Evaluation of serum microRNA-30e-5p expression in systemic lupus erythematosus and its association with clinical manifestations: A cross-sectional study / Evaluación de la expresión del microARN-30e-5p sérico en el lupus eritematoso sistémico y su asociación con las manifestaciones clínicas: un estudio transversal

ABSTRACT Background: MicroRNAs (miRNAs) are non-coding RNAs that regulate gene expression post-transcriptionally. Accumulating evidence indicates that the miR-30 family takes part in the development of multiple tissues and organs, and is a potential contributor to various dis eases, including autoimmune disorders such as systemic lupus erythematosus (SLE). The aim of this study was to evaluate the expression of miR-30e-5p, a member of the miR-30 fam ily, and investigate its potential relationship to clinical characteristics and possible disease activity in an Egyptian SLE cohort. Methods: Serum samples from 40 SLE patients and 37 age and gender matched healthy sub jects were tested for miR-30e-5p expression level using the Taqman quantitative reverse transcription-polymerase chain reaction. Analysis was performed using the 2 - AACT method. Results: The mean age of the patients was 28.7 ± 7.9 years, with a mean disease duration of 6.4 ±5.3 years. The median fold change in serum miR-30e-5p among our SLE cohort was significantly higher 1.748 (0.223-20.485) compared to the control group 0.877 (0.058-3.522) (P = 0.02). Receiver operating characteristic curve analysis revealed that miR-30e-5p expres sion level can discriminate SLE patients from controls at a cut-off value >1.06 with the area under the curve (AUC) = 0.676 (95% CI: 0.559-0.794, P = 0.02), with 64.3% sensitivity and 61.5% specificity. There was no correlation between any of the demographic features, clinical manifestations (apart from serositis, P = 0.013) or disease activity and miR-30e-5p levels. Conclusion: Our study demonstrated elevated miR-30e-5p expression levels in serum sam ples of SLE patients. Apart from serositis, it was not associated with any other disease characteristics.

RESUMEN Antecedentes: Los microARN (miRNA) son ARN no codificantes que regulan la expresión de los genes después de la transcripción. Las pruebas acumuladas indican que la familia de miR-30 participa en el desarrollo de múltiples tejidos y órganos, y es un posible contribuyente a diversas enfermedades, incluidos los trastornos autoinmunes como el lupus eritematoso sistémico (LES). El objetivo de este estudio fue evaluar la expresión del miR-30e-5p, un miembro de la familia miR-30, e investigar su posible relación con las características clínicas y la posible actividad de la enfermedad en una cohorte egipcia de LES. Métodos: Se analizaron muestras de suero de 40 pacientes con LES y 37 sujetos sanos de edad y sexo similares para determinar el nivel de expresión de miR-30e-5p, utilizando la reacción en cadena de la polimerasa de transcripción inversa cuantitativa Taqman. El análisis se llevó a cabo empleando el método 2-AACT. Los resultados: La edad media de los pacientes fue de 28,7 ± 7,9 años, mientras que la duración media de la enfermedad fue de 6,4 ± 5,3 años. La mediana del cambio de pliegue del suero miR-30e-5p entre nuestra cohorte de LES fue significativamente mayor, 1,748 (0,223-20,485), en comparación con el grupo de control, 0,877 (0,058-3,522) (p = 0,02). El análisis de la curva característica de funcionamiento del receptor reveló que el nivel de expresión del miR-30e-5p puede discriminar a los pacientes con LES de los controles en un valor de corte > 1,06, con el área bajo la curva (AUC) = 0,676 (IC del 95%: 0,559-0,794; p = 0,02), una sensibilidad del 64,3% y una especificidad del 61,5%. No hubo asociación entre ninguna de las características demográficas, manifestaciones clínicas (aparte de la serositis, p = 0,013) o actividad de la enfermedad y los niveles de miR-30e-5p. Conclusión: Nuestro estudio demostró niveles elevados de expresión de miR-30e-5p en mues tras de suero de pacientes con LES. Aparte de la serositis, no se asoció con ninguna otra característica de la enfermedad.

Antisense noncoding mitochondrial RNA-2 gives rise to miR-4485-3p by Dicer processing in vitro

BACKGROUND: The antisense noncoding mitochondrial RNAs (ASncmtRNAs) derive from the mitochondrial 16S gene. Knockdown of these transcripts with chemically-modified antisense oligonucleotides induces proliferative arrest, apoptosis and invasiveness reduction in tumor but not normal cells. One of these transcripts, ASncmtRNA-2, contains the complete and identical sequence of hsa-miR-4485-3p and, upon knockdown of this transcript, there is a strong increase in levels of this miRNA, suggesting ASncmtRNA-2 as a source for miR-4485-3p, which is supported by several evidences from our group and others, in the ex vivo setting. RESULTS: Here we show that incubation of in vitro-transcribed ASncmtRNA-2 with recombinant Dicer produces RNA fragments corresponding to hsa-miR-4485-3p, showing that Dicer binds to and processes ASncmtRNA-2, strongly supporting the hypothesis that ASncmtRNA-2 acts as a precursor for miR-4485-3p. CONCLUSION: The in vitro results presented here strengthen the hypothesis that miR-4485-3p is derived from ASncmtRNA-2 by Dicer processing. Since miR-4485-3p is classified as a tumor suppressor miRNA, this evidence strengthens the application of ASncmtRNA knockdown for cancer therapy.

Anotação e caracterização de novos transcritos expressos no adenocarcinoma de pâncreas: RNAS não-codificadores longos associados a fenótipos tumorais e clínicos e formas alternativas de splicing associados a fenótipos tumorais e clínicos / Determination of relevant transcripts in ductal adenocarcinoma of pancreas: the transcriptional landscape of the long non-coding RNAs and protein-encoding RNAs revealed by the total RNAseq analysis of pancreatic adenocarcinoma

O câncer de pâncreas (PC) é uma das doenças mais devastadoras com o pior resultado de sobrevivência quando comparada com outros tipos de câncer. É apontado como o décimo câncer mais comum e a quarta causamortis por câncer, projetando-se para ser a segunda até 2030 nos Estados Unidos e na Alemanha. O PC constitui um conjunto heterogêneo de tumores, o adenocarcinoma ductal (PDAC) constitui o tipo mais frequente da neoplasia (80%). A prevenção, detecção precoce e tratamento enfrentam sérios problemas e é urgente a identificação de novos marcadores para diagnóstico, prognóstico e estratégias terapêuticas da doença. O objetivo desse trabalho foi realizar uma análise com alta-resolução do transcriptoma do PDAC) para identificar novos RNAs não codificadores, variantes de splicing e alterações transcricionais associados à malignidade. A metodologia empregada constituiu-se de gerar bibliotecas de RNA total a partir de 14 amostras cirúrgicas pareadas de tecido tumoral (PDAC) e tecido não-tumoral adjacente para sequenciamento NGS. A partir dos dados de RNAseq foi realizada a montagem do transcriptoma utilizando-se a referência do catálogo GENCODE para classificar os transcritos. Seguiram-se análises subsequentes de avaliação de características dos transcritos: estruturais, marcas regulatórias, potencial codificador, detecção em banco de dados independente (miTrascriptome, miT). Em segundo lugar foram realizadas análises de expressão diferencial, análise de sobrevida (utilizando banco de dados públicos) para seleção de transcritos potencialmente relevantes no PDAC. Foram geradas redes de co-expressão gênicas com enriquecimento de funções biológicas. Uma série de validações foram realizadas por RT-PCR de transcritos novos intergênicos e novas formas de splicing reconstruídas e selecionadas. RT-qPCR foi utilizada para validação da expressão aberrante de lncRNAs em PDAC, silenciamentos por siRNA e subsequentes ensaios de proliferação, migração e invasão. Foi avaliada in vivo o envolvimento com crescimento tumoral por ensaio xenográfico, e avaliação da implicação em funções biológicas mais específicas, como envolvimento em reparo de DNA por ensaio cometa alcalino e avaliação de enriquecimento em tumoresferas. A montagem reconstruiu 90.522 transcritos, dos quais 41.341 são anotados no GENCODE e 6.710 transcritos são novos não anotados no GENCODE (classificado como splicingvariant, intergenic RNA, antisense RNA). Desses foram validados 6 novos lincRNAs com expressão aumentada em PDAC, dois deles (TCONS00085964 e TCONS00036574) tem a expressão correlacionada com alterações na sobrevida. Foram validadas também novas formas de splicing de MMP14, CAPN8, LIF e OCT3 com expressão aumentada em PDAC. 7 lncRNAs, anotados no GENCODE, com expressão aumentada em PDAC, desses foram implicados com fenótipo tumoral de migração, invasão e proliferação: LINC01559; LINC01133, CCAT1 e UCA1. Desses LINC01559 e CCAT1 demonstraram regular a expressão de enzimas de O-glicosilação (GALNT3 e B3GNT3) envolvidas na manutenção de células tronco-tumorais em PDAC. O lncRNA UCA1 está envolvido com reparo de DNA e envolvido com a progressão tumoral invivo. Conclui-se que a abordagem por amostras pareadas a partir de RNAseq de bibliotecas de RNA total gerou um catálogo de transcritos mais completo no PDCA e revelou IncRNAs funcionalmente implicadas na doença como LINC01559 e UCA1, ampliando o conhecimento sobre os mecanismos moleculares que sustentam fenótipos malignos no câncer de pâncreas e revelando novos biomarcadores para prognóstico

Tese de DoutoradoDOIhttps://doi.org/10.11606/T.46.2019.tde-09032020-085211DocumentoTese de DoutoradoAutorPaixão, Vinicius Ferreira da (Catálogo USP)Nome completoVinicius Ferreira da PaixãoE-mailE-mailUnidade da USPInstituto de QuímicaÁrea do ConhecimentoBioquímicaData de Defesa2019-12-04ImprentaSão Paulo, 2019OrientadorReis, Eduardo Moraes (Catálogo USP) Banca examinadoraReis, Eduardo Moraes (Presidente) Hajj, Glaucia Noeli Maroso Malnic, Bettina Panepucci, Rodrigo Alexandre Título em portuguêsAnotação e caracterização de novos transcritos expressos no adenocarcinoma de pâncreas: RNAS não-codificadores longos associados a fenótipos tumorais e clínicos e formas alternativas de splicingPalavras-chave em portuguêsAlternative splicing lncRNA PDAC Transcriptoma UCA1 Xenotumor Resumo em portuguêsO câncer de pâncreas (PC) é uma das doenças mais devastadoras com o pior resultado de sobrevivência quando comparada com outros tipos de câncer. É apontado como o décimo câncer mais comum e a quarta causamortis por câncer, projetando-se para ser a segunda até 2030 nos Estados Unidos e na Alemanha. O PC constitui um conjunto heterogêneo de tumores, o adenocarcinoma ductal (PDAC) constitui o tipo mais frequente da neoplasia (80%). A prevenção, detecção precoce e tratamento enfrentam sérios problemas e é urgente a identificação de novos marcadores para diagnóstico, prognóstico e estratégias terapêuticas da doença. O objetivo desse trabalho foi realizar uma análise com alta-resolução do transcriptoma do PDAC) para identificar novos RNAs não codificadores, variantes de splicing e alterações transcricionais associados à malignidade. A metodologia empregada constituiu-se de gerar bibliotecas de RNA total a partir de 14 amostras cirúrgicas pareadas de tecido tumoral (PDAC) e tecido não-tumoral adjacente para sequenciamento NGS. A partir dos dados de RNAseq foi realizada a montagem do transcriptoma utilizando-se a referência do catálogo GENCODE para classificar os transcritos. Seguiram-se análises subsequentes de avaliação de características dos transcritos: estruturais, marcas regulatórias, potencial codificador, detecção em banco de dados independente (miTrascriptome, miT). Em segundo lugar foram realizadas análises de expressão diferencial, análise de sobrevida (utilizando banco de dados públicos) para seleção de transcritos potencialmente relevantes no PDAC. Foram geradas redes de co-expressão gênicas com enriquecimento de funções biológicas. Uma série de validações foram realizadas por RT-PCR de transcritos novos intergênicos e novas formas de splicing reconstruídas e selecionadas. RT-qPCR foi utilizada para validação da expressão aberrante de lncRNAs em PDAC, silenciamentos por siRNA e subsequentes ensaios de proliferação, migração e invasão. Foi avaliada in vivo o envolvimento com crescimento tumoral por ensaio xenográfico, e avaliação da implicação em funções biológicas mais específicas, como envolvimento em reparo de DNA por ensaio cometa alcalino e avaliação de enriquecimento em tumoresferas. A montagem reconstruiu 90.522 transcritos, dos quais 41.341 são anotados no GENCODE e 6.710 transcritos são novos não anotados no GENCODE (classificado como splicingvariant, intergenic RNA, antisense RNA). Desses foram validados 6 novos lincRNAs com expressão aumentada em PDAC, dois deles (TCONS00085964 e TCONS00036574) tem a expressão correlacionada com alterações na sobrevida. Foram validadas também novas formas de splicing de MMP14, CAPN8, LIF e OCT3 com expressão aumentada em PDAC. 7 lncRNAs, anotados no GENCODE, com expressão aumentada em PDAC, desses foram implicados com fenótipo tumoral de migração, invasão e proliferação: LINC01559; LINC01133, CCAT1 e UCA1. Desses LINC01559 e CCAT1 demonstraram regular a expressão de enzimas de O-glicosilação (GALNT3 e B3GNT3) envolvidas na manutenção de células tronco-tumorais em PDAC. O lncRNA UCA1 está envolvido com reparo de DNA e envolvido com a progressão tumoral invivo. Conclui-se que a abordagem por amostras pareadas a partir de RNAseq de bibliotecas de RNA total gerou um catálogo de transcritos mais completo no PDCA e revelou IncRNAs funcionalmente implicadas na doença como LINC01559 e UCA1, ampliando o conhecimento sobre os mecanismos moleculares que sustentam fenótipos malignos no câncer de pâncreas e revelando novos biomarcadores para prognóstico.Título em inglêsDetermination of relevant transcripts in ductal adenocarcinoma of pancreas: the transcriptional landscape of the long non-coding RNAs and protein-encoding RNAs revealed by the total RNAseq analysis of pancreatic adenocarcinomaPalavras-chave em inglêsAlternative splicing lncRNA PDAC Transcriptome UCA1 Xenotumor Resumo em inglêsPancreatic cancer (PC) is the deadliest malignancy, one of the most devastating diseases with the worst survival outcome compared to any cancer. It is touted as the tenth most common cancer and the fourth leading cause of cancer in the United States and Germany. It is projected to be the second leading cause of cancer death in a decade. PC is a heterogeneous set of tumors with high aggressiveness and mortality. Of these tumors, ductal adenocarcinoma (PDAC) is the most frequent type of cancer (80%). Prevention, early detection and treatment face serious problems, and the identification of new markers for diagnosis, prognosis and therapeutic strategies of the disease is urgent. The aim of this study was to perform a high-resolution analysis of pancreatic adenocarcinoma (PDAC) transcriptome to identify new noncoding RNAs, splicing variants, and transcriptional changes associated with malignancy in pancreatic ductal adenocarcinoma. The methodology employed consisted of generating total RNA libraries from 14 paired surgical samples of tumor tissue (PDAC) and adjacent non-tumor tissue for NGS sequencing. From the RNAseq data, the transcriptome assembly was performed using the GENCODE catalog reference to classify the transcripts. Subsequent analyzes of evaluation of transcript characteristics were followed: structural, regulatory markers, potential encoder, independent database detection (miTrascriptome, miT). Secondly, differential expression analysis, survival analysis (using public database) were performed to select potentially relevant transcripts in the PDAC. Genic co-expression networks with biological function enrichment were generated. A series of validations were performed by RT-PCR of new intergenic transcripts and new forms of reconstructed and selected splicing. RT-qPCR was used for validation of aberrant expression of lncRNAs in PDAC, siRNA silencing and subsequent proliferation, migration and invasion assays. Involvement with tumor growth was evaluated by in vivo xenograph assay. Biological function tests to determine an involvement in DNA repair was evaluated by alkaline comet assay and was performed an evaluation of tumorsphere expression enrichment. The assembly reconstructed a total of 90,522 transcripts, of which 41,341 are noted in GENCODE. 6,710 transcripts are new (splicing variant, intergenic RNA, antisense RNA) not noted in the GENCODE reference. Of these 6 new PDAC-enhanced lincRNAs were validated, two of them (TCONS00085964 and TCONS00036574) correlated with changes in survival. New forms of splicing of MMP14, CAPN8, LIF and OCT3 with increased expression in PDAC were also validated. 7 lncRNAs noted with increased expression in PDAC were implicated with tumor migration, invasion and proliferation phenotype: LINC01559; LINC01133, LINC01614; CCAT1; LINC02577; LINC00920 and UCA1. Of these LINC01559 has been shown to regulate the expression of O-glycosylation enzymes (GALNT3 and B3GNT3) involved in maintaining CSCs in PDAC. It has been identified that UCA1 is involved with DNA repair and involved with tumor progression in vivo. It is concluded that the approach of sampling RNAseq from total RNA libraries generated a more accurate transcript catalog of PDAC and revealed IncRNAs functionally implicated in the disease, such as LINC01559 and UCA1, expanding the knowledge about the molecular mechanisms that underlie malignant phenotypes in pancreatic cancer and revealing novel prognostic biomarke

Development of a novel vector for cloning and expressing extremely toxic genes in Escherichia coli

Background: Escherichia coli has been widely used as a host to clone and express heterologous genes. However, there are few vectors available for cloning and expressing extremely toxic genes, which limits further basic and applied research on extremely toxic proteins. Results: In this study, a novel vector pAU10 was constructed in E. coli. pAU10 utilizes the combination of the efficient but highly repressible T7-lacO promoter/operator and the strong rrnBT2 transcriptional terminator upstream of the T7 promoter to strictly control unwanted transcription of the extremely toxic gene; in addition, the trp promoter/operator is oriented opposite to the T7 promoter to control the production of the antisense RNA that may block the translation of leaky mRNA. Without the supplementation of IPTG and L-tryptophan in the culture medium, transcription of the extremely toxic gene by the T7 promoter is highly repressed, and the trp promoter produces the antisense RNA, which strictly prevents unwanted expression of the extremely toxic protein in E. coli. With the supplementation of IPTG and L-tryptophan, the T7 promoter efficiently transcribes the extremely toxic gene, and the trp promoter does not produce the antisense RNA, ensuring efficient expression of the extremely toxic protein in E. coli. Tight regulation and efficiency of expression of an extremely toxic gene cloned in the vector pAU10 were confirmed by cloning and expressing the restriction endonuclease-encoding gene bamHI without its corresponding methylase gene in E. coli JM109(DE3). Conclusion: pAU10 is a good vector used for cloning and expressing extremely toxic genes in E. coli.

Identificação de perfis de expressão de RNAs codificadores e não codificadores de proteína como preditores de recorrência de câncer de próstata / Identification of protein-coding and non-coding RNA expression profiles as prognostic marker of prostate cancer biochemical recurrence

O câncer de próstata é o quinto tipo mais comum de câncer no mundo e o mais comum em homens. Fatores clínicos e anatomopatológicos atualmente usados na clínica não são capazes de distinguir entre a doença indolente e a agressiva. Existe uma grande necessidade de novos marcadores de prognóstico, a fim de melhorar o gerenciamento clínico de pacientes de câncer de próstata. Além das anormalidades em genes codificadores de proteínas, alterações em RNAs não codificadores (ncRNAs) contribuem para a patogênese do câncer e, portanto, representam outra fonte potencial de biomarcadores de câncer de próstata. Entretanto, até o momento, poucos estudos de perfis de expressão de ncRNAs foram publicados. Este projeto teve como principal objetivo identificar perfis de expressão de genes codificadores e não codificadores de proteína correlacionados com recorrência de tumor de próstata, a fim de gerar um perfil prognóstico com potencial uso como biomarcadores e elucidar o possível papel de ncRNAs no desenvolvimento do câncer. Para isso, foram analisados os perfis de expressão de genes codificadores e não codificadores de proteína de um conjunto de 42 amostras de tecido tumoral de câncer de próstata de pacientes de amostras de pacientes submetidos à prostatectomia radical, com longo acompanhamento clínico (cinco anos) e conhecida evolução da doença Nós utilizamos microarranjos por nós desenhados e fabricados pela Agilent sob encomenda, interrogando aproximadamente 18.709 transcritos não codificadores longos (>500 nt), sem evidência de splicing, que mapeiam em regiões intrônicas dentro de 5.660 loci genômicos. Os dados de expressão foram extraídos de cada arranjo, normalizados entre todas as 42 amostras de pacientes. Usando uma estratégia de múltipla amostragem, foi identificado um perfil de expressão de mau prognóstico, contendo 51 transcritos intrônicos não codificadores de proteína. O perfil prognóstico de ncRNAs foi aplicado a um conjunto teste independente de 22 pacientes...

Prostate cancer is the fifth most common type of cancer in the world, and the most common in men. Clinical and anatomo-pathological factors currently used in clinic are not able to distinguish between the indolent and the aggressive disease. There is a major need of new prognostic makers in order to improve the clinical management of prostate cancer patients. Apart from abnormalities in protein-coding genes, changes in non-coding RNAs (ncRNAs) contribute to the pathogenesis of cancer and thus represent another potential source of prostate cancer biomarkers. However, few studies of expression profiles of ncRNAs have been published. This project aimed to identify expression profiles of protein-coding and non-coding genes correlated to prostate cancer biochemical recurrence. For this, we analyzed the expression profile of 42 prostate cancer samples from patients undergoing radical prostatectomy, with long follow-up (five years), and know disease outcome. We used a custom microarray designed by us and printed by Agilent, that probes 18,709 long (>500 nt) ncRNAs mapping to intronic regions within 5,660 genomic loci. The expression data were extracted from each array and normalized across all 42 samples. Using a multiple random sampling validation strategy, we identified an expression profile of poor prognosis, comprising 51 ncRNAs. The prognostic profile of ncRNAs was applied to an independent test set of 22 patients, correctly classifying 82% of the samples. A Kaplan-Meier analysis of the test set of patients indicated that the survival curves of high and low risk groups were significantly different (Log-rank test p = 0.0009, Hazard ratio = 23.4, 95% CI = 3.62 to 151.2) thus confirming that this classifier is useful for identifying patients at high risk of recurrence. Furthermore, these findings indicate a potential role of these intronic non-coding RNAs in the progression of prostate tumors and points to the intronic ncRNAs as potential new markers of câncer.

Hereditary hemochromatosis: An opportunity for gene therapy

Levels of body iron should be tightly controlled to prevent the formation of oxygen radicals, lipoperoxidation, genotoxicity, and the production of cytotoxic cytokines, which result in damage to a number of organs. Enterocytes in the intestinal villae are involved in the apical uptake of iron from the intestinal lumen; iron is further exported from the cells into the circulation. The apical divalent metal transporter-1 (DMT1) transports ferrous iron from the lumen into the cells, while the basolateral transporter ferroportin extrudes iron from the enterocytes into the circulation. Patients with hereditary hemochromatosis display an accelerated transepithelial uptake of iron, which leads to body iron accumulation that results in cirrhosis, hepatocellular carcinoma, pancreatitis, and cardiomyopathy. Hereditary hemochromatosis, a recessive genetic condition, is the most prevalent genetic disease in Caucasians, with a prevalence of one in 300 subjects. The majority of patients with hereditary hemochromatosis display mutations in the gene coding for HFE, a protein that normally acts as an inhibitor of transepithelial iron transport. We discuss the different control points in the homeostasis of iron and the different mutations that exist in patients with hereditary hemochromatosis. These control sites may be influenced by gene therapeutic approaches; one general therapy for hemochromatosis of different etiologies is the inhibition of DMT1 synthesis by antisense-generating genes, which has been shown to markedly inhibit apical iron uptake by intestinal epithelial cells. We further discuss the most promising strategies to develop gene vectors and deliver them into enterocytes.

Envolvimento da expressäo basal do sistema celulolítico na induçäo do gene que codifica para a celobiohidrolase I em Trichoderma reesei: uma abordagem antisenso / Envolviment of the cellulase system basal expression on the induction of the gene that codify to the cellobiohydrolase I in Trichoderma reesei: an antisense boarding

A expressäo dos transcritos de celulases, no fungo filamentoso Trichoderma reesei, é controlada pela natureza das fontes de carbono utilizadas no meio de cultura. Celulose e o dissacarídeo solúvel soforose agem como indutores, mas näo o glicerol nem a glicose. A induçäo dos transcritos de celulases por celulose, um polímero insolúvel, é uma enigma. Nós previamente apresentamos experimentos in vitro que sustentam o mecanismo baseado na presença de um nível baixo de celulase no fungo induzido; estas celulases poderiam digerir a celulose, liberando oligossacarídeos, tais como a soforose, que poderíam entrar na célula e disparar a expressäo dos transcritos das celulases. Neste trabalho apresentamos experimentos in vivo que levam a sustentar fortemente este modelo...