Producción de plásmidos recombinantes para su uso como controles de la técnica RT-PCR para el diagnósticode los virus Chikungunya y Zika / Production of recombinant plasmids as controls of diagnosis technique (RTPCR) of Chikungunya and Zika viruses

El diagnóstico molecular de arbovirus es indispensable para identificar agentes etiológicos, particularmente en zonas endémicas para al menos uno de ellos. Estas deben ser validadas con controles positivos, los cuales están clásicamente representados por virus vivos, cuya obtención puede ser riesgosa, laboriosa y costosa. El objetivo de este estudio fue producir plásmidos recombinantes para su uso como controles positivos en la validación de la técnica RT-PCR para el diagnóstico de los virus Chikungunya (CHIKV) y Zika (ZIKV). A partir de los ARN extraídos de los virus [CHIKV (LARD809-GC) y ZIKV (MR766)] se obtuvieron por RT-PCR fragmentos parciales de ADN correspondientes a secuencias nucleotídicas de los genes E1 y NS5 de los virus Chikungunya y Zika, respectivamente, para serclonados en el plásmido comercial pGEM®-T Easy. La clonación se confirmó mediante PCR de colonias y PCR de ADN plasmídicos extraídos a partir de las colonias recombinantes. Se logró la producción de dos plásmidos recombinantes CHIKV-E1/pGEM®-T Easy y ZIKV-NS5192/pGEM®-T Easy con cada una de las secuencias especificadas, para su uso en la validación y control de las técnicas moleculares descritas en este reporte, para el diagnóstico de agentes virales CHIKV y ZIKV, evitando la manipulación de cultivos celulares y garantizando una fuente confiable de controles positivos(AU)

The use of molecular techniques for the viral diagnosis requires the use of positive controls.Classically, the controls are live viruses, whose manipulation may be risky, laborious and expensive. The objective of this study was produced recombinant plasmids to obtain cloned sequences of Chikungunya (CHIKV) and Zika (ZIKV) virus for their use as controls in the specificdiagnostic by RT-PCR. DNA fragments were obtained fromRNA [CHIKV (LARD809-GC) and ZIKV (MR766)] using specific primers to amplify the nucleotide sequences from fragments of Envelope 1 protein (E1) of CHIKV and Non Structural 5 protein (NS5) of ZIKV genomes. The 548 bp (CHIKV) and 192 bp(ZIKV) bands were purified from agarose gel and ligations were performed with the cloning vector pGEM®-T Easy. The Escherichia coli XL1-Blue MRF` cells were transformed with the ligation mixture, the recombinant colonies were identified by colony PCR using the specific primers to the specific viral agent. One recombinant colony from CHIKV and six recombinant colonies from ZIKV were obtained from which plasmidic DNAs was extracted. The plasmidic DNAs were used as reaction controls in CHIKV and ZIKV RT-PCR, obtaining the characteristic bands. The cloning of the sequences was successful to produce the recombinant plasmids (CHIKV-E1/pGEM®-T Easy y ZIKV-NS5192/pGEM®-T Easy) to use in the validation of RT-PCR techniques(AU)

Biopolymer Xanthan: A New Adjuvant for DNA Vaccines

Abstract DNA vaccines have been evaluated as an option to prevent several diseases. In this study, the capacity of the xanthan biopolymer to improve the DNA vaccines immune response, administered intramuscularly, was evaluated. The experimental vaccines consisted of genes encoding fragments of the proteins LigA and LigB of Leptospira interrogans serogroup Icterohaemorrhagiae serovar Copenhageni strain Fiocruz L1-130. The humoral immune response was evaluated by indirect ELISA. Cytokine expression levels were determined by RT-qPCR. Compared to the control group, the IgG antibody levels of animals immunized with pTARGET/ligAni and pTARGET/ligBrep plasmids associated with xanthan biopolymer were significantly higher than the control group. Additionally, there was a significant increase in IL-17 expression in animals vaccinated with pTARGET/ligBrep and xanthan.

Método rápido de verificación de mutantes de Escherichia coli empleados en ingeniería genética / Rapid verification method of Escherichia coli mutants used in genetic engineering

Para las metodologías de ADN recombinante, los biólogos moleculares emplean mutantes de Escherichia coli que son adquiridos de kit comerciales o de colecciones microbianas especializadas. En la práctica estos mutantes son conservados por pases sucesivos o en un banco poco caracterizado. No seguir el sistema de lotes de siembra (lote de siembra de referencia y lotes de siembra de trabajo) y la falta de controles sistemáticos, puede llevar a la pérdida de las características originales de las cepas y afectar la calidad de los resultados experimentales. Por otra parte, la propia dinámica de los laboratorios de investigación hace que sea poco práctico realizar las extensas verificaciones propias del trabajo de las colecciones microbianas. El objetivo de este artículo es proponer un método de evaluación de pureza y estabilidad genética que permita la verificación de varios mutantes de E. coli en un solo ensayo. En él se definen los criterios de selección para el diseño de medios de cultivos específicos. Se realizan diluciones seriadas de los cultivos crecidos en medio Luria Bertani y se emplea como método de siembra las trazas de dilución. Los resultados evidencian que teniendo en cuenta las rutas metabólicas afectadas en cada mutante, se pueden agrupar varias cepas a verificar en un solo ensayo. La combinación de medios específicos permite tener un criterio de la pureza del cultivo y la estabilidad genética. Esta alternativa permite el chequeo rápido de aquellos marcadores de las cepas que son determinantes en las metodologías de ADN recombinante(AU)

For recombinant DNA methodologies, molecular biologists use Escherichia coli mutants acquired from commercial kits or specialized microbial strain collections. These mutants are routinely conserved by successive passages or in poorly-characterized strain banks. A failure to follow the seed lot system (reference seed lot and working seed lot) and the lack of systematic controls, can lead to the loss of original strain characteristics and affect the quality of experimental results. On the other hand, the dynamic of research laboratories makes impractical to carry out extensive verifications related to the work with microbial collections. The aim of this article is to propose a single-assay method for genetic purity and stability evaluation of multiple E. coli mutants simultaneously. For the design of specific culture media, selection criteria were defined. Serial dilutions of cultures in Luria Bertani medium were made, and track dilution was used as seeding method. The results show how a mutated metabolic pathway-oriented design permit the verification of several strains in a single trial. A criterion about culture purity and genetic stability could be obtained after combining specific media. This alternative allows for a rapid evaluation of strain key genetic markers for recombinant DNA methodologies(AU)

Aplicación de la nanobiotecnología con el sistema CRISPR-cas / Application of the nanobiotechnology with the system CRISP-Cas

Resumen Introducción: La nanobiotecnología y la biología sintética son ciencias que impactan en la actualidad con el lanzamiento de aplicaciones innovadoras y beneficiosas para el ser humano, estas ciencias se han fusionado para fabricar nuevos componentes para la construcción de células totalmente artificiales y la creación de biomoléculas sintéticas. Objetivo: Conocer las aplicaciones de la nanobiotecnología relacionadas con el uso del sistema CRISPR/Cas en el almacenamiento de información en el ADN bacteriano y alternativas terapéuticas. Materiales y métodos: Se realizó una revisión bibliográfica sobre las principales aplicaciones de la nanobiotecnología, en las bases de datos ScienceDirect, SciELO, PubMed y en revistas como: Nature biotechnology, Biochemistry, Science y Journal Microbiology. Resultados: La revisión de literatura describe y analiza las nuevas aplicaciones nanobiotecnológicas utilizadas para escribir información en el código genético de las células bacterianas, en el que se emplean el sistema basado en repeticiones palindrómicas cortas agrupadas y regularmente interespaciadas (CRISPR/Cas) y la producción de ADN sintético, así como las alternativas terapéuticas relacionadas con la terapia génica. Conclusión: Entre las aplicaciones nanobiotecnológicas se han demostrado dos métodos para grabar información en el ADN de células bacterianas, de Escherichia coli y Sulfolobus tokodai vinculados con el empleo del sistema CRISPR/Cas y la producción de ADN sintético, así como el uso del CRISPR/Cas en la terapia génica y celular.

Abstract Introduction: Nanobiotechnology and synthetic biology are sciences that impact today with the launching of innovative and beneficial applications for the human being. These sciences have been amalgamated to manufacture new components for the construction of totally artificial cells and the creation of synthetic biomolecules. Objective: To know the applications of nanobiotechnology related to the use of the system CRISPR/Cas in the storage of bacterial DNA and therapeutic alternatives. Materials and methods: A bibliographical review on the main applications of nanobiotechnology was carried out in ScienceDirect, SciELO, PubMed databases and in magazines such as: Nature Biotechnology, Biochemistry, Science and Journal Microbiology. Results: The literature review describes and analyzes the new nanobiotechnology applications used to write information in the genetic code of bacterial cells, in which the system is used based on short grouped and regularly interspaced palindromic repetitions (CRISPR/Cas) and the production of synthetic DNA, as well as therapeutic alternatives related to gene therapy. Conclusion: Among the nanobiotechnology applications, two methods to record information in the DNA of bacterial cells Escherichia coli and Sulfolobus Tokodai have been shown, which are linked to the use of the system CRISPR/Cas and the production of synthetic DNA, as well as the use of CRISPR/Cas in gene and cellular therapy.

The F309S mutation increases factor VIII secretion in human cell line

OBJECTIVES: The capacity of a human cell line to secrete recombinant factor VIII with a F309S point mutation was investigated, as was the effect of the addition of chemical chaperones (betaine and sodium-4-phenylbutyrate) on the secretion of factor VIII. METHODS: This work used a vector with a F309S mutation in the A1 domain to investigate FVIII production in the HEK 293 human cell line. Factor VIII activity was measured by chromogenic assay. Furthermore, the effects of chemical drugs on the culture were evaluated. RESULTS: The addition of the F309S mutation to a previously described FVIII variant increased FVIII secretion by 4.5 fold. Moreover, the addition of betaine or sodium-4-phenylbutyrate increased the secretion rate of FVIIIÄB proteins in HEK 293 cells, but the same effect was not seen for FVIIIÄB-F309S indicating that all the recombinant protein produced had been efficiently secreted. CONCLUSION: Bioengineering factor VIII expressed in human cells may lead to an efficient production of recombinant factor VIII and contribute toward low-cost coagulation factor replacement therapy for hemophilia A. FVIII-F309S produced in human cells can be effective in vivo.

Polimorfismos en los genes de dihidrofolato-reductasa ( dhfr ) y dihidropteroato-sintasa ( dhps ) y modelado estructural del gen dhps en aislamientos colombianos de Toxoplasma gondii / Gene polymorphisms in the dihydrofolate reductase ( dhfr ) and dihydropteroate synthase ( dhps ) genes and structural modelling of the dhps gene in Colombian isolates of Toxoplasma gondii

Introducción. No existen reportes sobre las variaciones en la secuencia de los genes blanco de los medicamentos anti- Toxoplasma en aislamientos provenientes de Suramérica. Objetivo. Clonar y secuenciar los genes de la dihidrofolato-reductasa ( dhfr ) y la dihidropteroato-sintetasa ( dhps ) de la cepa de referencia RH y de dos aislamientos colombianos de Toxoplasma gondii. Materiales y métodos. Se obtuvieron dos aislamientos de T. gondii en líquido céfalorraquídeo de pacientes colombianos positivos para HIV con toxoplasmosis cerebral. Se extrajo el ADN de los genes dhfr y dhps y se amplificaron mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Los productos fueron clonados en el vector pGEM-T y secuenciados. Resultados. Se encontró un cambio de adenina por guanina (A « G) en la posición 235 del exón 2 del gen dhps , dos cambios de guanina por citocina (G « C) en las posiciones 259 y 260 y un cambio de timina por guanina (T « G) en la posición 371 del exón 4 del gen dhps. Por análisis bioinformático, en este último exón se identificó un polimorfismo no sinónimo en la región codificante, que podría llevar al cambio de una Glu (CAA o CAG) por una His (codificada por los codones AAU o AAC). Se calculó el modelo estructural de la enzima dihidropteroato-sintetasa (DHPS) de T. gondii y se identificaron las modificaciones en la estructura secundaria ocasionadas por las mutaciones. Conclusiones. La metodología estandarizada puede servir como base para la búsqueda de polimorfismos en muestras de pacientes con diferentes manifestaciones clínicas de toxoplasmosis y para establecer su posible relación con los cambios en la sensibilidad a los antifolatos y la reacción al tratamiento.

Introduction: There are no reports describing polymorphisms in target genes of anti- Toxoplasma drugs in South American isolates. Objective: This study sought to perform cloning and sequencing of the dihydrofolate reductase ( dhfr ) and dihydropteroate-synthase ( dhps ) genes of the reference Rh strain and two Colombian isolates of Toxoplasma gondii . Materials and methods: Two isolates were obtained from the cerebrospinal fluid of HIV-infected patients with cerebral toxoplasmosis. A DNA extraction technique and PCR assay for the dhfr and dhps genes were standardized, and the products of amplification were cloned into Escherichia coli and sequenced. Results: One polymorphism (A « G) was found at position 235 of exon 2 in the dhps gene. In addition, two polymorphisms (G « C) at positions 259 and 260 and one polymorphism (T « G) at position 371 within exon 4 of the dhps gene were detected. In this last exon, a bioinformatic analysis revealed a non-synonymous polymorphism in the coding region that could lead to the substitution of Glu (CAA or CAG) for His (encoded by codons AAU or AAC). A structural model of the T. gondii DHPS protein was calculated, and the results revealed modifications in secondary structure due to mutations. Conclusions: The methods described in this study can be used as a tool to search for polymorphisms in samples from patients with different clinical manifestations of toxoplasmosis and to examine their relationship with the therapeutic response.

New molecular biologist perspective and insight: DNA topoisomerases production by recombinant DNA technology for medical laboratory application and pharmaceutical industry

DNA topoisomerases are essential enzymes that control the topological state of DNA replication during mitosis. These enzymes are classified based on their mechanisms and physical properties. During mitosis, superhelical DNA must be unwound or relaxed by DNA topoisomerases prior to a decoding step by DNA processing enzymes, such as DNA polymerase and RNA polymerase. By blocking the reaction of resealing the breaks in the DNA ultimately can result in cellular death. Compounds that inhibit the catalytic function of these enzymes can serve as potential anticancer agents. DNA topoisomerases are found in nature and used as high quality and well-validated targets for the screening of potential anticancer agents. Our current work focuses on determining potential anticancer agents from natural resources using DNA topoisomerases as the screening targets. Large scale production of these enzymes using recombinant DNA technology in our academic laboratory is utilised to avoid dependence on expensive commercially available enzymes. The in-house produced enzymes can also be used to enhance our research in the field of molecular medicine by providing an enzyme source that can be used to screen potential anticancer agents, and for other newly developed diagnostic and medical research projects in the near future as well as a step in moving our efforts into the industrial sector.

Bioterrorismo e a facilidade de acesso à biotecnologia e seus insumos / Bioterrorism and easy access to biotechnology and its inputs

Os fundamentalismos surgiram no Ocidente a partir de questões religiosas e posteriormente difundiram-se para outras partes do mundo tomando outras conotações, principalmente políticas. As técnicas de manipulação genética difundiram-se pelas universidades, que formam mestres e doutores com os conhecimentos básicos sobre clonagem gênica, que se tornou de domínio público. Todos os insumos para clonagem gênica podem ser adquiridos por meio de catálogos via internet. Podem-se recrutar profissionais fanáticos e com a competência para a manipulação genética de organismos patogênicos, lado perverso da biotecnologia. Os conflitos étnicos, culturais e religiosos estão associados a um cenário de contrastes entre os países ricos e carentes de matéria-prima e aqueles pobres, mas detentores de insumos básicos e energia, e atingem a sua forma mais aguda nos fundamentalismos. Grupos de fanáticos têm pleno acesso a essa biotecnologia. Estariam assim as populações civis vulneráveis aos ataques do bioterrorismo com armas biológicas geneticamente modificadas?.

Fundamentalism arose in the West based in religious matters and afterward diffused to other parts of theworld with other connotations, especially political. Genetic manipulation techniques spread to universities,which has given masters and doctors the basic knowledge on gene cloning, which has become public domain.All inputs for gene cloning may be obtained through online catalogs. Fanatic professionals may be recruited,with qualification for genetic manipulation of pathogenic organisms, the negative side of biotechnology. Eth-nic, cultural and religious conflicts are linked to a series of contrasts between countries that are rich but witha lack of raw materials and the poor countries that possess basic input and energy sources, when it reachesthe highest fundamentalist form. Fanatic groups have complete access to this biotechnology. Are civilian po-pulations in vulnerable to bioterrorist attacks involving genetically modified biological weapons?

Epidemiología genómica y paraparesia espástica tropical asociada a la infección por el virus linfotrópico humano de células T tipo 1 / Genome epidemiology and tropical spastic paraparesis associated with human T-cell lymphotropic virus type 1

OBJETIVO: Caracterizar el ambiente genómico de las secuencias adyacentes al virus linfotrópico humano de células T tipo 1 (HTLV-1) en pacientes con paraparesia espßstica tropical y mielopatía asociada a la infección con HTLV-1 (PET/MAH) de diferentes regiones de Colombia y del Japón. MÉTODOS: Se enfrentaron 71 clones recombinantes con secuencias del genoma humano adyacentes al 5'-LTR de pacientes con PET/MAH, a las bases de datos del Genome Browser y del Gen-Bank. Se identificaron y analizaron estadísticamente 16 variables genómicas estructurales y composicionales mediante el programa informßtico R, versión 2.8.1, en una ventana de 0,5 Mb. RESULTADOS: El 43,0 por ciento de los provirus se localizaron en los cromosomas del grupo C; 74 por ciento de las secuencias se ubicaron en regiones teloméricas y subteloméricas (P < 0,05). Un anßlisis de conglomerados permitió establecer las relaciones jerßrquicas entre las características genómicas incluidas en el estudio; el anßlisis de componentes principales identificó las componentes que definieron los ambientes genómicos preferidos para la integración proviral en casos de PET/MAH. CONCLUSIONES: El HTLV-1 se integró con mayor frecuencia en regiones de la cromatina ricas en islas de citocina fosfato guanina (CpG), de alta densidad de genes y de repeticiones tipo LINE (elemento disperso largo [long interspersed element]) y transposones de ADN que, en conjunto, conformarían los ambientes genómicos blanco de integración. Este nuevo escenario promoverß cambios sustanciales en el campo de la salud pública y en el manejo epidemiológico de las enfermedades infecciosas, y permitirß desarrollar potentes herramientas para incrementar la eficiencia de la vigilancia epidemiológica.

OBJECTIVE: Characterize the genomic environment of the sequences adjacent to human T-cell lymphotropic virus type 1 (HTLV-1) in patients with HTLV-1-associated myelopathy/tropical spastic paraparesis (HAM/TSP) in different regions of Colombia and Japan. METHODS: A total of 71 recombinant clones with human genome sequences adjacent to 5' LTR in patients with HAM/TSP were compared to the Genome Browser and GenBank databases. Sixteen structural and compositional genome variables were identified, and statistical analysis was conducted in the R computer program, version 2.8.1, in a 0.5 Mb window. RESULTS: A total of 43.0 percent of the proviruses were located in the group C chromosomes; 74 percent of the sequences were located in the telomeric and subtelomeric regions (P < 0.05). A cluster analysis was used to establish the hierarchical relations between the genome characteristics included in the study. The analysis of principal components identified the components that defined the preferred genome environments for proviral integration in cases of HAM/TSP. CONCLUSIONS: HTLV-1 was integrated more often in chromatin regions rich in CpG islands with a high density of genes and LINE type repetitions, and DNA transposons which, overall, would form the genomic environments targeted for integration. This new scenario will promote substantial changes in the field of public health and in epidemiological management of infectious diseases. It will also foster the development of powerful tools for increasing the efficiency of epidemiological surveillance.

Estratégias moleculares para utilização do vírus da febre amarela como vetor vacinal / Molecular strategies to use the yellow fever virus as a vaccine vector

A vacina da febre amarela 17D (YFV-17D) é bastante segura e uma dose única confere imunidade potente e duradoura. Por essas e outras características, diferentes tecnologias têm sido propostas para a utilização da cepa 17D como vetor vacinal. Estratégias promissoras para o desenvolvimento de novas vacinas têm se baseado na construção de quimeras YFV-17D com inserção de seqüências heterólogas e produção em larga escala de replicons empacotados em partículas pseudo-infecciosas (PPIs), no entanto, ainda não existe um consenso da melhor estratégia a ser utilizada para esses fins. O presente estudo teve por objetivo avaliar diferentes estratégias de construção para a utilização do YFV-17D como vetor vacinal. Para isso foram construídos duas quimeras do YFV-17D com inserção de um gene repórter YFP (Yellow Fluorescent Protein) na junção E/NS1 e dois replicons subgenômicos do YFV-17D expressando o gene repórter luciferase. Para a produção de PPIs foi desenvolvida a linhagem HEK-YFV-prM/E-opt. O YFV-YFPSSE revelou instabilidade genética com perda do gene YFP e correlação negativa entre expressão de proteínas virais e do gene repórter. O YFV-YFP-DENV1linker mostrou-se estável geneticamente com expressão eficiente de YFP e proteínas virais, e mostrou-se ser o mais adequado para ser utilizado como vetor viral. Os replicons do YFV-17D mostraram-se funcionais e capazes de expressar eficientemente o gene heterólogo. E, embora a linhagem HEK-YFV-prM/E-opt tenha expressado as proteínas estruturais prM e E eficientemente, poucas partículas pseudo-infecciosas foram produzidas. Diante do exposto, as diferentes estratégias de manipulação genética do YFV avaliadas neste trabalho constituem ferramentas viáveis e aplicáveis ao processo de desenvolvimento de vacinas, havendo, porém, necessidade de otimização dessas estratégias para assegurar maiores segurança e eficácia.

The yellow fever vaccine 17D (YFV-17D) is safe and a single dose confers lastingand powerful immunity. For these, different technologies have been proposed for the use of YF-17D strain as a vaccine vector. Promising strategies for the development of new vaccines has been based on chimeric YFV-17D with insertion of heterologous genes and subgenomic replicons packaged into pseudo-infectious particles (PIPs).However, there is still no consensus in the best strategy to be used for suchpurposes. This study aimed to evaluate different strategies for building for the use of YFV-17D as a vector vaccine. For that were constructed two chimeric YFV-17D with insertion of a reporter gene YFP (yellow fluorescent protein) at E/NS1 junction and two subgenomic replicons of YFV-17D expressing the luciferase reporter gene. For the production of PIPs a recombinant cell line were developed (HEK-YFV-prM/E-opt). The YFV-YFP-SSE showed genetic instability with loss of the YFP gene and negative correlation between expression of viral proteins and reporter gene. The YFV-YFPDENV1linker proved to be genetically stable with efficient expression of YFP and viral proteins, and proved to be the most suitable for use as a viral vector. The replicons ofYFV-17D were shown to be functional and able to efficiently express heterologous gene. And although the cell line HEK-YFV-prM/E-opt has expressed efficiently structural viral proteins prM and E, a few of pseudoinfectious particles were produced. In this light, the different strategies of genetic manipulation of YFV measured in this study are feasible and applicable tools to the process of vaccine development, however, the optimization of these strategies is important to ensure greater safety and efficacy.

Medicamentos derivados de la biotecnología: ¿qué son? una perspectiva farmacológica e histórica / Biotechnology-derived drugs: what are they?: pharmacological and historical perspective

Los biológicos, es decir, medicamentos obtenidos de organismos vivos, no son nuevos. La historia proporciona varios ejemplos de extractos animales o humanos que se utilizan para prevenir o tratar enfermedades humanas. En consecuencia, los médicos han estado conscientes, por siglos, del valor terapéutico de nuestras propias moléculas. La dificultad radicó, muchas veces, en cómo obtener estos compuestos propios o similares a los propios. La biotecnología, una tecnología mediante la cual organismos vivos manipulados se utilizan para generar productos útiles tales como fármacos, proporcionó una respuesta revolucionaria. Sabemos cómo crear genéticamente por ingeniería bacterias, levaduras, células de insectos o mamíferos para sintetizar moléculas humanas, las llamadas proteínas terapéuticas recombinantes humanas. Los anticuerpos monoclonales murinos y humanizados contra antígenos humanos también son productos biotecnológicos. El número de fármaco s biotecnológicos que se están comercializando, y aquéllos que se utilizan en ensayos clínicos o que están a la espera de autorización, está creciendo de manera exponencial. Actualmente, aún estamos en los inicios de una nueva era en farmacoterapia, cuyo final es imposible de ver. Los farmacólogos deben seguir el ritmo de estos cambios y desarrollar nuevas habilidades. Probablemente, incluso tengan que desafiar antiguas suposiciones, con la finalidad de investigar nuevas moléculas. Utilizando un enfoque fácil y entendible, este artículo de revisión vuelve a tratar bio-conceptos y da énfasis a la dimensión real del desafío.

Novedades Científicas: “utilidad de animales transgénicos en la investigación” / Scientific novelties: utility of transgenic animals in reserch

La patología comparada resurge como el punto de encuentro entre el patrón de estudio morfológico humano y el animal. Su aplicación desde sus inicios se apoyó en los biomodelos animales, muchos de los cuales se lograron por manipulación genética. Estos métodos de estudio fueron generados a partir del comportamiento de la enfermedad en el humano. La ingeniería genética se refiere a tecnología desarrollada por el manejo del ADN recombinante, definida por ser una secuencia “nueva” de ADN creada en los laboratorios por la unión de porciones de ADN con orígenes diferentes. A un organismo cuyo material genético ha sido modificado artificialmente mediante la supresión de expresiones génicas o la incorporación de fracciones o secuencias de ADN ajeno a su especie, se le llama organismo genéticamente modificado (OGM); organismo modificado genéticamente (OMG) o simplemente “transgénico” (antes, “transgenético”). La ingeniería genética se define como el conjunto de técnicas y métodos que se utilizan para “construir” moléculas de ADN recombinante y luego introducirlas en moléculas receptoras. En Venezuela existe una prohibición para la manipulación en animales. Se aplican la Ley de Biodiversidad, el Convenio de Diversidad biológica y el Protocolo Internacional de Biodiversidad. Con la investigación animal, los científicos han descubierto las maneras de salvar y prolongar la vida humana. Vacunaciones tales como la poliomielitis trasplantes de órganos perfeccionados así como el desarrollo de técnicas quirúrgicas y de traumatología reconstructivas. De manera activa se ha generado un debate por el uso de animales en la investigación y en los ensayos biotecnológica. Se plantea la bioética en la aplicación de los biomodelos animales. Es importante el conocimiento de estos métodos de investigación genética en animales de investigación, más aún en instituciones generadoras de productos biológicos. En poco tiempo se ha generado un fenómeno transgénico de la...

Alimentos transgénicos: fundamentos científicos / Food, genetically modified: scientific basis

La biotecnología moderna es la ciencia que investiga y manipula genéticamente los sistemas biológicos mediante la tecnología del ADN recombinante. La biotecnología tradicional es la ciencia que se ha venido practicando durante siglos mediante la selección y reproducción natural de las especies. En la búsqueda de producir mejores cultivos y mejores alimentos, dándole ciertas características tales como resistencia a las plagas, tolerancia al calor, al frio a las sequias, rendimientos mas altos, mejorar el sabor o darles mayores nutrientes; los científicos han logrado insertar genes deseables no solo de una misma especie o de plantas muy emparentadas, si no de genes de otros organismos muy diferentes al organismo aceptor. Esta es la llamada tecnología transgénica que permite trasladar copias de genes con características específicas de un organismo a otro organismo muy distinto que entonces tendrá estas nuevas características. Los consumidores finales, los principales destinatarios de esta tecnología, tiene derecho a una mayor protección (a través de información objetiva) para poder decidir sobre la utilización o no de estos alimentos. De llegar a demostrarse que es una tecnología realmente inocua, esta podría salvar del hambre a la creciente población mundial, promoviendo el suministro de alimentos de alta calidad, mejorando el valor nutritivo. Aunque los científicos traten de desarrollar técnicas para asegurar la vida sobre la tierra, solo queda aseverar que "la vida siempre se abrirá paso por si sola".

Transgenic lettuce seedlings carrying hepatitis B virus antigen HBsAg

The obtainment of transgenic edible plants carrying recombinant antigens is a desired issue in search for economic alternatives viewing vaccine production. Here we report a strategy for genetic transformation of lettuce plants (Lactuca sativa L.) using the surface antigen HBsAg of hepatitis B virus. Transgenic lettuce seedlings were obtained through the application of a regulated balance of plant growth regulators. Genetic transformation process was acquired by cocultivation of cotyledons with Agrobacterium tumefaciens harboring the recombinant plasmid. It is the first description of a lettuce Brazilian variety "Vitória de Verão" genetically modified.

Alérgenos recombinantes na prática da imunoterapia / Recombinant allergens in immunotherapy practice

Objetivo: Avaliar a associação das variaveis ambientais temperatura e velocidade dos ventos com o perfil de atendimento de crianças asmáticas. Métodos: Por intermédio de estudo retrospectivo dos arquivos públicos do Hospital e Pronto Socorro Municipal de cuiaba/ MT(HPSMC) foram separados 25.803 prontuários de crianças menores de cinco anos, realizando-se, posteriormente, análises das associações entre as com diagnóstico de asma nos atendimentos ambulatoriais e internações com as variáveis ambientais temperatura e velocidade dos ventos. Para mensuração do desfecho foram empregadas análises de regressão linear simples e múltipla. Resultados: A variável ambiental temperatura apresentou-se como preditora (p

Objective: To evaluate the association of environmental variety temperature and wind velocity whit profile on asthmatic children. Methods: Across the public files at Cuiaba' s Hospital and First-Aid Clinic, 25803 promptbooks about 0-5-year-old children were taken apart, accomplishing, afterwards, analysis of association among those children who has gotten asthma diagnosis on outpatient service and admission with environmental variants, temperature and wind velocity. For analysis of outcome were utilized linear regression sim pie and multiple. Results: The environmental variety temperature has presented as a predictor (p

Obtención de clones recombinantes que expresan las proteínas prM-E-NS1 del virus dengue serotipo 2 / Obtaining recombinant clones expressing dengue virus serotype 2 prM-E-NS1 proteins

Objetivo: obtener clones recombinantes que expresen diferentes proteínas del virus dengue 2 en un vector de expresión en células eucariotas. Métodos: se realizó el clonaje de los genes prM, envoltura (E) y 65 aminoácidos (aa) de la proteína NS1 del virus dengue serotipo 2 (cepa Nueva Guinea C) en un vector de expresión en células eucariotas pcDNA (3.1). La obtención de los genes correspondientes a la zona prM/E/NS1 y prM/E truncada en 100 aa se realizó mediante reacción en cadena de la polimerasa (RCP). La detección de los posibles clones recombinantes se llevó a cabo mediante las técnicas de RCP, análisis de restricción enzimática y secuenciación nucleotídica. Se realizó la transfección de la línea celular CHO con cada plásmido recombinante. Para determinar la expresión transciente de los genes clonados se empleó la técnica de inmunofluorescencia indirecta (IFI) y trascripción reversa-RCP (TR-RCP). Resultados: se obtuvieron bandas de 2 202 y 1 600 pares de bases (pb), respectivamente. Se estudiaron 20 posibles colonias recombinantes, de las cuales, 7 resultaron positivas para prM-E-NS1 y 5 para prM/E truncada. Se obtuvieron células fluorescentes 48 h después de transfectadas, además una RCP positiva a ese mismo tiempo, lo que indicó la presencia de las proteínas en las células transfectadas. Conclusiones: el vector empleado fue eficiente para el clonaje y la expresión de las proteínas seleccionadas, por lo que las construcciones genéticas obtenidas pudieran ser evaluadas en animales como posibles candidatos vacunales para la obtención de una vacuna de ADN contra el dengue.

Objective: To obtain recombinant clones expressing different dengue virus 2 proteins in an expression vector of eukaryote cells. Methods: Cloning of prM genes, E envelope and 65 amino-acids (aa) of dengue virus serotype 2 NS1 proteins (Nueva Guinea strain) in an expression vector of pcDNA eukaryote cells (3.1). The prM/E/NS1 zone and the truncated prM/E zone at 100 aa genes were obtained by polymerase chain reaction (PCR). Possible recombinant clones were detected using PCR, enzyme restriction analysis and nucleotide sequencing. Transfection of the CHO cell line with each recombinant plasmid was performed. Indirect immunofluorescence and reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR) determined the transient expression of cloned genes. Results: Bands of 2 202 and 1 600 base pairs (bp) respectively were obtained. Twenty possible recombinant colonies were studied, 7 of them were pr-E-NSI-positive and 5 truncated prM/E-positive. Fluorescent cells emerged 48 hours after being transfected in addition to positive PCR, all of which indicated that the studied proteins were present in transfected cells. Conclusions: The used vector proved to be efficient for cloning and expression of the selected proteins; therefore, the obtained genetic constructions could be evaluated in animals as likely vaccinal candidates for a dengue virus DNA vaccine.

Induction of in vitro flowering in Capsicum frutescens under the influence of silver nitrate and cobalt chloride and pollen transformation

The influence of silver nitrate (AgNO3) and cobalt chloride (CoCl2) on shoot multiplication and in vitro flowering in Capsicum frutescens Mill. was investigated. Exogenous administration of AgNO3 and CoCl2 at a concentration of 30 micronM resulted in the maximum tissue response in terms of shoot length and number of shoots after 45 days culturing on MS medium. Both silver nitrate (40 micronM) and cobalt chloride (30 micronM) influenced in vitro flowering after 25 and 45 days respectively. This is the first report on in vitro flowering in C. frutescens. The study also demonstrated successful transformation of pollen obtained from the in vitro flowers. Since capsicum is highly recalcitrant to in vitro plant regeneration, the results of the study may be highly useful in transformation of capsicum using germ free in vitro flowers.