelope of X. citri against the effects of cellular autolysis promoted by XAC2609 activity. Functional assays based on observations of colony phenotypes and biofilm formation has shown that XAC2610 confers immunity to X. citri against an intrinsic activity of XAC2609. VirD4 is the protein that recognizes the substrates through the interaction with the T4SS secretion signals. In the T4SS of X. citri, is hypothesized that the XVIPCD domain is the secretion signal present in the XVIPs. Here, the biochemical and biophysical aspects of the VirD4-XVIPCD interaction were investigated through Pull- Down, Molecular Exclusion Chromatography, NMR and SAXS assays. It has been shown the AAD domain of VirD4 (VirD4AAD) is associated with specifically interacting with the XAC2609XVIPCD domain (XAC2609XVIPCD), forming a heterodimer in solution. VirD4AAD is a globular and monomeric domain while XAC2609XVIPCD is elongated, but upon interaction with VirD4AAD goes through structural compaction process. Constructs of XAC2609 containing point mutations in the XVIPCD domain were used to perform secretion experiments in X. citri and Isothermal titration calorimetry against VirD4AAD. Through these assays, it has been characterized that a strong interaction between VirD4AAD-XAC2609XVIPCD is essential for secretion of XAC2609 via T4SS. Consequently, these results allow concluding that the XVIPCD domain is the secretion signal of X. citri T4SS substrate and the AAD confer specificity to VirD4 by interact with the XVIPCD domains. Finally, bacterial competitions between E. coli and X. citri showed different phenotypes associated with T4SS function: i) virB5, virB11 knockouts abolish the function of T4SS in X. citri.; ii) knockouts of xac2611 exhibited a higher adaptive efficiency than the wild-type X. citri strain in competitions, but the expression of XAC2611 abolishes the function of T4SS in the wild strain of X. citri; iii) The ATPase activity of VirD4 is essential and exerts a negative dominance over the T4SS function in X.citri

Acinetobacter baumannii: Resistencia y Virulencia mediada por el Sistema de Secreción Bacteriano Tipo IV / Acinetobacter baumannii: Resistance and Virulence mediated through bacterial type IV secretion system

Introducción: Los sistemas de secreción bacterianos tipo IV tienen una variedad de funciones biológicas como el intercambio de material genético con otras bacterias y la translocación de ADN virulento, con sus proteínas efectoras, dentro de las células del huésped. Acinetobacter baumannii es un patógeno que causa infecciones en humanos y registra porcentajes altos de multiresistencia a fármacos. Objetivo: Relacionar el conocimiento so- bre los sistemas de secreción tipo IV con los patrones de resistencia y virulencia de Acinetobacter baumannii. Materiales y Métodos: Se realizó una buscada en PMC (NCBI) utilizando un conjunto de palabras claves. Resultados: De 133 artículos se analiza - ron 14 para establecer la relación entre los sistemas de secreción microbiano y la resistencia y virulencia de A. baumannii . Conclusiones: Los sistemas de secreción bacterianos tipo IV presentes en A. bau - mannii son una pieza clave en el enten - dimiento de los patrones de virulencia y resistencia...(Au)

Introduction: Type IV Bacterial Secretion Systems (TFSS) have a variety of biolo- gical functions such as the exchange of genetic material with other bacteria and virulent translocation of DNA with its effector proteins into host cells. A. bauman - nii is a pathogen that causes infections in humans and exhibits high rates of multidrug resistance to drugs. Objective: To relate how type IV secretion systems is associated with patterns of resistance and virulence in A. baumannii. Materials and Methods: Exhaustive search in PMC (NCBI) using a set of keywords was performed. Results: The search yielded 133 articles. Fourteen articles were analysed to deter - mine the bacterial secretion system and the resistant and virulence of AA. baumannii. Conclusions: Systems of bacterial type IV secretion present in A. baumannii are crucial in understanding the patterns of virulence and resistance...(Au)

In silico identification of potential chaperone genes that belong to type III and type IV secretion systems in Xanthomonas axonopodis pv citri

The secretion of bacterial virulence factors and flagellar components requires the assistance of specific type III and flagellar chaperones. Standard computational annotation of the genome of Xanthomonas axonopodis pv citri, a plant pathogen that causes citrus canker, initially did not identify any genes belonging to these chaperone categories since the primary sequence homology between them was very low. However, in a search for hypothetical proteins with characteristics similar to these chaperones, we have now identified 30 chromosomal and 10 plasmidial potential genes encoding chaperones belonging to types III/IV, and flagellar secretion systems in this organism. The significance of these findings is discussed.