Estudo da encapsulação de fármacos antineoplásicos em sistemas nanoestruturados: Caracterização estrutural e efeito sinérgico de fármacos / Study of the encapsulation of antineoplastic drugs in nanostructured systems: Structured characterization and synergistic effect of drugs

Dentro da área da nanotecnologia, o sistema drug delivery vem sendo amplamente utilizado, cujo objetivo é proporcionar uma maior eficácia dos ativos farmacêuticos, podendo envolver desde uma distribuição mais seletiva dentro do organismo até a taxa que as moléculas serão liberadas e/ou a atenuação dos efeitos adversos provocados. Para isso, os ativos são encapsulados em nanoestruturas, podendo estas serem de natureza sintética ou natural. Dentre os nanocarreadores promissores encontram-se os cubossomos, que são nanoestruturas complexas capazes de encapsular ativos tanto hidrofílicos quanto hidrofóbicos. O objetivo deste projeto foi estudar a encapsulação de fármacos antineoplásicos em sistemas drug delivery contra linhagens celulares, investigando também as alterações estruturais sofridas pelos cubossomos e os efeitos sinérgicos dos fármacos, sendo eles: a doxorrubicina, a cisplatina, a vemurafenibe e a curcumina. As metodologias empregadas para elucidar o efeito das combinações dos fármacos, a estruturação da nanopartícula e sua citotoxicidade foram: os estudos de viabilidade celular pós-exposição, espalhamento dinâmico de luz, potencial zeta, análise de rastreamento de nanopartículas, espalhamento de raios-x a baixos ângulos, criomicroscopia eletrônica de transmissão, eficiência de encapsulação e ensaio de liberação. Inicialmente os fármacos foram testados isoladamente e em duplas, sendo utilizadas cinco linhagens celulares, afim de se promover um delineamento aos ensaios futuros. A partir destes resultados, foi-se optado por manter duas linhagens celulares, a HeLa, como representante de tecidos tumorais, e a HaCat, modelo de tecido saudável, devido a menor resistência apresentada por elas. Em relação as combinações entre as drogas, pode-se observar que todas as duplas formadas apresentaram resultados sinérgicos na linhagem tumoral, sendo mantida para os testes seguintes a combinação curcumina e vemurafenibe. Os cubossomos foram sintetizados eficientemente, sendo produzidos na ausência de fármacos bem como contendo curcumina e vemurafenibe. As nanopartículas apresentaram uma variação de diâmetro entre 189 ± 3 nm e 224 ± 2 nm, sendo o PDI entre 0,08 e 0,25. A conformação do cubossomo foi confirmada através da criomicroscopia eletrônica de transmissão e pelo espalhamento de raios-x a baixos ângulos, onde foi determinada uma estruturação característica de Pn3m. Para a eficiência de encapsulação os valores variaram entre 79% de encapsulação para a curcumina e 72% para a vemurafenibe, quando utilizadas isoladamente. No caso da encapsulação em dupla, os valores se converteram para 63% e 53% para a curcumina e vemurafenibe, respectivamente. A liberação das drogas do interior da nanopartícula oscilou entre 1500, 480 e 420 minutos para os cubossomos de curcumina, vemurafenibe e curcumina + vemunafenibe, respectivamente. Os testes de citotoxicidade demonstraram que as concentrações de 0,01 e 0,03 mg/mL foram capazes de promover uma viabilidade acima de 70%, porém, utilizando estas proporções não foi possível observar resultados significativos. Por fim, o sistema se mostrou estável e homogêneo, sendo capaz de promover a encapsulação dos fármacos tanto singularmente quanto em dupla e, apesar da quantidade de fármacos não ter sido suficiente para ocasionar alterações ao sistema celular, a execução deste trabalho abre portas para que novos estudos sejam realizados, podendo-se testar diferentes ativos bem como alterando a composição da nanopartícula afim de se reduzir a citotoxicidade

Within the area of nanotechnology, the drug delivery system has been widely used, whose objective is to provide greater effectiveness of pharmaceutical active ingredients, which may range from a more selective distribution within the organism to the rate at which the molecules will be released and/or the attenuation of adverse effects caused. To achieve this, the active ingredients are encapsulated in nanostructures, which may be synthetic or natural in nature. Among the promising nanocarriers are cubosomes, which are complex nanostructures capable of encapsulating both hydrophilic and hydrophobic active ingredients. The objective of this project was to study the encapsulation of antineoplastic drugs in drug delivery systems against cell lines, also investigating the structural changes undergone by the cubosomes and the synergistic effects ofthe drugs, namely: doxorubicin, cisplatin, vemurafenib and curcumin. The methodologies used to elucidate the effect of drug combinations, the structuring of the nanoparticle and its cytotoxicity were: post-exposure cell viability studies, dynamic light scattering, zeta potential, nanoparticle tracking analysis, small angle x-rays scattering, transmission electron cryomicroscopy, encapsulation efficiency and release assay. Initially, the drugs were tested alone and in pairs, using five cell lines, in order to promote a design for future trials. Based on these results, it was decided to maintain two cell lines, HeLa, as a representative oftumor tissues, and HaCat, a model ofhealthy tissue, due to their lower resistance. Regarding the combinations between the drugs, it can be observed that all the pairs formed presented synergistic results in the tumor lineage, with the combination of curcumin and vemurafenib being maintained for the following tests. Cubosomes were efficiently synthesized, being produced in the absence of drugs as well as containing curcumin and vemurafenib. The nanoparticles varied in diameter between 189 ± 3 nm and 224 ± 2 nm, with the PDI being between 0.08 and 0.25. The conformation ofthe cubosome was confirmed through transmission electron cryomicroscopy and small angle x-rays scattering, where a characteristic structure of Pn3m was determined. For encapsulation efficiency, values varied between 79% encapsulation for curcumin and 72% for vemurafenib, when used alone. ln the case of double encapsulation, the values converted to 63% and 53% for curcumin and vemurafenib, respectively. The release of drugs from the interior of the nanoparticle ranged between 1500, 480 and 420 minutes for the curcumin, vemurafenib and cubosomes with curcumin + vemunafenib, respectively. Cytotoxicity tests demonstrated that concentrations of 0.01 and 0.03 mg/mL were capable of promoting viability above 70%, however, using these proportions it was not possible to observe significant results. Finally, the system proved to be stable and homogeneous, being able to promote the encapsulation of drugs both singly and in pairs and, although the quantity of drugs was not enough to cause changes to the cellular system, the execution of this work opens doors for new studies are carried out, with the possibility oftesting different active ingredients as well as changing the composition of the nanoparticle in order to reduce cytotoxicity

Caracterização de cubossomos não-iônicos em presença de proteínas modelo: uma abordagem estrutural e funcional / Characterization of non-ionic cubosomes in the presence of model pro­teins: a structural and functional approach

Uma área de pesquisa que vem ganhando muita atenção nos últimos anos é a nanome­dicina, com especial atenção para os sistemas com entrega controlada de fármacos, ou drug delivery. Dentre as diversas nanopartículas utilizadas para este fim, destacam-se os sistemas formados por lipídeos e polímeros, como por exemplo os lipossomos e os cubossomos. Neste trabalho, é estudada a influência estrutural da lisozima e da curcumina, proteínas modelo. A lisozima é uma enzima antimicrobiana produzida por animais e que faz parte do sistema imunológico. Ela é uma hidrolase glicosídica que catalisa a hidrólise dos componentes da parede celular de bactérias gram-positivas. Esta hidrólise, por sua vez, compromete a integridade das paredes celulares, causando a lise (e como consequência a morte) das bactérias. Curcumina é um composto cristalino de cor amarelada brilhante, encontrada no caule da Curcuma longa (ou açafrão), que tem sido utilizada como corante ou até mesmo como aditivo alimentar. Este composto tem sido uma grande aposta no tratamento de doenças crônicas como inflamação, artrite, síndrome metabólica, doença hepática, obesidade, doenças neurodegenerativas e principalmente canceres, sendo também utilizada em estudos como potencial agente antibacteriano. O principal objetivo deste trabalho é construir sistemas nanoestruturados com potencial de atuarem como sistemas antimicrobianos, com a liberação controlada de ambos dos fármacos. Estes sistemas são compostos por cubossomos de fitantriol (PHY) em ausência e presença da lisozima, da curcumina e de suas combinações, a fim de analisar ação antimicrobiana conjunta da lisozima e da curcumina. As técnicas biofísicas utilizadas para caracterizar essas partículas são SAXS (espalhamento de raios-X em baixos ângulos), DLS (espalhamento dinâmico de luz), Cryo-TEM (criomicroscopia eletrônica de transmissão) e NTA (análise de rastreamento de nanopartículas). Foi possível verificar que as formulações lipídicas são eficazes na formação de estruturas cúbicas com estabilidade desejável. As nanopartículas cúbicas demonstraram alta capacidade de encapsulação da lisozima e da curcumina. A cinética de liberação desses medicamentos mostrou-se promissora, sugerindo que a encapsulação dos fármacos é eficaz, bem como a liberação controlada e direcionada. Duas linhagens de bactérias foram estudadas, sendo que a E. coli, não sofreu nenhum dano citotóxico, enquanto a Bacillus subtilis sim. Tal resultado indica o potencial antimicrobiano do sistema para alguns tipos de bactérias

An area of research that has gained significant attention in recent years is nanomedicine, with a particular focus on drug delivery systems. Among the various nanoparticles used for this purpose, lipid and polymer-based systems, such as liposomes and cubosomes stand out. This study investigate the structural influence of encapsulating lysozyme and curcumin, model compounds. Lysozyme is an antimicrobial enzyme produced by animals and is part of the immune system. It is a glycosidic hydrolase that catalyzes the hydrolysis of components in the cell walls of gram-positive bacteria. This hydrolysis compromises the integrity of cell walls, leading to the lysis (and consequently the death) of bacteria. Curcumin is a bright yellow crystalline compound found in the stem of Curcuma longa (or turmeric), commonly used as a dye or even as a food additive. It has been a significant focus in the treatment of chronic diseases such as inflammation, arthritis, metabolic syndrome, liver disease, obesity, neurodegenerative diseases, and especially cancers. It is also studied as a potential antibacterial agent. The main objective of this study is to construct nanostructured systems with the potential to act as antimicrobial agents, with controlled release of both drugs. These systems consist of phytantriol (PHY) cubosomes in the absence and presence of lysozyme, curcumin, and their combinations to analyze the joint antimicrobial action of lysozyme and curcumin. Biophysical techniques used for characterization include Small-Angle X-ray Scattering (SAXS), Dynamic Light Scattering (DLS), Cryo-Transmission Electron Microscopy (Cryo-TEM), and Nanoparticle Tracking Analysis (NTA). It was observed that lipid formulations are effective in forming cubic structures with desirable stability. Cubic nanoparticles have demonstrated a high encapsulation capacity for lysozyme and curcumin. The release kinetics of these drugs have shown promise, suggesting that drug encapsulation is effective, as well as their controlled and targeted release. Two bacterial strains were studied, with E. coli showing no cytotoxic damage, while Bacillus subtilis did. This result indicates the antimicrobial potential of the system against types of bacteria

Humberto Fernández-Morán (1924-1999) a pioneer in electron ultra-cryomicroscopy / Humberto Fernández-Morán (1924-1999) pionero en ultracriomicroscopía electrónica

SUMMARY: Humberto Fernández-Morán (1924-1999) a Venezuelan physician and biophysicist research, who developed the diamond knife. Furthermore he focused on improving the mechanical performance, accuracy and reliability of mocrotomes and ultramicrotomes which significantly advanced the development of electromagnetic lenses for electron microscopy based on superconducting technology. Promoter and founded of the Venezuelan Institute for Neurological and Brain Studies. He was a pioneer in electron ultra-cryomicroscopy field. Fernández-Morán taught and researched in University of Stockholm, Massachusetts Institute of Technology, Harvard University, Massachussetts General Hospital and the University of Chicago. He worked with NASA for the Apollo project in the field of physic-chemical analysis of lunar rocks.

RESUMEN: Humberto Fernández-Morán (1924-1999) médico venezolano e investigador biofísico, quien desarrolló el cuchillo de diamante. Además, se centró en mejorar el rendimiento mecánico, la precisión y la fiabilidad de los micrótomos y ultramicrótomos, lo que avanzó significativamente en el desarrollo de lentes electromagnéticos para microscopía electrónica basados en tecnología superconductora. Promotor y fundador del Instituto Venezolano de Estudios Neurológicos y Cerebrales. Fue pionero en el campo de la ultracriomicroscopía electrónica. Fernández-Morán enseñó e investigó en la Universidad de Estocolmo, el Instituto Tecnológico de Massachusetts, la Universidad de Harvard, el Hospital General de Massachussets y la Universidad de Chicago. Trabajó con la NASA para el proyecto Apollo en el campo del análisis físico-químico de rocas lunares.

Aplicaciones de la Criomicroscopía Electrónica en Producción de Vacunas contra el SARS-CoV-2 / Applications of Electronic Cryomicroscopy in Production of Vaccines against SARS-CoV-2

Este ensayo tiene como objetivo discutir los modelos de propuestas de vacunas contra la SARS-CoV-2 utilizando técnicas de Crio-TEM. Para ello se fundamenta en las ideas de Humberto Fernández-Moran cuando decía, "le llegó su hora a las biomoléculas", su Criomicroscopía Electrónica de Transmisión (Crio-MET) pasó de ser una técnica engorrosa y descriptiva, a ser fácil, estructural y más apropiada para los estudios de las macromoléculas en suspensión a alta resolución cercano al nivel atómico. Después de 50 años las técnicas propuestas y desarrolladas por este ilustre venezolano, son hoy en día vigente y de gran importancia ya que han servido de base a nuevas áreas de estudio como la farmacología molecular basadas en estos principios biofísicos. El Dr. Fernández-Moran logró predecir que "a temperaturas de Helio líquido (-180 °C) y alta velocidad de congelamiento, se podrían analizar estructuras biológicas a alta resolución y en estado dinámico e hidratado libre de cristales de hielo". La Criomicroscopía Electrónica de Transmisión (Crio-MET) es un método biofísico que se emplea para el estudio de biomoléculas y complejos moleculares congelados-hidratados a resoluciones cercanas al nivel atómico. Esta técnica trajo consigo la apertura de nuevas investigaciones en Farmacología Molecular. Su aplicación en el estudio y diseño de anticuerpos moleculares han sido exitosos en la formulación de nuevos fármacos de alta especificad sin la producción de los conocidos efectos secundarios. Hoy en día la Farmacología Molecular ha logrado grandes avances en la posible producción vacunas de enfermedades infecto contagiosas que afectan a la humanidad(AU)

This essay aims to discuss models of SARS-CoV-2 vac-cine proposals using Cryo-TEM techniques. It is based on ideas Humberto Fernández Moran; when he said, "time has come for biomolecules", his Electronic Cryomicroscopy Transmission, (Cryo-TEM), went from being a cumbersome and descriptive technique to being easy, struc-tural and more appropriate for studies of macromolecules in high resolution suspension close to atomic level. After 50 years the techniques proposed and developed by this illustri-ous Venezuelan, are today valid and of great importance since they have served as a basis for new areas of study, such as molecular pharmacology based on these biophysical principles. Dr. Fernandez Moran managed to predict that "at liquid Helium temperatures (-180 ° C) and high freezing speed, biological structures could be analyzed at high resolution and in a dy-namic and hydrated state free of ice crystals." Electronic Cryo-microscopy Transmission, (Cry-oTEM) is a biophysical method that is used to study biomol-ecules and frozen-hydrated molecular complexes at resolu-tions close to the atomic level. This technique brought with it the opening of new research in Molecular Pharmacology. Its application in the study and design of molecular antibodies has been successful in the for-mulation of new high-specific drugs without the production of the known side effects. Today, molecular pharmacology has made great progress in the possible production of vaccines in infectious contagious diseas-es that affect humanity(AU)

Predictive criteria of insignificant prostate cancer: what is the correspondence of linear extent to percentage of cancer in a single core?

Objective The aim of active surveillance of early prostate cancer is to individualize therapy by selecting for curative treatment only patients with significant cancer. Epstein’s criteria for prediction of clinically insignificant cancer in surgical specimens are widely used. Epstein’s criterion “no single core with >50% cancer” has no correspondence in linear extent. The aim of this study is to find a possible correspondence. Materials and Methods From a total of 401 consecutive patients submitted to radical prostatectomy, 17 (4.2%) met criteria for insignificant cancer in the surgical specimen. The clinicopathologic findings in the correspondent biopsies were compared with Epstein’s criteria for insignificant cancer. Cancer in a single core was evaluated in percentage as well as linear extent in mm. Results Comparing the clinicopathologic findings with Epstein’s criteria predictive of insignificant cancer, there was 100% concordance for clinical stage T1c, no Gleason pattern 4 or 5, ≤2 cores with cancer, and no single core with >50% cancer. However, only 25% had density ≤0.15. The mean, median and range of the maximum length of cancer in a single core in mm were 1.19, 1, and 0.5-2.5, respectively. Additionally, the mean, median, and range of length of cancer in all cores in mm were 1.47, 1.5, and 0.5-3, respectively. Conclusion To pathologists that use Epstein’s criteria predictive of insignificant cancer and measure linear extent in mm, our study favors that “no single core with >50% cancer” may correspond to >2.5 mm in linear extent. .

El mecanismo molecular de la regulación de la contracción muscular / The molecular mechanism for the regulation of muscle contraction

La estructura de los filamentos gruesos de músculo estriado en el estado relajado ha sido finalmente comprendida a nivel molecular. La estructura revela interacciones intra- e intermoleculares que mantienen las cabezas de miosina unidas formando hélices adosadas a la superficie del filamento grueso. La fosforilación de las cadenas ligeras reguladoras de la miosina induce el debilitamiento de estas interacciones permitiendo la activación de los filamentos gruesos, produciendo el desorden y la liberación de las cabezas de miosina, y permitiendo su interacción con los filamentos delgados. Estos resultados abren las puertas para la comprensión del mecanismo molecular de la regulación ligada a miosina de la contracción muscular, de relevancia ya que las mutaciones asociadas a la cardiomiopatía hipertrófica medioventricular están ubicadas cercanas al sitio de fosforilación en las cadenas ligeras reguladoras de miosina.