Modificações pós-traducionais durante o processo de amastigogênese do Trypanosoma cruzi / Post-translational modifications during the amastigogenesis of Trypanosoma cruzi

A doença de Chagas é uma doença negligenciada causada pelo protozoário Trypanosoma cruzi constituindo-se em um problema de saúde pública em vários países da América Latina. No seu complexo ciclo de vida, o protozoário passa por quatro estágios diferentes: tripomastigota metacíclica, amastigota, tripomastigota sanguíneo e epimastigota, que permitem sua sobrevivência nos diferentes ambientes com os quais o parasita entra em contato. A diferenciação dos tripomastigotas de T. cruzi em amastigotas (amastigogênese) ocorre com grandes mudanças morfológicas, estruturais e metabólicas no parasita e pode ser reproduzido in vitro por exemplo, pela acidificação do meio extracelular. Apesar dos vários trabalhos descritos na literatura, o processo ainda não é totalmente compreendido. A participação de NO na transdução de sinal durante a amastigogênese, sugerida por dados não publicados de nosso grupo, assim como a via de sinalização dependente de AMPc, foram o foco do presente estudo. A indução da amastigogênese foi obtida por incubação de tripomastigotas em meio de cultura acidificado (pH 6,0) e os parâmetros estudados comparados com parasitas controle (meio de cultura, pH 7,4). Estudamos a variação no perfil de nucleotídios cíclicos (AMPc, GMPc), de quinases (PKA, MAPK- ERK1/2), de uma fosfatase (PP2A), assim como o perfil de proteínas fosforiladas, S-nitrosiladas e nitradas até 6 h do início da amastigogênese. O processo foi dividido nas etapas: inicial (até 60 minutos) e tardio (em torno de 3-4 h), caracterizados por um aumento de formas amastigotas na etapa tardia. Houve um aumento de aproximadamente 17 vezes no nível de AMPc nos primeiros 15 minutos da amastigogênese (meio pH 6,0), seguido por aumento discreto no nível de PKA fosforilada, utilizado como indicador de atividade enzimática, este mais evidente na etapa tardia (360 minutos). Quanto à subunidade catalítica fosforilada da MAPK (ativa), há uma aparente diminuição no nível de fosforilação na fase inicial (30 minutos) e aumento na etapa tardia (120 minutos) do processo de amastigogênese. Quanto ao perfil geral de fosforilação de proteínas, há uma diminuição de fosforilação em torno de 30 minutos, seguida de aumento de fosforilação em proteínas de aproximadamente 5 e 100 kDa, mas de maneira geral, não se observaram grandes mudanças nesse perfil com a metodologia utilizada. Quanto às modificações por NO e seus derivados, foram observadas modificações por S-nitrosilação e nitração das proteínas, além do aumento de GMPc em torno de 60 minutos. Embora essas modificações modulem a atividade biológica de uma grande diversidade de proteínas, seu papel biológico não foi explorado.8 Em resumo, nossos resultados apontam para uma variação no perfil de fosforilação, S-nitrosilação e nitração de proteínas, além do aumento de AMPc e GMPc ao longo do processo de amastigogênese in vitro, com a via de sinalização dependente de quinases/ fosfatases e de óxido nítrico ocorrendo ao longo do processo de amastigogênese

Chagas disease is a neglected disease caused by the parasite Trypanosoma cruzi and is a public health problem in several Latin American countries. In its complex life cycle, the protozoan goes through four different stages: metacyclic trypomastigote, amastigote, blood trypomastigote and epimastigote, which allow its survival in the different environments which the parasite comes into contact. The differentiation of T. cruzi trypomastigotes into amastigotes (amastigogenesis) occurs with large morphological, structural and metabolic changes in the parasite and can be reproduced in vitro by, for example, acidification of the extracellular medium. Despite the many data described in the literature, the process is not yet fully understood. The participation of NO in signal transduction during amastigogenesis, suggested by unpublished data from our group, as well as the cAMP-dependent signaling pathway, were the focus of the present study. The induction of amastigogenesis was obtained by incubating trypomastigotes in acidified culture medium (pH 6.0) and the studied parameters compared with control parasites (culture medium, pH 7.4). We studied the variation in the profile of cyclic nucleotides (cAMP, cGMP), kinases (PKA, MAPK-ERK1 / 2), phosphatase (PP2A), as well as the profile of phosphorylated, S-nitrosylated and nitrated proteins up to 6 h. onset of amastigogenesis. The process was divided into early (up to 60 minutes) and late (around 3-4 hours), characterized by an increase in amastigote forms in the late stage. There was an approximately 17-fold increase in cAMP level in the first 15 minutes of amastigogenesis (pH 6.0 medium), followed by a slight increase in phosphorylated PKA level, most evident in the late stage (360 minutes). As for the phosphorylated catalytic subunit of MAPK (active), there is an apparent decrease in the phosphorylation level in the early phase (30 minutes) and increase in the late stage (120 minutes) of the amastigogenesis process. As for the general protein phosphorylation profile, there is a decrease in phosphorylation around 30 minutes, followed by an increase in phosphorylation of proteins (approximately 5 and 100 kDa), but overall, no major changes were observed in this profile with the methodology used. As for modifications by NO and its derivatives, modifications were observed by S-nitrosylation and protein nitration, besides the increase of cGMP around 60 minutes. Although these modifications modulate the biological activity of a wide range of proteins, their biological role has not been explored. In summary, our results point to a variation in phosphorylation, S-nitrosylation and nitration profile of proteins, as well as an increase in cAMP and cGMP along the amastigogenesis process, implicating kinases / phosphatases and nitric oxide dependent signaling pathways in this differentiation

Modulação da eosinopoiese por mecanismos dependentes de INOS e CD95Lcontribuição da sinalização dependente de AMP cíclico / Modulation of eosinophilopoiesis by mechanisms dependent and INOS CD95Lcontribuição of cyclic AMP dependent signaling

A produção exacerbada de eosinófilos na medula óssea sustenta a inflamação crônica na asma, compensando a eliminação apoptótica de eosinófilos maduros no sítio inflamatório. Diferentes fatores que modulam a maturação terminal ou a apoptose em eosinófilos influenciam tanto o processo de doença como a resposta terapêutica. Trabalhos publicados anteriormente pelo nosso grupo mostram que a Prostaglandina E2 (PgE2), mediador inflamatório presente na asma, e capaz de ativar a produção de AMPc através de mecanismos mobilizados por receptores de superfície, é capaz de induzir apoptose durante a diferenciação de eosinófilos. Esta indução depende da isoforma indutível da NO sintase (iNOS) e do ligante de CD95. No presente trabalho, fármacos que induzem a produção de AMPc, por mecanismos tanto dependentes como independentes de receptores, foram usados para definir se todos eles compartilham os mesmos efeitos e vias de sinalização previamente descritos no caso da PgE2. Os resultados mostram que, após a acumulação intracellular de AMPc, independentemente do processo bioquímico subjacente, ocorre produção de óxido nítrico de forma iNOS-dependente, seguida por ativação da via pró-apoptótica envolvendo CD95, culminando na morte dos eosinófilos em curso de diferenciação.

Receptores beta-adrenérgicos no sistema cardiovascular / Beta-adrenoceptors function in the cardiovascular system

RESUMO:Os receptores beta-adrenérgicos (beta-AR) integram um sistema proteico ternário: beta-AR, proteína G de acoplamento e enzimas como a adenilato-ciclase (AC) que produz o 3'-5' monofosfato de adenosina (AMPc). O principal mecanismo de ação do AMPc é a ativação da proteína quinase A (PKA), capaz de fosforilar inúmeros substratos. Em células endoteliais, a ativação dos beta-AR promove o aumento dos níveis citoplasmáticos de Ca+2 favorecendo a ligação do Ca+2 com a calmodulina e deste complexo com a enzima óxido nitrico sintase endotelial (eNOS), resultando na produção de NO. A ativação beta3-AR no músculo liso vascular e conseqüente ativação da PKA reduz a concentração citoplasmática de Ca+2 e a sua afinidade pela calmodulina, resultando no relaxamento vascular.. Os receptores beta-AR podem ser agrupados em beta-AR clássicos (beta1 e beta2) e beta-AR atípicos (beta3 e beta4), Os agonístas beta-AR são classificados em não seletivos (isoprenalina), seletivos beta1 (xamoterol) e seletivos beta2 (terbutalina, salbutamol) e podem ser usados em várias situações clínicas, como broncodilatadores ou como estimulantes cardíacos. O desenvolvimento de agonistas beta3-AR como BRL-37344, CGP 12177 e CL 316243, bem como de antagonistas beta-AR têm merecido especial atenção devido à sua eficácia no tratamento da hipertensão arterial, certas arritmias cardíacas e ísquemia cardiaca. A busca por antagonistas seletivos resultou na síntese de vários compostos como: atenolol, bisoprolol, betaxolol, practolol e CFP20712A (antagonistas beta1-AR seletivos), ICI 118551 (antagonista beta2-AR seletivo), SR59230A (antagonista beta3-AR seletivo), bupranolol e CGP20712A (antagonistas beta4-AR seletivos).

Efecto de la interleucina 1 y del interferon gamma sobre los osteoclastos / Effects of interleukin-1 and gamma-interferon on the osteoclasts

La función y formación de las células miltinucleadas (CMN) y osteoclastos, están reguladas por las hormonas osteotrópicas clásicas -(Hormona Paratiroidea (HPT), Calcitonina (CT) y 1.25-Dihidroxivitamina D3 (1,25-d3)- así como por la interleucina 1 (IL-1) y el interferón gamma (IFN-g). la HPT, la 1,25-d3 y la IL-1 estimulan la formación de CMN en cultivos de médula ósea, en tanto que el IFN-g inhibe el proceso. La interacción coordinada entre esas citocinas y las hormonas osteotrópicas clásicas regulan, a través de los osteoblastos, el fenómeno de acoplamiento. Este es particularmente importante en aquellos padecimientos como la osteoporosis idiopática, la artritis reumatoide, el mieloma múltiple y la endometriosis, caracterizados por un exceso de IL-1, metabolismo anormal de IFN-g y osteolisis exgerada. Las interleucinas, la CT, el antiestrógeno tamoxifen, los niveles intracelulares de calcio (Ca2+) y la prostaglandina E2(PGE2) alteran la concentración de monofosfato cíclico de adenosina intracelular (AMPc), en las CMN y consecuentemente, la capacidad osteoclástica de estos elementos.

Variations of the cAMP levels in fish ovaries: effect of human chorionic gonadotropin in vitro and of haloperidol in vivo

Se ha desarrollado un ensayo para la determinación de la actividad gonodotrópica en peces hembra, basado en la medición de las variaciones de AMPc en ovario, por medio de un método de radiocompetición proteica. Con ovarios de Cichlasoma facetum, se establecieron las condiciones para la inducción in vitro con gonadotrofina coriónica humana (hCG): 1) preincubación en 1 ml de medio a 30MC durante 60 m; 2) incubación en 1 ml de medio con HCG a 30§C durante 60 m. Este esuqema fue usado en ovarios de Betta splendens de 3-4 meses de edad sexualmente maduras. En una serie de experimentos, se determinó que 50 UI o más de hCG por tubo de incubación, producen un aumento significativo de AMPc con respecto a los controles y que la respuesta es dosis dependiente. El efecto de una inyección intraperitoneal de haloperidol, un antagonista de la dopamina, se estudió en hembras Betta splendens de 3-4 meses de edad sexualmente maduras. Con bajas dosis se observó una tendencia al aumento de AMPc (1 microng/gm de peso corporal) y con mayores dosis (10 microng/gm de peso corporal) hubo un aumento significativo luego de 6 h de la administración. No se observó respuesta a las 24 h. Este trabajo muestra que, como en otros teleósteos, la dopamina actúa como un factor inhibidor de la liberación de gonadotrofina hipofisaria (GRIF) en B. splendens, dado que la admistración de haloperidos induce un aumento de la actividad gonadotrópica