TLR5-dependent immunogenicity of a recombinant fusion protein containing an immunodominant epitope of malarial circumsporozoite protein and the FliC flagellin of Salmonella Typhimurium

Recently, we described the improved immunogenicity of new malaria vaccine candidates based on the expression of fusion proteins containing immunodominant epitopes of merozoites and Salmonella enterica serovar Typhimurium flagellin (FliC) protein as an innate immune agonist. Here, we tested whether a similar strategy, based on an immunodominant B-cell epitope from malaria sporozoites, could also generate immunogenic fusion polypeptides. A recombinant His6-tagged FliC protein containing the C-terminal repeat regions of the VK210 variant of Plasmodium vivax circumsporozoite (CS) protein was constructed. This recombinant protein was successfully expressed in Escherichia coli as soluble protein and was purified by affinity to Ni-agarose beads followed by ion exchange chromatography. A monoclonal antibody specific for the CS protein of P. vivax sporozoites (VK210) was able to recognise the purified protein. C57BL/6 mice subcutaneously immunised with the recombinant fusion protein in the absence of any conventional adjuvant developed protein-specific systemic antibody responses. However, in mice genetically deficient in expression of TLR5, this immune response was extremely low. These results extend our previous observations concerning the immunogenicity of these recombinant fusion proteins and provide evidence that the main mechanism responsible for this immune activation involves interactions with TLR5, which has not previously been demonstrated for any recombinant FliC fusion protein.

Determinante ambientales en asma-e infecciones respiratorias: ¿causa o concecuencia?: ¿bemeficio o riesgo? / Environmental determinant in asthma-asthma and respiratory infections: cause or concecuencia? bemeficio or risk?

Sabemos que el mecanismo fisiopatogenico subyacente en el asma bronquial es la inflamación de las vías aéras, responsables de la hiperreactividad bronquial, la obstrucción y de los síntomas. Existen factores capaces de desarrollar inflamación y con ellos ser causante de asma bronquial y otros capaces de actuar sobre una vái aérea ya inflamada y ser responsables de la amplificación de mecanismos inflamatorios que llevará a continuidad de la enfermedad o producirán exacerbaciones.

Identificação de epítopos de célula B na glicoproteína-E do envelope do vírus dengue sorotipo 3 / Identification of B-cell epitopes in the envelope glycoprotein of dengue virus type 3

As infecções pelo vírus dengue têm se tornado um problema crescente de Saúde Pública em regiões tropicais e subtropicais do mundo. O vírus pertence à família Flaviviridae com quatro sorotipos antigenicamente distintos (DENV-1 a DENV-4). Uma possível estratégia para evitar a patogenia associada com uma vacina para o dengue (que deve ser tetravalente), seria a construção de uma vacina quimérica composta de epítopos críticos selecionados dos quatro sorotipos. A maioria dos epítopos envolvidos na neutralização do vírus está presente na glicoproteína E do envelope, que é a maior proteína de superfície da partícula viral. O objetivo deste trabalho foi identificar epítopos de célula B na glicoproteína E do vírus dengue sorotipo 3. Para o mapeamento de epítopos imunodominantes, noventa e cinco peptídeos (15-mers cada, sobreposição de 10) foram sintetizados (Synpep, California-USA), a partir da sequência de 490 aminoácidos da glicoproteína E do envelope do DENV-3, de cepa circulante no Brasil. Estes peptídeos foram testados por ELISA contra um pool de soros de pacientes positivos e negativos para dengue, coletados durante a fase de convalescença da infecção por DENV-3. Os resultados mostraram que os soros de humanos reagiram com onze, dos noventa e cinco peptídeos testados, distribuídos em 5 regiões com aminoácidos na posições 51-65 (peptídeo 11), 71-90 (peptídeos 15 e 16), 131-170 (peptídeos 27, 28, 29, 30, 31 e 32), 196-210 (peptídeo 40) e 246-260 (peptídeo 50). A análise da curva ROC mostrou que, dentre os peptídeos identificados, nove seriam capazes de diferenciar entre pacientes com DENV-3 de pacientes não-dengue e três capazes de diferenciar a infecção por DENV-3 daquelas por outros sorotipos virais (DENV-1 e DENV-2). Os epítopos imunodominantes aqui descritos, junto com outros epítopos bem documentados, são potencialmente relevantes para o desenho de uma vacina para o vírus dengue e para o desenvolvimento de kits de diagnóstico específicos.

Use of an immunodominant p17 antigenic fraction of Neospora caninum in detection of antibody response in cattle

A Neospora caninum 17 kDa protein fraction (p17) has been described as an immunodominant antigen (IDA) under reducing and non-reducing conditions. The aim of the present study was to investigate the diagnostic utility of p17 in cattle. In order to achieve this, p17 was purified by electroelution from whole N. caninum tachyzoite soluble extract and a p17-based Western blot (WB-p17) was developed. The p17 recognition was measured by densitometry and expressed as OD values to check the validity of the WB-p17. A total of 131 sera including sequential samples from naturally- and experimentally-infected calves and breeding cattle were analysed by WB-p17 and compared with IFAT using whole formalin-fixed tachyzoites as a reference test. The results obtained highlight the feasibility of using the N. caninum p17 in a diagnostic test in cattle. Firstly, the assay based on the p-17 antigen discriminated between known positive and negative sera from different cattle populations, breeding cattle and calves. Secondly, the p17 antigen detected fluctuations in the antibody levels and seroconversion in naturally- and experimentally-infected cattle. Significant differences in p-17 antigen recognition were observed between naturally infected aborting and non-aborting cattle, as well as significant antibody fluctuations over time in experimentally infected cattle, which varied between groups. Furthermore, the results obtained with WB-p17 are in accordance with the results obtained with the IFAT, as high agreement values were obtained when all bovine subpopulations were included (kappa = 0.86).

The non-palindromic adaptor-PCR method for the identification of the T-cell receptor genes of an interferon-gamma-secreting T-cell hybridomaspecific for trans-sialidase, an immunodominant Trypanosoma cruzi antigen

Cloning of the T-cell receptor genes is a critical step when generating T-cell receptor transgenic mice. Because T-cell receptor molecules are clonotypical, isolation of their genes requires reverse transcriptase-assisted PCR using primers specific for each different Valpha or Vß genes or by the screening of cDNA libraries generated from RNA obtained from each individual T-cell clone. Although feasible, these approaches are laborious and costly. The aim of the present study was to test the application of the non-palindromic adaptor-PCR method as an alternative to isolate the genes encoding the T-cell receptor of an antigen-specific T-cell hybridoma. For this purpose, we established hybridomas specific for trans-sialidase, an immunodominant Trypanosoma cruzi antigen. These T-cell hybridomas were characterized with regard to their ability to secrete interferon-gamma, IL-4, and IL-10 after stimulation with the antigen. A CD3+, CD4+, CD8- interferon-gamma-producing hybridoma was selected for the identification of the variable regions of the T-cell receptor by the non-palindromic adaptor-PCR method. Using this methodology, we were able to rapidly and efficiently determine the variable regions of both T-cell receptor chains. The results obtained by the non-palindromic adaptor-PCR method were confirmed by the isolation and sequencing of the complete cDNA genes and by the recognition with a specific antibody against the T-cell receptor variable ß chain. We conclude that the non-palindromic adaptor-PCR method can be a valuable tool for the identification of the T-cell receptor transcripts of T-cell hybridomas and may facilitate the generation of T-cell receptor transgenic mice.

Análise proteômica das principais proteínas antigênicas do veneno da vespa agelaia pallipes / Proteomic analysis of mayor antigenic proteins from agelaia pallipes venom

Objetivo: alguns pacientes alérgicos ao veneno de vespas apresentam pesquisa negativa de IgE específica com os extratos disponíveis. Para investigar esta falta de reação cruzada, este estudo pretende caracterizar os antígenos principais do veneno de uma das espécies encontradas no Brasil, a Agelaia pallipes, utilizando a análise proteômica. Método: realizamos eletroforese bidimensional com veneno de Agelaia pallipes. Na primeira dimensão utilizamos tiras de gel de 7 cm com gradiente de pH de 3.0 -10.0, e na segunda SDS-PAGE 15%. Com géis feitos em duplicata, o primeiro foi transferido para nitrocelulose e incubado com o soro de paciente sensibilizado (diluição 1:5). A imunodetecção foi realizada com anti-IgE humana biotinilada e ECL (Enhanced Chemiluminescence). No segundo gel, corado Coomassie, os spots correspondentes às proteínas reconhecidas pela IgE através do immuniblotting foram processados e analisados no espectrometro de massa do tipo MALDI-ToF. A identificação foi obtida por PMF - Peptide Mass Fingerprinting. Resultados: a eletroforese bidimensional com o veneno da Agelaia pallipes evidenciou várias proteínas com peso molecular (PM) abaixo de 20kDa. Com immunoblotting foram detectadas proteínas reconhecidas pela IgE com PM entre 20 e 38 kDa. Pela análise proteômica, estas proteínas foram identificadas principalmente como antígeno 5 e serino-proteases. Conclusão: este é o primeiro trabalho a identificar alérgenos de vespas neotropicais com análise proteômica. Além do antígeno 5, identificamos serino-proteases que apenas recentemente foram citadas neste tipo de amostra biológica, mostrando semelhança parcial entre estas proteínas de venenos de vertebrados (serpentes). Nosso projeto futuro será o sequenciamento das amostras.

Antibody recognition of synthetic peptides mimicking immunodominant regions of HIV-1 p24 and p17 proteins / Reconocimiento por anticuerpos de péptidos sintéticos que imitan regiones inmunodominantes de las proteínas p24 y p17 de VIH-1

The gag gene of HIV-1 encodes a single open reading frame of 55 kDa that contains three subdomains: the matrix domain (p17), the capsid domain (p24) and the nucleocapsid domain (p15). The p24 and p17 proteins have a predominant a-helical structure and perform important functions throughout thevirallife-cycle. The determination of gag-specific antibodies is important because declining titers of these antibodies herald clinical deterioration.In this work we present the results obtained on immunoreactiviy of synthetic peptides that mimic immunogenic a-helical regions of p24 and p17. The influence on the immunoreactivity of structural modifications in native sequences, including the addition of non immunogenic side chains: AAAC- and -CAAA on both side of minimal epitopes was evaluated in indirect and competitive enzymeimmunoassays. The conformational characteristcs to the peptides were analysed by circular dichroism and these results were correlated with that obtained in the immunoassays. It was shown that the reactivity of peptides mimicking short a-helical regions of p24 and p17 is improved by adding short non immunogenic chains on both N- and C- terminus. These modifications enhanced the immobilization of the peptides onto the solid support and allowed more accesibility to the minimal epitopes byspecific antibodies, in solution.

El gen gag del VIH-1 codifica una región de 55kDA que contiene tres subdominios: matriz (p17), cápside (p24) y nucleocápside (p15). Las proteínas p24 y p17 tienen una estructura predominante helicoidal y cumplen un rol importante en el ciclo de vida del virus. En este trabajo presentamos los resultados de inmunorreactividad de péptidos sintéticos que imitan regiones helicoidales de p24 y p17. Utilizando enzimoinmunoensayos se evaluó la influencia de modificaciones en las secuencias nativas sobre la capacidad de reconocimiento de anticuerpos específicos en solución y en fase sólida, incluyendo el agregado de cadenas no inmunogénicas en ambos extremos de los epitopes mínimos. La conformación de los péptidos se determinó por dicroísmo circular y los resultados se correlacionaron con los de inmunorreactividad. Se observó que la capacidad de reconocimiento de anticuerpos por péptidos pequeños que imitan estructuras helicoidales de p24 y p17 mejoró con el agregado de cadenas no inmunogénicas en ambos extremos de los epitopes. Estas modificaciones mejoran la inmovilización sobre las superficies sólidas y permiten una mayor accesibilidad de los anticuerpos a los epitopes mínimos en solución.

Identificación de proteínas espermáticas humanas involucradas en la interacción espermatozoide-zona pellucida / aaa

La interacción inicial entre las gametas es mediada por proteínas de superficie de la cabeza del espermatozoide y de la matriz extracelular del ovocito, la zona pellucida (ZP). El presente trabajo tuvo como objetivo la identificación de antígenos de superficie de espermatozoides humanos potencialmente involucrados en el reconocimiento de la ZP. Para ello se obtuvo un extracto de proteínas periféricas de espermatozoides humanos por tratamiento de las células con solución de alta fuerza iónica (HSE - High Salt Extract) (Buffer Pipes 100mM, pH 7,4; NaCl1M, sacarosa 0,25 M). Se desarrollaron anticuerpos policlonales (anti-HSE) que reconocieron numerosas proteínas en HSE (9-200 KDa). Las proteínas fueron separadas por electroforesis en geles de poliacrilamida, transferidas a membranas de nitrocelulosa y utilizadas para adsorber inmunoglobulinas de anti-HSE. Con éste método se obtuvieron anticuerpos contra dos polipéptidos mayoritarios de 49 (p49) y 66 (p66) kDa. Ambos anticuerpos (anti-p49 y anti-p66) reconocieron epitopes localizados en la cabeza y el flagelo de espermatozoides eyaculados y capacitados...

Nuevas fracciones antigénicas para el inmunodiagnóstico de la neurocisticercosis / New antigenic fractions for neurocysticercosis diagnosis

La neurocisticercosis (NCC) es la enfermedad parasitaria más frecuente del sistema nervioso central causada por la forma larvaria enquistada de la Taenia solium, su diagnóstico se basa en la integración de datos clínicos imagenológicos y serológicos. La detección de anticuerpos específicos usando el ensayo inmunoenzimático (ELISA) es una útil estrategia para confirmar el diagnóstico de la NCC. Estudios previos demuestran que la Taenia crassiceps y la Taenia solium tienen similitud estructural y antigénica; en este trabajo evaluamos antígenos de ambos parásitos frente a 68 líquidos cefalorraquídeos y 40 sueros pertenecientes a casos confirmados de NCC y a controles. Para cumplir tal objetivo enfrentamos en ELISA las muestras de los pacientes contra cada uno de tres extractos antigénicos de cada tenideo: el fluido vesicular, la membrana externa y el extracto total. El análisis estadístico demostró una alta sensibilidad y especificidad de los antígenos de la T.crassiceps, especialmente el fluido vesicular; el cual dio una sensibilidad de 90,3 por ciento, una especificidad de 94,5 por ciento y valores predictivos positivos y negativos de 93,3 por ciento y 92,1 por ciento frente a los LCR. Estos atributos hacen de esta fracción parasitaria una herramienta de gran utilidad en el diagnóstico de la NCC, pudiendo sustituir los antígenos procedentes de carcasas de cerdos infectados naturalmente con T.solinum

Identification of immunodeominant antigens by immunoelectrotranfer in hydatid fluid

A través de electroforésis en geles de poliacrilamina (SDS-PAGE) e inmunoelectrotransferencia (Western Blot), fueron identificados y caracterizados los antígenos immunodominantes del líquido hidatídico. Para ello, se estudiaron 23 pacientes con hidatidosis confirmadas, 12 con sospecha clínica de infección y serología positiva con los métodos convencionales (doble difusión con detección del arco 5 y ELISA), 28 individuos sanos y 23 con otras infecciones parasitarias y no parasitarias. Los resultados demostraron 7 bandas antigénicas localizadas entre los 8 y los 120 kDa. Dos bandas immunodominantes fueron reconocidas en los pacientes con hidatidosis comprobada y con serología positiva, sus pesos moleculares (PM) fueron de 8 y 12 kDa. Dos bandas inespecíficas fueron detectadas con los sueros de individuos sanos y con cisticercosis. Se concluye que las bandas de PM de 8 y 12 kDa son las de mayor valor diagnóstico a diferencia de las de 32 y 60 kDa que son inespecíficas

Imunopatologia da esclerose múltipla / Immunopathology of multiple sclerosis

A esclerose múltipla (EM) é uma doença do sistema nervoso central (SNC) na qual há destruiçäo da bainha de mielina e reaçäo inflamatória local. Acredita-se que seja uma resposta auto-imune desencadeada por fatores ambientais que induzem a superexpressäo de citocinas em indivíduos geneticamente predispostos. As citocinas implicadas nas exarcebações da EM, tais como IL-1, IL-2, IL-3, INFðy, TNF-alfa e TNF-ß, induzem a expressäo de moléculas específicas na membrana das células do SNC e ativam a funçäo fagocítica das células da micróglia

Organização do genoma de Trypanosoma cruzi: mapeamento físico e genético de uma região de 880 kb dos cromosomas que contém os genes codificadores dos antígenos imunodominantes H49 e JL8 / Genomic organization of Trypanosoma cruzi: physical and genetic mapping of region 880 kb of chromossomes which code imunodominant H49 antigen an JL8 genes

No Trypanosoma cruzi, agente etiológico da doença de Chagas, a maioria das proteínas antigênicas descritas até hoje possuem domínios repetitivos. Em trabalhos anteriores nosso grupo isolou um clone recombinante genômico, chamado H49, que codifica repetições de 68 aminoácidos presentes em um antígeno de alto peso molecular (Cotrim et al., 1990). O antígeno H49 é uma proteína estrutural associada ao citoesqueleto do parasita, localizando-se na região de interação do flagelo com o corpo celular (Cotrim et al., 1990 e 1995). Levin e col. (1989) isolaram um clone de cDNA, denominado JL8, codificando repetições de 14 aminoácidos presentes em uma proteína de 200 kb. O antígeno JL8 tem localização citoplasmática e sua função ainda não foi determinada (Lafaille et al., 1989, Levin et al., 1989). Os antígenos H49 e JL8 contém epitopos imunodominantes reconhecidos por anticorpos presentes na maioria dos soros de pacientes chagásicos crônicos (Franco da Silveira, 1992). O objetivo do nosso trabalho foi anlisar a organização dos genes h49 e jL8, e construir um mapa físico da região cromosômica que contém os loci h49 e jL8. Isto foi feito por análises de "Southern blot" contendo megafragmentos genômicos obtidos por digestões com enzimas de restrição que raramente tem sítios de reconhecimento. Utilizamos também o isolamento de clones YAC com sobreposição ("overlapping") constituindo um "cotig"dos cromosomas. Análises de restrição do DNA genômico e sequencialmento de clones genômicos e de cDNA indicaram que a maioria da proteína H49 é constituída de repetições de 68 aminoácidos, dispostas em tandem. O tamanho do gene foi estimado ser de aproximadamente 8 kb, baseando-se no tamanho do transcrito e da proteína nativa (300 kDa). A conservação dos nucleotídeos entre as repetições indicam que a homogeneização seletiva de sequência, as dá provalvemente através de conservação gênica mantendo conservada a sequência de aminoácidos. As formas alélicas do gene h49 foram mapeadas em dois fragmentos genômicos de cerca de 20 kb gerado por digestão com a enzima de restrição EcoRI. Em algumas cepas um alelo adicional foi localizado em um fragmento Eco RI de 9,7 kb. Baseando-se no tamanho do gene h49 (8 kb) nós assumimos que o fragmento genômico de 9,7 kb deve conter uma cópia do gene h49 enquanto o fragmento de 20 kb conteria duas cópias. Em várias cepas de T. cruzi, os genes h49 e jL8 foram mapeados em duas bandas cromosômicas de 2,6 Mb. ... (au)

Fenómeno de Weisser-Wechsberg (inhibición de la bacteriólisis): II. Inmunoglobulinas (IgG) de recién nacidos compiten con anticuerpos bactericidas del suero humano inmune a nivel del núcleo del lipopolisacárido (LPS-f5) de Brucella melitensis / Weisser-Wachsberg phenomenon (bactericidal inhibition): II. Newborn's immunoglobulins (IgG) compete with human immune serum's bactericide antibodies to level of lipopolysaccharide nucleus (LPS-f5) of Brucella melitensis

Introducción. El modelo de Brucellas melitensis lisa patólogena muestra que las inmunoglobulinas (IgG) de recién nacidos producen una inhibición de la bacteriólisis. No se sabe cual es la molécula implicada. Material y métodos. Por medio de liposomas se insertó lipopolisacárido (LPS) purificado de B. melitensis lisa patógena fracción 5 (LPS-f5). Se utilizó inmunotrasferencia en papel de nitrocelulosa para identificación del LPS-f5 por anticuerpos naturales e inmunes. Una prueba de bacteriólisis en cepas de B. melitensis M15 rugosa exenta de cadena lateral sirvió como modelo de inhibición al incubarse con IgG de recién nacidos y suero inmune. Resultados. Las IgG de recién nacidos remedan la bacteriólisis en un modelo liposomal. En la inmunotransferencia en papel de nitrocelulosa reconocen el núcleo de la molécula del LPS-f5 y producen inhibición de la bacteriólisis en la bacteria exenta de cadena lateral del PLS. Conclusiones. El núcleo del LPS en B. melitensis está implicado en el fenómeno de inhibición de la bacteriólisis por anticuerpos naturales