RESUMO
Proteins equipped with flavin adenine dinucleotides (FAD) or flavin mononucleotides (FMN) are named flavoproteins and constitute about 1% of all existing proteins. They catalyze redox, acid-base and photochemical reactions in a variety of biochemical phenomena that goes from energy metabolism to DNA repair and light sensing. The versatility observed in flavoproteins is ultimately a balance of flavin intrinsic properties modulated by a protein environment. This thesis aims to investigate how flavoproteins work by systematic evaluating flavin properties and reactivity. In particular, the mechanism of fumarate reduction by the flavoenzyme fumarate reductase Fcc3 was determined. Electronic-structure calculations were used for this task based on rigorous calibration with experimental data and error assessment. Flavin properties at chemical accuracy were obtained with single reference coupled-cluster CCSD(T) calculations at the complete basis set limit. Density functional theory was demonstrated an excellent alternative with lower computational costs and slightly less accuracy. Flavin protonation and tautomerism were shown to be important modulators of flavin properties and reactivity, with the possibility of various tautomers existing at neutral pH. Regarding flavin redox properties, an analysis based on multiconfigurational wave function weights was proposed for categorizing flavin redox reactions as hydride or hydrogen-atom transfers. This analysis is an upgrade over traditional partial charges methods and can be applied not only to flavin reactions but to any protoncoupled electron transfer. In the investigation of the enzymatic mechanism of fumarate reduction, the reaction was determined as a nucleophilic addition by hydride transfer with carbanion formation. Fumarate reductase employs electrostatic catalysis in contrast to previous proposals of substrate straining and general-acid catalysis. Also, hydride transfer was shown to be vibronically adiabatic with low tunneling contribution. These findings give new insights into the mechanisms of fumarate reductases and provide a framework for future computational studies of flavoproteins in general. The analyses and benchmark studies presented can be used to build better models of properties and reactivity of flavins and flavoproteins
Proteínas equipadas com dinucleotídeos de flavina-adenina (FAD) e mononucleotídeos de flavina (FMN) são chamadas flavoproteínas e constituem cerca de 1% de todas as proteínas existentes. Elas catalisam reações redox, ácido-base e fotoquímicas numa variedade de fenômenos bioquímicos que vão desde o metabolismo energético até reparo de DNA e captação de luz. A versatilidade observada em flavoproteínas é em última instância um balanço das propriedades intrínsecas de flavinas moduladas por um ambiente proteico. Esta tese busca investigar como flavoproteínas funcionam através de avaliações sistemáticas de propriedades e reatividade de flavinas. Em particular, o mecanismo de redução de fumarato pela flavoenzima fumarato redutase Fcc3 foi determinado. Cálculos de estrutura eletrônica foram usados para esta tarefa com base em rigorosa calibração com dados experimentais e avaliação de erros. As propriedades de flavinas foram determinadas com acurácia química com cálculos monoconfiguracionais de coupled-cluster CCSD(T) no limite de conjunto base completo. A teoria do funcional da densidade mostrou-se uma alternativa excelente com menor custo computacional e um pouco menos de acurácia. Protonação e tautomerismo de flavinas mostraram-se moduladores importantes de suas propriedades e reatividade, com a possibilidade de vários tautômeros existirem em pH neutro. Em relação às propriedades redox de flavinas, uma análise baseada nos pesos de funções de onda multiconfiguracionais foi proposta para categorizar as reações redox de flavinas como transferências de hidreto ou hidrogênio. Esta análise é uma melhoria em relação aos métodos tradicionais de cargas parciais e pode ser aplicada não apenas para reações de flavinas mas para qualquer transferência de próton acoplada a elétrons. Na investigação do mecanismo enzimático de redução de fumarato, a reação foi designada como uma adição nucleofílica por transferência de hidreto e formação de carbânion. A fumarato redutase usa catálise eletrostática diferentemente de prospostas anteriores envolvendo distorção do substrato e catálise ácida geral. Além disso, a transferência de hidreto mostrou-se vibronicamente adiabática com pouca contribuição de tunelamento. Estas descobertas abrem novas perspectivas sobre os mecanismos de fumarato redutases e fornecem uma base para estudos computacionais futuros sobre flavoproteínas em geral. As análises e estudos comparativos apresentados podem ser usados para construir melhores modelos para propriedades e reatividade de flavinas e flavoproteínas
Assuntos
Estudo Comparativo , Flavinas/análise , Flavoproteínas/análise , Cálculos/química , Eletricidade Estática/efeitos adversos , FumaratosRESUMO
Strains of
Assuntos
Ar Condicionado , Proteínas de Bactérias/genética , RNA Polimerases Dirigidas por DNA/genética , Francisella , Flavoproteínas/genética , Microbiologia da Água , Sequência de Bases , China , DNA Bacteriano/genética , DNA Ribossômico/genética , Francisella/classificação , Francisella/genética , Francisella/isolamento & purificação , Dados de Sequência Molecular , Tipagem Molecular , Filogenia , /genética , Análise de Sequência de DNARESUMO
Variegate porphyria (VP) results from a hereditary deficiency of protoporphyrinogen oxidase (PPOX) that is transmitted in an autosomal dominan fashion. The diagnosis is based on the clinical symptoms and is confirmed biochemically. Sometimes, however, these diagnostic tools reveal limitations in establishing the definitive diagnosis of the prevailing type of acute porphyria. In these patients, molecular genetic analyses can be useful. We performed molecular genetic studies in 13 Chilean families by PCR amplification of the PPOX gene, conformation sensitive gel electrophoresis, and automated DNA sequencing. In five symptomatic patients from different families, respectively, the biochemical data confirmed the diagnosis of VP. In seven other families, however, the biochemical studies were not conclusive. Furthermore, the original biochemical analysis in one clinically severely affected patient from a further family even suggested the diagnosis of erythropoietic protoporphyria (EPP). Beside the respective index patients, we studied 78 asymptomatic family members and 50 healthy, unrelated individuals for control purposes. In five families, the previous diagnosis of VP could be confirmed genetically. Further, half of the asymptomatic relatives revealed a mutation in the PPOX gene, consisting of three missense mutations and two deletion mutations. Mutation R168H that had been already described previously in German VP families was found in a Chilean family of German origin. Further, two novel missense mutations, designated L74P and G232S, could be detected. In four Chilean families, we found the deletion 1330deICT that had also been previously described in three Swedish VP families. The second deletion, 1239delTACAC, has not been described anywhere else but Chile and could be identified in seven families. One patient who was initially diagnosed with EPP turned out to be a compound heterozygote for mutations on both alíeles of the PPOX gene. In conclusion, our molecular genetic analyses unequivocally confirmed the diagnosis of VP in seven families who originally had revealed inconclusive biochemical data. Further, early genetic analysis allows for the identification of asymptomatic mutation carriers, thereby offering the possibility of adequate counselling and the prevention of potentially life-threatening acute porphyric attacks.
La porfiria variegata (PV), enfermedad de origen genético con forma de herencia autosómica dominante, se debe a deficiencia en la actividad protoporfirinógeno oxidasa (PPOX). Su diagnóstico se basa en antecedentes clínicos y se confirma con análisis bioquímicos. Éstos, en algunos casos, pueden presentar limitaciones para establecer el diagnóstico definitivo de la variedad de porfiria aguda, situación en que el estudio genético molecular puede resultar útil. Se efectuó estudio genético en trece familias chilenas usando amplificación del gen PPOX por PCR, electroforesis conformacional y secuenciación automática de DNA. Cinco de estas familias incluían pacientes índices sintomáticos con diagnóstico bioquímico establecido de PV; otras siete familias incluían pacientes índices con estudio bioquímico no concluyente de la variedad de porfiria aguda y, finalmente, una familia con diagnóstico previo de protoporfiria eritropoyética (PPE). Además, se estudiaron 78 familiares asintomáticos y 50 personas sanas, no relacionadas, como controles. En cinco familias el estudio genético confirmó el diagnóstico bioquímico previo de PV. El 50% de los familiares asintomáticos resultaron ser portadores de una mutación en el gen PPOX. Se identificaron tres mutaciones por sustitución de bases: la R168H, descrita en familias de origen alemán y dos nuevas mutaciones, designadas L74P y G232S. También se identificaron dos mutaciones por deleción de bases designadas 1330delCT y la 1239delTACAC. La primera, que había sido descrita previamente en tres familias suecas, se encontró en cuatro familias chilenas. La segunda se encontró en siete familias y no ha sido descrita previamente. El estudio genético permitió mostrar que un paciente que originalmente fue diagnosticado con PPE correspondía a un heterocigoto compuesto para dos mutaciones en el gen PPOX. En conclusión, los estudios moleculares permitieron confirmar el diagnóstico de PV en cinco familias, efectuar diagnóstico de PV en familias en las cuales los datos bioquímicos no eran concluyentes, corregir el diagnóstico original en una familia e identificar portadores asintomáticos entre los familiares de los pacientes índices. Los estudios genéticos moleculares ayudan a realizar un adecuado consejo genético a pacientes y familiares y hace posible practicar prevención de las crisis agudas de porfiria, las que son potencialmente mortales.
