Estudio comparativo entre un test de antígeno y la prueba de la reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real (RT-PCR) para el diagnóstico de infección por COVID-19 en pediatría / Comparative study between an antigen test and the reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR) test for the diagnosis of COVID-19 in pediatrics

Introducción. La pandemia por COVID-19 ha puesto de manifiesto la necesidad de pruebas diagnósticas rápidas. La prueba de referencia es la reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real (RT-PCR). Requiere un equipo y personal capacitado, y su resultado puede llevar un tiempo de espera prolongado. El sistema BD Veritor® es el método rápido cromatográfico utilizado para la detección del antígeno del coronavirus de tipo 2 del síndrome respiratorio agudo grave, en individuos sintomáticos. El objetivo primario del siguiente trabajo es evaluar sensibilidad y especificidad del test de antígeno (TA) comparadas con la RT-PCR en población pediátrica. Población y métodos. Estudio prospectivo, de prueba diagnóstica. Se incluyó a todo menor de 17 años en los primeros 5 días de inicio de síntomas, que consultó desde julio de 2021 hasta febrero de 2022. Se calculó un mínimo de 300 muestras para lograr una precisión de ± 8,76 % y de ± 3,68 % para sensibilidad y especificidad respectivamente. Se analizaron en paralelo las muestras por ambas metodologías. Resultados. De 316 muestras pareadas, 33 fueron positivas por ambos métodos; 6 fueron positivas solo por RT-PCR. La especificidad del TA fue del 100 %; la sensibilidad, del 84,6 %, con un valor predictivo positivo y negativo del 100 % y del 98 % respectivamente. Conclusiones. El TA demostró ser útil en el diagnóstico de pacientes pediátricos con COVID-19 en los primeros 5 días de inicio de síntomas, aunque aquellos con TA negativo y alta sospecha clínica deberían confirmar su resultado con la RT-PCR.

Introduction. The COVID-19 pandemic has brought to light the need for rapid diagnostic tests. The gold standard test is reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR). RT-PCR requires equipment and trained personnel, and results may take a long waiting time. The BD Veritor® System is a rapid chromatographic method used for the detection of severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 antigen in symptomatic individuals. The primary objective of this study is to assess the sensitivity and specificity of the antigen test (AT) compared to the RT-PCR in the pediatric population. Population and methods. Prospective study with a diagnostic test. All children younger than 17 years in the first 5 days of symptom onset, who consulted between July 2021 and February 2022, were included. A minimum of 300 specimens was estimated to achieve an accuracy of ±8.76% and ±3.68% for sensitivity and specificity, respectively. Specimens were analyzed in parallel using both methodologies. Results. Of 316 paired samples, 33 were positive by both methods; 6 were positive only by RT-PCR. The specificity of the AT was 100%; sensitivity was 84.6%, with a positive and negative predictive value of 100% and 98%, respectively. Conclusions. The AT proved to be useful in the diagnosis of pediatric patients with COVID-19 in the first 5 days of symptom onset, although those with a negative AT and high clinical suspicion should confirm their result with a RT-PCR.

Detection of coronavirus-2 by real-time reverse transcription polymerase chain reaction in conjunctival swabs from patients with severe form of Coronavirus disease 2019 in São Paulo, Brazil

OBJECTIVES: To test conjunctival swabs from patients with laboratory-confirmed severe forms of coronavirus disease 2019 (COVID-19) for the presence of SARS-CoV-2 on real-time reverse-transcription polymerase chain reaction (rRT-PCR). METHODS: Fifty conjunctival swabs were collected from 50 in-patients with laboratory-confirmed severe forms of COVID-19 at the largest teaching hospital and referral center in Brazil (HCFMUSP, São Paulo, SP). The samples were tested for SARS-CoV-2 on rRT-PCR with the primers and probes described in the CDC protocol which amplify the region of the nucleocapsid N gene (2019_nCoV_N1 and 2019_nCoV_N2) of SARS-CoV-2 RNA and compared with naso/oropharyngeal swabs collected within 24 hours of the conjunctival swabs. RESULTS: Five conjunctival samples (10%) tested positive (amplification of the N1 and N2 primer/probe sets) while two conjunctival samples (4%) yielded inconclusive results (amplification of the N1 primer/probe set only). The naso/oropharyngeal swabs were positive for SARS-CoV-2 on rRT-PCR in 34 patients (68%), negative in 14 (28%) and inconclusive in 2 (4%). The 5 patients with positive conjunctival swabs had positive (n=2), negative (n=2) or inconclusive (n=1) naso/oropharyngeal swabs on rRT-PCR. Patients with negative or inconclusive naso/oropharyngeal swabs had the diagnosis of COVID-19 confirmed by previous positive rRT-PCR results or by serology. CONCLUSION: This is the first study to present conjunctival swab rRT-PCR results for SARS-CoV-2 in a Brazilian population. In our sample of 50 patients with severe forms of COVID-19, 10% had positive conjunctival swabs, most of which were correlated with positive naso/oropharyngeal rRT-PCR results.

Frecuencia de aberraciones moleculares en pacientes cubanos con leucemia mieloide aguda / Frequency of molecular disorders in Cuban patients with acute myeloid leukemia

Introducción: En el Instituto de Hematología e Inmunología se realiza el estudio molecular de las leucemias mieloides agudas (LMA). Para las leucemias mieloides agudas no promielocíticas (LPM) se determinan cuatro biomarcadores: los genes de fusión RUNX1-RUNX1T1 y CBF(-MYH11, la duplicación interna en tándem del gen FLT3 (DIT FLT3) y la mutación A del gen NPM1 (NPM1-A). Objetivo: Determinar la frecuencia de estos cuatro biomarcadores, en pacientes cubanos con leucemias mieloides agudas primaria no promielocíticas. Métodos: Se incluyeron 91 pacientes entre niños y adultos, estudiados en el Instituto durante tres años desde el debut. A partir de ARN de sangre medular se obtuvo ADN complementario por transcripción inversa; se amplificaron los fragmentos correspondientes mediante la reacción en cadena de la polimerasa y el producto se analizó por electroforesis capilar. Resultados: El RUNX1-RUNX1T1 apareció en el 24,2 por ciento, fue más frecuente en los pacientes pediátricos y disminuyó significativamente con la edad. El CBFβ-MYH11 solo se encontró en adultos (4,8 por ciento). La NPM1-A con 41 por ciento fue mayoritaria entre los adultos. La DIT FLT3 se observó en el 21,6 por ciento y no mostró relación con la edad. NPM1-A y DIT FLT3 fueron las aberraciones con mayor presencia simultánea. Conclusiones: Por primera vez se describe la frecuencia de los cuatro biomarcadores moleculares en los pacientes cubanos con leucemias mieloides agudas primaria no promielocíticas; su comportamiento fue similar a lo descrito por otros autores, aunque se encontraron algunas particularidades(AU)

Introduction: At the Institute of Hematology and Immunology, the molecular study of acute myeloid leukemias (AML) is carried out. For nonpromyelocytic acute myeloid leukemias, four biomarkers are determined: the RUNX1-RUNX1T1 and CBF(-MYH11 fusion genes, the internal tandem duplication of the FLT3 gene (DIT FLT3), and the A mutation of the NPM1 gene (NPM1-A). Objective: To determine the frequency of these four biomarkers in Cuban patients with nonpromyelocytic primary acute myeloid leukemias. Methods: 91 patients were included, children and adults, who were studied at the Institute for three years from their disease debut. Complementary DNA was obtained from medullary blood RNA by reverse transcription. The corresponding fragments were amplified by polymerase chain reaction and the product was analyzed by capillary electrophoresis. Results: RUNX1-RUNX1T1 appeared in 24.2 percent; it was more frequent in pediatric patients and decreased significantly with age. CBFβ-MYH11 was found only in adults (4.8 percent). NPM1-A, accounting for 41 percent, represented the majority among adults. FLT3 DIT was observed in 21.6 por ciento and was not related to age. NPM1-A and DIT FLT3 were the disorders with the greatest concurrence. Conclusions: For the first time, the frequency of the four molecular biomarkers is described in Cuban patients with primary non-promyelocytic acute myeloid leukemias. Its characterization was similar to that described by other authors, although some peculiarities were found(AU)

Serum expression of microRNA-16 in a cohort of Egyptian patients with ulcerative colitis and its correlation with disease extent and severity / Expressão sérica do microRNA-16 em uma coorte de pacientes egípcios com colite ulcerosa e sua correlação com a extensão e gravidade da doença

Abstract Ulcerative colitis is one of the IBDs. Its etiology and pathogenesis remain undefined with an interaction between environmental, genetic and immunological factors is the most accepted explanation. Several recent studies have examined microRNA expression in the peripheral blood and tissues from IBD patients. The study aims at assessing the expression of serum miR-16 in ulcerative colitis patients and its correlation with disease extent, activity and severity. It included 30 treatment naïve ulcerative colitis patients of different presentations. Serum miR-16 expression was assessed using reverse transcriptase quantitative real time PCR (RT-qPCR), and then correlated with that of a group of 20 healthy subjects to assess its role in diagnosis of ulcerative colitis. Also, it was correlated with disease extent (proctitis, left sided colitis, extensive colitis) and disease activity and severity indices (Truelove and Witts criteria, fecal calprotectin and UCEIS). Thirty ulcerative colitis patients were enrolled, 53% had mild, 37% had moderate, while 10% had severe disease. Concerning endoscopic extent, 8 had proctitis, 14 had left sided colitis and 8 had extensive colitis. Serum expression of miR-16 in the 30 patients were compared to that of the healthy control subjects. The patients' group showed median serum miR-16 expression of 1.91, 1.13 for the control group with a significant difference between both groups. Correlation between serum miR-16 expression with disease extent, activity and severity showed no significant relation. From the current study we can conclude that increased serum expression of miR-16 is associated with ulcerative colitis despite no significant relation to disease activity extent or severity.

Resumo A colite ulcerativa é uma das DII. Sua etiologia e patogênese permanecem indefinidas; a interação entre fatores ambientais, genéticos e imunológicos é a explicação mais aceita. Vários estudos recentes avaliaram a expressão de microRNA no sangue e tecidos periféricos em pacientes com DII. O presente estudo teve como objetivo avaliar a expressão do miR-16 sérico em pacientes com colite ulcerativa e sua correlação com a extensão, atividade e gravidade da doença. Foram incluídos 30 pacientes de colite ulcerativa, com diferentes apresentações, que ainda não haviam sido submetidos a nenhum tipo de tratamento. A expressão sérica de miR-16 foi avaliada usando transcrição reversa seguida de reação em cadeia da polimerase quantitativa (RT-qPCR) e, em seguida, correlacionada com a de um grupo de 20 indivíduos saudáveis para avaliar seu papel no diagnóstico de colite ulcerativa. Além disso, foi feita uma correlação com a extensão da doença (proctite, colite do lado esquerdo, colite extensa) e com os índices de atividade e gravidade da doença (critérios de Truelove e Witts, calprotectina fecal e UCEIS). Trinta pacientes com colite ulcerativa foram incluídos no estudo, classificada como leve em 53%, moderada em 37% e grave em 10%. Quanto à extensão endoscópica, oito apresentavam proctite, 14 apresentavam colite do lado esquerdo e oito apresentavam colite extensa. A expressão sérica de miR-16 nos 30 pacientes foi comparada à dos indivíduos controle saudáveis. No, grupo de pacientes, a expressão sérica de miR-16 foi de 1,91 (grupo controle: 1,13), uma diferença estatisticamente significativa entre os dois grupos. Não foi observada relação significativa entre a expressão sérica de miR-16 e a extensão, atividade e gravidade da doença. A partir do presente estudo, pode-se concluir que o aumento da expressão sérica do miR-16 está associado à colite ulcerativa, apesar de não haver relação significativa com a extensão ou gravidade da atividade da doença.

Monitorización de la capacidad de degradación de las nuevas bacterias haloalcalifílicas resistentes a cloruro de tributiltina (TBTCl) en una ubicación contaminada por butiltina / Monitoring the degradation capability of novel haloalkaliphilic tributyltin chloride (TBTCl) resistant bacteria from butyltin-polluted site

Tributyltin (TBT) is recognized as a major environmental problem at a global scale. Haloalkaliphilic tributyltin (TBT)-degrading bacteria may be a key factor in the remediation of TBT polluted sites. In this work, three haloalkaliphilic bacteria strains were isolated from a TBT-contaminated site in the Mediterranean Sea. After analysis of the 16S rRNA gene sequences the isolates were identified as Sphingobium sp. HS1, Stenotrophomonas chelatiphaga HS2 and Rhizobium borbori HS5. The optimal growth conditions for biodegradation of TBT by the three strains were pH 9 and 7% (w/v) salt concentration. S. chelatiphaga HS2 was the most effective TBT degrader and has the ability to transform most TBT into dibutyltin and monobutyltin (DBT and MBT). A gene was amplified from strain HS2 and identified as TBTB-permease-like, that encodes an ArsB-permease. A reverse transcription polymerase chain reaction analysis in the HS2 strain confirmed that the TBTB-permease-like gene contributes to TBT resistance. The three novel haloalkaliphilic TBT degraders have never been reported previously.

Se considera a la tributiltina (TBT) como un problema medioambiental serio a escala global. Las bacterias haloalcalifílicas degradadoras de TBT pueden constituir un factor clave para remediar áreas contaminadas con dicho xenobiótico. En este estudio se aislaron 3 cepas de bacterias haloalcalifílicas procedentes de un sitio contaminado con TBT en el mar Mediterráneo. Tras analizar las secuencias del gen de 16S del ARNr, se identificaron los aislados como Sphingo-bium sp. HS1, Stenotrophomonas chelatiphaga HS2 y Rhizobium borbori HS5. Las condiciones de crecimiento óptimas para la biodegradación de TBT por parte de las 3 cepas fueron pH 9 y 7% (p/v) de concentración de sal. S. chelatiphaga HS2 fue el degradador de TBT más efectivo, con capacidad de transformar la mayor parte de ese compuesto en dibutiltina y monobutiltina (DBT y MBT). Se amplificó un gen de la cepa HS2, que fue identificado como tipo TBTB-permeasa, que codifica para una ArsB permeasa. Un análisis de la cepa HS2 por reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa (RT PCR) confirmó que el gen TBTB-permeasa contribuye a la resistencia al TBT. Estos 3 nuevos degradadores haloalcalifílicos de TBT no habían sido reportados previamente.

Cloning, expression, and characterization of three ribosomal protein S13 genes in Sophora flavescens / Clonagem, expressão e caracterização de três proteínas ribossômicas S13 genes em Sophora flavescens

To characterize the structure and function of ribosomal protein S13 (RPS13), we identified fulllength open reading frames (ORFs) of three RPS13 genes (RPS13-1, RPS13-2, and RPS13-3) of the Chinese medicinal plant, Sophora flavescens. The target genes were amplified by reverse transcription-olymerase chain reaction (RT-PCR), ligated into the pET22b(+) vector, and then transformed into Escherichia coli BL21 competent cells for protein expression. The physicochemical properties, protein motif, evolution, and structural organization of the three RPS13 genes were analyzed using bioinformatics tools. The full-length ORFs (453 bp) of the three RPS13 genes of S. flavescens were cloned, and each encodes a protein of 151 amino acids in length, and their expression was detected by Western blotting. Bioinformatics analysis showed that RPS13s are stable proteins that are closely related to the 40S RPS13s of Vigna radiate var. radiate. Their three-dimensional structures included three -helices at the C-terminal and four -helices at the N-terminal, and the two clusters of helices were connected by a long random coil, which may help maintain the dynamic bridging interactions between the large and small subunits of the ribosome. The full-length ORFs of three RPS13 genes of S. flavescens were successfully cloned and expressed in vitro. The study of the physicochemical properties, evolution, and secondary and three-dimensional structures of the three proteins will provide the theoretical basis for further studies on the function of RPS13s in plants.

Objetivo: Para caracterizar a estrutura e a função da proteína ribossomal S13 (RPS13), identificamos fases de leitura abertas (ORFs) completas de três genes RPS13 (RPS13-1, RPS13-2 e RPS13-3) da planta medicinal chinesa, Sophora flavescens. Métodos: Os genes alvo foram amplificados por reação em cadeia da polimerase por transcrição reversa (RT-PCR), ligados ao vetor pET22b(+), e então transformados em células competentes de Escherichia coli BL21 para expressão protéica. As propriedades físico-químicas, o motivo protéico, a evolução e a organização estrutural dos três genes RPS13 foram analisados utilizando ferramentas de bioinformática. Resultados: ORFs completos (453 pb) dos três genes RPS13 de S. flavescens foram clonados, e cada um codifica uma proteína de 151 aminoácidos de comprimento, e sua expressão foi detectada por western blotting. A análise de bioinformática mostrou que as RPS13s são proteínas estáveis que estão intimamente relacionadas com as 40S RPS13s de Vigna radiata var. radiate. Suas estruturas tridimensionais incluíam três -hélices no C-terminal e quatro -hélices no N-terminal, e os dois aglomerados de hélices eram conectados por uma longa bobina aleatória, o que pode ajudar a manter as interações de ponte dinâmicas entre o subunidades grandes e pequenas do ribossomo. Conclusões: As ORFs completas de três genes RPS13 de S. flavescens foram clonadas e expressas com sucesso in vitro. O estudo das propriedades físico-químicas, evolução e estruturas secundárias e tridimensionais das três proteínas fornecerão a base teórica para estudos adicionais sobre a função das RPS13s em plantas.

Molecular characterization and expression analysis of cathepsin C in Chinese giant salamander (Andrias davidianus) after Aeromonas hydrophila infection

Background: Cathepsin C (CTSC) (dipeptidyl peptidase I, DPPI), is a member of the papain superfamily of cysteine proteases and involves in a variety of host reactions. However, the information of CTST in Chinese giant salamander (Andrias davidianus), an amphibian species with important evolutionary position and economic values, remained unclear. Results: The full-length salamander CTSC cDNA contained a 96 bp of 5'-UTR, a 1392 bp of ORF encoding 463 amino acids, and a 95 bp of 3'-UTR. The salamander CTSC possessed several sequence features similar to other reported CTSCs such as a signal peptide, a propeptide and a mature peptide. The active site triad of Cys, His and Asn were also found existing in salamander CTSC. Salamander CTSC mRNA was constitutively expressed in all the examined tissues with significantly variant expression level. The highest expression of CTSC was in intestine, followed with stomach, spleen, lung and brain. Following Aeromonas hydrophila infection for 12 h, salamander CTSC was significantly up-regulated in several tissues including lung, spleen, brain, kidney, heart, stomach and skin. Conclusion: CTSC plays roles in the immune response to bacterial infection, which provided valuable information for further studying the functions of CTSC in salamander.

Olfactomedin-like 2 A and B (OLFML2A and OLFML2B) expression profile in primates (human and baboon)

BACKGROUND: The olfactomedin-like domain (OLFML) is present in at least four families of proteins, including OLFML2A and OLFML2B, which are expressed in adult rat retina cells. However, no expression of their orthologous has ever been reported in human and baboon. OBJECTIVE: The aim of this study was to investigate the expression of OLFML2A and OLFML2B in ocular tissues of baboons (Papio hamadryas) and humans, as a key to elucidate OLFML function in eye physiology. METHODS: OLFML2A and OLFML2B cDNA detection in ocular tissues of these species was performed by RT-PCR. The amplicons were cloned and sequenced, phylogenetically analyzed and their proteins products were confirmed by immunofluorescence assays. RESULTS: OLFML2A and OLFML2B transcripts were found in human cornea, lens and retina and in baboon cornea, lens, iris and retina. The baboon OLFML2A and OLFML2B ORF sequences have 96% similarity with their human's orthologous. OLFML2A and OLFML2B evolution fits the hypothesis of purifying selection. Phylogenetic analysis shows clear orthology in OLFML2A genes, while OLFML2B orthology is not clear. CONCLUSIONS: Expression of OLFML2A and OLFML2B in human and baboon ocular tissues, including their high similarity, make the baboon a powerful model to deduce the physiological and/or metabolic function of these proteins in the eye.

Cadmium-induced apoptosis of Siberian tiger fibroblasts via disrupted intracellular homeostasis

BACKGROUND: Heavy metals can cause great harm to Siberian tigers in the natural environment. Cadmium (Cd2+) is an environmental contaminant that affects multiple cellular processes, including cell proliferation, differentiation, and survival. It has been shown to induce apoptosis in a variety of cell types and tissues. RESULTS: We investigated the apoptotic effects of Cd2+ on Siberian tiger fibroblasts in vitro. Our research revealed the typical signs of apoptosis after Cd²+ exposure. Apoptosis was dose- (0-4.8 µM) and duration-dependent (12-48 h), and proliferation was strongly inhibited. Cd²+ increased the activity of caspase-3, -8, and -9 and disrupted calcium homeostasis by causing oxidative stress and mitochondrial dysfunction. It also increased K+ efflux and altered the mRNA levels of Bax, Bcl-2, caspase-3, caspase-8, Fas, and p53. CONCLUSIONS: Our results suggest that Cd2+ triggers the apoptosis of Siberian tiger fibroblasts by disturbing intracellular homeostasis. These results will aid in our understanding of the effects of Cd2+ on Siberian tigers and in developing interventions to treat and prevent cadmium poisoning.

Optimization of the RNeasy Mini Kit to obtain high-quality total RNA from sessile cells of Staphylococcus aureus

Biofilm formed by Staphylococcus aureus is considered an important virulence trait in the pathogenesis of infections associated with implantable medical devices. Gene expression analyses are important strategies for determining the mechanisms involved in production and regulation of biofilm. Obtaining intact RNA preparations is the first and most critical step for these studies. In this article, we describe an optimized protocol for obtaining total RNA from sessile cells of S. aureus using the RNeasy Mini Kit. This method essentially consists of a few steps, as follows: 1) addition of acetone-ethanol to sessile cells, 2) lysis with lysostaphin at 37°C/10 min, 3) vigorous mixing, 4) three cycles of freezing and thawing, and 5) purification of the lysate in the RNeasy column. This simple pre-kit procedure yields high-quality total RNA from planktonic and sessile cells of S. aureus.

Molecular survey of porcine teschovirus, porcine sapelovirus, and enterovirus G in captive wild boars (Sus scrofa scrofa) of Paraná state, Brazil / Estudo molecular de teschovírus suíno, sapelovírus suíno e enterovírus G em javalis (Sus scrofa scrofa) de cativeiro no Paraná

Porcine teschovirus (PTV), porcine sapelovirus (PSV), and enterovirus G (EV-G) are infectious agents specific to pig host species that are endemically spread worldwide. This study aimed to investigate the natural infection by these porcine enteric picornaviruses in wild boars (Sus scrofa scrofa) of Paraná state, Brazil, and to evaluate peccaries (Pecari tajacu and Tayassu pecari) as alternative host species for these viruses. Fecal samples (n=36) from asymptomatic wild boars (n=22) with ages ranging from 2 to 7 months old (young, n=14) and 2 to 4 years old (adult, n=8) and from peccaries (6 to 8 months old, n=14) were collected from a farm and a zoo, respectively, both located in Paraná state. Reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR) and nested-PCR (n-PCR) assays targeting the 5'non-translated region of the virus genome were used for screening the viruses. Porcine enteric picornaviruses were detected in 12 out of the 22 wild boar fecal samples. According to each of the viruses, EV-G was most frequently (11/22, 50%) detected, followed by PTV (10/22, 45.5%) and PSV (4/22, 18.2%). Regarding the age groups, young wild boars were more frequently (9/14, 64.3%) infected with PTV, PSV, and EV-G than adult animals (3/8, 37.4%). One n-PCR amplified product for each of the viruses was submitted to sequencing analysis and the nucleotide sequences were compared with the related viruses, which showed similarities varying from 97.7% to 100% for PTV, 92.4% to 96.2% for PSV, and 87.1% to 100% for EV-G. Peccaries tested negative for the viruses and in this study they did not represent infection reservoirs. This study is the first to report the molecular detection of PTV, PSV, and EV-G from captive wild boars in a South American country and the first to screen peccaries as alternative host species for porcine enteric picornavirus.

Teschovírus suíno (PTV), sapelovírus suíno (PSV) e enterovírus G(EV-G) são agentes infecciosos específicos da espécie suína que estão endemicamente disseminados em todo o mundo. O objetivo deste estudo foi investigar a infecção natural por estes picornavírus entéricos suínos em javalis (Sus scrofa scrofa) do estado do Paraná, Brasil e avaliar pecaris (Pecari tajacu e Tayassu pecari) como hospedeiros alternativos para estes vírus. Amostras fecais (n=36) de javalis assintomáticos (n=22) com idades de 2 a 7 meses (jovens, n=14) e 2 a 4 anos (adultos, n=8) e de pecaris (6 a 8 meses de idade, n=14) foram coletadas em um cativeiro e zoológico, respectivamente, ambos localizados no estado do Paraná. A transcrição reversa seguida por reações da polimerase em cadeia (RT-PCR) e nested-PCR com alvo na região 5'-não traduzida do genoma viral foram utilizadas para a identificação dos vírus. Picornavírus entéricos suínos foram detectados em 12 das 22 amostras fecais de javalis. De acordo com cada um dos vírus, EV-G foi mais frequentemente (11/22, 50%) detectado, seguido pelo PTV (10/22; 45,5%) e PSV (4/22; 18,2%). Considerando os grupos de idade, javalis jovens foram mais frequentemente (9/14; 64,3%) infectados com PTV, PSV e EV-G do que os javalis adultos (3/8; 37,4%). Um produto amplificado na nested-PCR para cada um dos vírus foi submetido à análise de sequenciamento e as sequências de nucleotídeos foram comparadas com vírus relacionados, o que mostrou que as similaridades variaram entre 97,7% a 100% para o PTV, 92,4% a 96,2% para o PSV e 87,1% a 100% para o EV-G. Os pecaris foram negativos para as viroses investigadas e neste estudo não se apresentaram como hospedeiros alternativos para as infecções. Este estudo é o primeiro a relatar a detecção molecular de PTV, PSV e EV-G em javalis de cativeiro de um país da América Latina e o primeiro a avaliar pecaris como espécie hospedeira alternativa para picornavírus entéricos suínos.

Diagnóstico etiológico de enfermidades do sistema nervoso central de equinos no Estado de Minas Gerais, Brasil / Etiologic diagnosis of diseases of the central nervous system of horses in Minas Gerais State, Brazil

O Brasil possui o quarto maior rebanho equino do mundo, e o Estado de Minas Gerais detém o maior número de equinos do país. Portanto, um diagnóstico preciso das doenças neurológicas dos equinos é prioridade no estado. Sendo assim, o objetivo deste estudo foi identificar, utilizando a Reação em Cadeia pela Polimerase (PCR), os agentes infecciosos responsáveis por enfermidades que afetam o sistema nervoso central (SNC) de equinos. De janeiro de 2009 a janeiro de 2011, foi realizado um levantamento dos casos de encefalites e encefalomielites em equinos no Estado de Minas Gerais, utilizando-se amostras de SNC de equinos que morreram com sinais neurológicos. Das 217 amostras de SNC, 47 (21,7%) foram positivas para o vírus da raiva pelo método de imunofluorescência indireta e inoculação em camundongos. Nas 170 amostras negativas para o vírus da raiva, o herpes-vírus equino-1 (EHV-1) foi diagnosticado em 20 (11,8%) e o herpes-vírus suíno-1 (SHV-1), em uma amostra por meio de PCR, e o vírus encefalite de Saint Louis (SLEV), em outra amostra, através de transcrição reversa (RT) e PCR (RT-PCR). Constatou-se que o vírus da raiva é o principal agente causador de encefalite em equinos, apesar do crescente número de casos de encefalomielite associados ao EHV-1 no Estado de Minas Gerais.(AU)

Brazil has the fourth largest equine herd in the world and the State of Minas Gerais has the largest equine population in the country. Therefore, an accurate diagnosis of cases of neurologic diseases is a priority in Minas Gerais. The aim of this study was to identify by Polymerase Chain Reaction (PCR) infectious agents associated with neurological disease in the central nervous system (CNS) of horses. A survey of encephalitis and encephalomyelitis in horses in Minas Gerais State was performed on samples of CNS from horses that died with neurological signs from January 2009 to January 2011. Forty seven CNS samples from 217 (21.7%) horses were positive for rabies virus by the indirect immunofluorescence assay and mouse inoculation. Among the 170 samples that were negative for rabies, EHV-1 was detected in 20 (11.8%) and the swine herpesvirus-1 (SHV-1) was detected in one sample by PCR, and the Saint Louis encephalitis virus (SLEV) was identified in another sample by reverse transcription (RT) and PCR (RT-PCR). Rabies virus is the most common causative agent of encephalitis in horses, despite the increasing number of cases of encephalitis associated with EHV-1 in the State of Minas Gerais.(AU)

Pineal gland plays a role in gonadal development after eyelids separation in puppies / La glándula pineal juega un rol en el desarrollo gonadal luego de la separación de los párpados en cachorros

Several functional and morphological studies have been conducted on the pineal gland in many mammalian species; however, no published reports are available on the role of pineal gland on the gonadal development before and after eyelids separation in puppies. Therefore, this study aimed to trace the postnatal histo-morphological changes in the pineal gland and gonads of puppies before (2, 10 and 11 days old) and after (25, 35 and 40 days old) eyelids separation in an attempt to investigate the possible role of pineal gland on the gonadal development. In general, the differentiation of pineal cells, interstitial endocrine cells of testes and stromal ovarian cells coincides with the start of eyelids separation in puppies. Histological examination of stained pineal and gonadal slices of puppies after eyelids separation revealed a remarkable differentiation of pinealocytes and testicular interstitial endocrine cells, as well as presence of some evidence of folliculogenesis in ovary. Surprisingly, melatonin receptor (MT1) protein expression levels were significantly increased in the ovaries and testes of puppies after eyelids separation. Moreover, the mRNA and protein expression of AANAT, a rate-limiting enzyme in melatonin biosynthesis, was notably increased in the pineal gland of opened eyes puppies. Our results suggest an increase of melatonin production from the pineal gland of opened eyes puppies and this could play a vital role in the developmental changes observed in the gonads of these puppies.

Diversos estudios morfológicos y funcionales han sido realizados sobre la glándula pineal en distintas especies de mamíferos. Sin embargo, no hay informes publicados acerca del rol de la glándula pineal en el desarrollo gonadal antes y después de la separación de los párpados en cachorros. Este estudio tuvo como objetivo trazar los cambios histo-morfológicos postnatales en la glándula pineal y las gónadas de los cachorros antes (2, 10 y 11 días de edad) y después (25, 35 y 40 días de edad) de la separación de los párpados, en un intento por investigar el posible rol de la glándula pineal en el desarrollo gonadal. En general, la diferenciación de los pinealocitos, células intersticiales endocrinas de los testículos y las células estromales del ovario coincide con el inicio de la separación de los párpados en cachorros. El examen histológico de glándula pineal y los cortes gonadales de los cachorros, después de la separación de los párpados, reveló una notable diferenciación de los pinealocitos y las células intersticiales endocrinas testiculares, así como la posible evidencia de foliculogénesis en el ovario. Sorprendentemente, en el receptor de melatonina (MT1) los niveles de expresión de proteínas fueron significativamente superiores en los ovarios y los testículos de los cachorros después de la separación de los párpados. Además, el ARNm y la expresión de la proteína AANAT, una enzima limitante de la velocidad en la biosíntesis de la melatonina, aumentaron notablemente en la glándula pineal de los cachorros con los ojos abiertos. Nuestros resultados sugieren que existe un aumento de la producción de melatonina por parte de la glándula pineal en los cachorros con los ojos abiertos, lo que podría jugar un rol vital en los cambios evolutivos observados enlas gónadas de estos cachorros.

Transcriptional expression study in the central nervous system of rats: what gene should be used as internal control? / Estudo de expressão transcricional no sistema nervoso central de ratos: qual gene deve ser usado como controle interno?

Objective A growing number of published articles report the expression of specific genes with different behavior patterns in rats. The levels of messenger ribonucleic acid transcripts are usually analyzed by reverse transcription followed by polymerase chain reaction and quantified after normalization with an internal control or reference gene (housekeeping gene). Nevertheless, housekeeping genes exhibit different expression in the central nervous system, depending on the physiological conditions and the area of the brain to be studied. The choice of a good internal control gene is essential for obtaining reliable results. This study evaluated the expression of three housekeeping genes (beta-actin, cyclophilin A, and ubiquitin C) in different areas of the central nervous system in rats (olfactory bulb, hippocampus, striatum, and prefrontal cortex). Methods Wistar rats (virgin females, n=6) during the diestrum period were used. Total ribonucleic acid was extracted from each region of the brain; the complementary deoxyribonucleic acid was synthesized by reverse transcription and amplified by real-time quantitative polymerase chain reaction using SYBR™ Green and primers specific for each one of the reference genes. The stability of the expression was determined using NormFinder. Results Beta-actin was the most stable gene in the hippocampus and striatum, while cyclophilin A and ubiquitin C showed greater stability in the prefrontal cortex and the olfactory bulb, respectively. Conclusion Based on our study, further studies of gene expression using rats as animal models should take into consideration these results when choosing a reliable internal control gene. .

Objetivo Um número crescente de artigos publicados relaciona a expressão de genes específicos com diferentes padrões de comportamento em ratos. Os níveis de transcritos de ácido ribonucleico mensageiro são geralmente analisados por transcrição reversa, seguida de reação em cadeia da polimerase, e quantificados após a normalização com um controle interno ou gene de referência (gene housekeeping). No entanto, os genes housekeeping exibem expressão diferencial no sistema nervoso central, dependendo das condições fisiológicas e da área do cérebro a ser estudada. A escolha de um bom gene de controle interno é essencial para a obtenção de resultados confiáveis. Este estudo avaliou a expressão de três genes housekeeping (beta-actina, ciclofilina A e ubiquitina C) em diferentes áreas do sistema nervoso central de ratos (bulbo olfatório, hipocampo, estriado e córtex pré-frontal). Métodos Foram usadas ratas Wistar (fêmeas virgens, n=6) durante o período de diestro. O ácido ribonucleico total foi extraído a partir de cada região do cérebro; o ácido desoxirribonucleico complementar foi sintetizado por transcrição reversa e amplificado por reação em cadeia da polimerase quantitativo em tempo real utilizando SYBR® Green e primers específicos para cada um dos genes de referência. A estabilidade de expressão foi determinada utilizando NormFinder. Resultados A beta-actina foi o gene mais estável no hipocampo e estriado, enquanto a ciclofilina A e a ubiquitina C apresentaram maior estabilidade no córtex pré-frontal e no bulbo olfatório, respectivamente. Conclusão Com base em nosso trabalho, estudos posteriores de expressão gênica utilizando ratos como modelos animais devem levar ...

Efeito dual de FGF2 e PMA em células HEK 293 transformadas por H-rasV12 / Dual effects of FGF2 and PMA on H-rasV12 transformed HEK293 cell line

Sabe-se há décadas que mutações nos genes ras estão presentes em cerca de 20% dos cânceres humanos, mas o desenvolvimento de terapias eficazes para o tratamento de câncer dependente dos oncogenes ras permanece um desafio científico importante. Nesse contexto, o nosso grupo publicou recentemente resultados interessantes mostrando que FGF2 exógeno ou PMA, contrariamente à expectativa geral, inibem a proliferação de células de camundongo malignas dependentes dos oncogenes H- ou K-Ras. Para dar continuidade a estes estudos o projeto desta tese foi planejado para investigar os mecanismos subjacentes a possíveis efeitos citotóxicos de FGF2 e PMA em células humanas transformadas por ras. Para esse fim, a linhagem humana imortalizada HEK 293 foi condicionalmente transformada pela expressão ectópica da construção quimérica de DNA ER:H-rasV12, que codifica a oncoproteína de fusão ER:H-RasV12, cuja atividade é induzível por 4-hidroxi-tamoxifen (4OHT). Essa abordagem nos permitiu verificar os efeitos de FGF2 e PMA em sublinhagens HEK/ER:HrasV12 fenotipicamente "normais" ou transformadas por níveis crescentes da oncoproteína H-RasV12. Os principais resultados mostraram que tanto FGF2 como PMA tem efeito dual promovendo ou inibindo a proliferação das células transformadas em função da concentração intracelular crescente de H-RasV12. Ensaios de crescimento de colônias em suspensão de agarose mostraram que: a) as células parentais HEK293 não desenvolveram colônias mesmo quando tratadas com FGF2 ou PMA, resultados que estão de acordo com seu fenótipo não tumoral; b) mas, as sublinhagens HEK/ER:HrasV12 deram origem a colônias mesmo quando tratadas com concentrações pequenas de 4OHT, que condicionaram níveis intracelulares baixos de ER:HRasV12; nestas condições experimentais, FGF2 foi um forte promotor do crescimento de colônias, condizente com sua reconhecida atividade promotora do crescimento de células tumorais em suspensão; ainda nestas condições, PMA não teve efeito significante sobre o crescimento de colônias; c) coerentemente, concentrações elevadas de 4-OHT levaram aos níveis intracelulares mais altos de ER:HRasV12 e, por conseguinte, a desenvolvimento máximo de colônias de células HEK/ER:HrasV12, no entanto, nestas condições, ambos FGF2 e PMA inibiram completamente o crescimento de colônias. Por outro lado, transformação de HEK293 com um vetor de expressão constitutiva de HrasV12 levou à seleção e isolamento das sublinhagens tumorais HEK/HrasV12, cujo fenótipo se caracterizou por: a) nenhum efeito de FGF2 sobre a sua proliferação e b) forte inibição de sua proliferação por PMA. A ação citotóxica de PMA exclusivamente observada em células HEK 293 transformadas por H-rasV12 se caracterizou por: a) total dependência de PKC, provavelmente mediada pela ativação proteolítica específica de PKC δ; b) envolvimento de níveis elevados e sustentados de ROS com disparo tardio de apoptose

It is known for nearly 20 years that mutated ras oncogenes are found in 20% of human malignancies, however efficacious therapies are not yet available for Ras-driven cancer. Along of these lines, our group recently published provocative results showing, against common belief, that FGF2 and PMA inhibited proliferation of Ras-dependent malignant mouse cells. Aiming to gain insight into this intriguing phenomenon, the present thesis project was planned to investigate the possible cytotoxicity of FGF2 and PMA in human Ras-driven malignant cells. To this end an immortalized non-tumorigenic human cell line (HEK293) was stably transformed with the DNA construction ER:H-rasV12, which encodes the fusion protein ER:H-RasV12, whose activity requires activation by 4-hidroxitamoxifen (4-OHT). This approach allowed us to evaluate FGF2 and PMA effects on HEK/ER:HrasV12 sublines under switching from "normal" to transformed phenotypes upon 4-OHT induction. Our main results have shown that both FGF2 and PMA displayed dual effects promoting or inhibiting proliferation of HEK/ER:HrasV12 cells in function of ER:HRasV12 intracellular levels. Clonogenic assays in agarose suspension have shown: a) parental HEK293 line did not develop colonies under FGF2 and PMA treatment or not, in agreement with its non-tumorigenic nature; b) however, HEK/ER:HrasV12 sublines developed colonies even under low 4-OHT concentrations, which led to low ER:HRasV12 intracellular levels; under these conditions FGF2 strongly promoted colony growth and PMA had no effect; c) furthermore, in HEK/ER:HrasV12 sublines, elevated 4-OHT concentrations led to high ER:HRasV12 intracellular levels and maximal colony growth; but, under these experimental conditions both FGF2 and PMA abolished colony growth. On the other hand, HEK293 transformation with a vector that constitutively express HrasV12 yielded HEK/ER:HrasV12 sublines displaying the following phenotypic traits: a) non FGF2 effects on proliferation and b) severe proliferation inhibition by PMA. PMA toxicity, exclusively observed in HrasV12 -transformed HEK293 cells, was characterized by: a) total dependency on PKC, likely mediated by specific proteolytic activation of PKCδ; b) involvement of high and sustained ROS levels correlated with late apoptosis triggering

Desarrollo de un método de transcripción inversa seguida de reacción en cadena de la polimerasa para la detección del virus de la fiebre amarilla / Development of a reverse transcription polymerase chain reaction method for yellow fever virus detection

Introduction. Yellow fever is considered a re-emerging disease and is endemic in tropical regions of Africa and South America. At present, there are no standardized or commercialized kits available for yellow fever virus detection. Therefore, diagnosis must be made by time-consuming routine techniques, and sometimes, the virus or its proteins are not detected. Furthermore, co-circulation with other flaviviruses, including dengue virus, increases the difficulty of diagnosis. Objective. To develop a specific reverse transcriptase-polymerase chain reaction (RT-PCR) and nested PCR-based assay to improve the detection and diagnosis of yellow fever virus using both serum and fresh tissue samples. Materials and methods. RT-PCR primers were designed to amplify a short fragment of all yellow fever virus genotypes reported. A second set of primers was used in a nested PCR to increase sensitivity. Thirty-three clinical samples were tested with the standardized reaction. Results. The expected amplicon was obtained in 25 out of 33 samples analyzed using this approach, and 2 more samples tested positive after a subsequent nested PCR approach. Conclusion. This improved technique not only ensures the specific detection of a wide range of yellow fever virus genotypes but also may increase the sensitivity of detection by introducing a second round of amplification, allowing a rapid differential diagnosis between dengue and yellow fever infection, which is required for effective surveillance and opportune epidemiologic measures.

Introducción. La fiebre amarilla se considera una enfermedad reemergente y endémica en regiones tropicales de África y Suramérica. Actualmente, no existen estuches estandarizados o comerciales disponibles para la detección del virus de la fiebre amarilla y, por lo tanto, el diagnóstico debe hacerse mediante técnicas de rutina que consumen mucho tiempo y algunas veces no garantizan la detección del virus o de sus proteínas. Además, la cocirculación con otros flavivirus, incluyendo el del dengue, hacen el diagnóstico más complicado. Objetivo. Desarrollar un ensayo específico de amplificación basado en transcripción inversa seguida de reacción en cadena de la polimerasa, con el fin de mejorar la detección y el diagnóstico de la fiebre amarilla, tanto a partir de suero como de tejido fresco. Materiales y métodos. Se diseñaron iniciadores específicos para amplificar un fragmento conservado del virus de la fiebre amarilla. Un segundo par de iniciadores se usó en una reacción de amplificación anidada para incrementar la sensibilidad. Se probaron 33 muestras clínicas con la técnica estandarizada. Resultados. El amplímero esperado se obtuvo en 25 de las 33 muestras analizadas usando este método y 2 más resultaron positivas después de la reacción anidada. Conclusión. Esta técnica mejorada garantiza la detección de todos los genotipos virales de fiebre amarilla y puede incrementar la sensibilidad del ensayo introduciendo una segunda etapa de amplificación, lo cual permite el diagnóstico diferencial con infección por dengue y otros flavivirus, lo cual es de gran importancia para la vigilancia y la toma de medidas epidemiológicas oportunas.

Detección molecular y cuantificación del transcripto BCR-ABL1 en pacientes paraguayos con leucemia mieloide crónica / Molecular detection and quantification of the BCR-ABL1 transcript in paraguayan patients with chronic myeloid leukemia

La leucemia mieloide crónica (LMC) es una neoplasia mieloproliferativa asociada a la presencia del gen de fusión BCR-ABL1 en la célula madre hematopoyética producto de la translocación t(9;22) 8q34;q11.2). Este nuevo gen codifica para una proteína tirosin quinasa con actividad oncogénica. Este estudio descriptivo de corte transverso tuvo como objetivo identificar y cuantificar los transcriptos BCR-ABL1 mediante técnicas de biología molecular en pacientes con sospecha clínica y en tratamiento de LMC, que concurrieron al laboratorio de Genética Molecular del Instituto de Investigaciones en Ciencias de la Salud desde tres hospitales públicos de referencia. Se estudiaron un total de 69 pacientes a partir de los cuales se obtuvieron 19 muestras antes del inicio del tratamiento y 57 a distintos tiempo durante el tratamiento con inhibidor de tirosin quinasa. Se analizó el tipo de transcripto en 42 muestras hallándose la isoforma b3a2 en el 64%, la b2a2 en el 31% y ambas en el 5%. A partir de las cuantificaciones realizadas en 57 muestras en tratamiento se determinó la respuesta molecular a los inhibidores de la tirosina quinsa. El 61% no alcanzó la RM Mayor y el 30% obtuvo una RM Mayor o Completa. Este estudio logró implementar por primera vez a nivel nacional la detección y cuantificación del transcripto BCR-ABL1 en pacientes con LMC, introduciéndose una herramientanecesaria para el diagnóstico y seguimiento de la respuesta al tratamiento.

Os sítios adicionais de trans-splicing na 5' UTR dos genes trans-sialidase de Trypanosoma cruzi e avaliação de seus efeitos sobre a tradução / Additional trans-splicing sites in the 5 'UTR of the trans-sialidase gene Trypanosoma cruzi and evaluation of their effects on translation

A regulação gênica em tripanossomatídeos é policistrônica e ocorre de maneira pós-transcricional. [...] Para verificar se UTR de tamanhos diferentes possuem impacto na transcrição e, por conseguinte, na tradução de proteínas, selecionou-se genes da família de trans-sialidases, devido à importância destas no processo de invasão celular. A metodologia envolveu a extração de RNA total de T. cruzi CL-Brener, seguido da síntese de cDNA, PCR, clonagem dos produtos amplificados e seqüenciamento por Sanger e pelo uso do 454 Junior (Next Generation Sequencing – NSG). Como as trans-sialidases correspondem a uma família gênica de cópias múltiplas, usou-se a estratégia de sequenciamento de alto-desempenho na tentativa de cobrir o maior número possível de genes desta família. Para isso foram obtidos cDNAs de trans-sialidases de CL-Brener nas formas epimastigota e tripomastigota com o iniciador 5’UTRTCNA, os quais apresentaram UTR com tamanhos variados entre 65 – 187 pb, além da obtenção de cDNAs para esta família de proteínas, em epimastigotas CL-Brener, com o iniciador 5’TcTS, apresentando UTR variando de 171 a 221 pb, com similaridade de sequências entre elas. Com o intuito de avaliar a correspondência entre a transcrição dos RNAs de trans-sialidases e a sua tradução, houve a necessidade de identificação das proteínas. Desenvolvemos uma metodologia de lise celular e produção de extrato proteico (denominado TcS12) a partir de células de T. cruzi no estágio epimastigota. As cepas selecionadas para esse estudo foram CL-Brener (TcVI), Dm28c (TcI), Y (TcII) e 4167 (TcIV). O processo de lise celular foi otimizado para 107 parasitos/mL ressuspensos em 200 miL de tampão de lise hipotônica (por 30 minutos a 40C), associado ao sonicador de banho (por 30 minutos a 40C)...

Gene regulation in trypanosomatids is polycistronic and occurs in a post-transcriptionalway. [...] To verify the impact of UTRs presenting differentsizes in the transcription machinery and protein translation, genes from trans-sialidasefamily were selected due to its importance in the cell invasion process. Themethodological strategies involved the extraction of total RNA from T. cruzi CL-Brenerstrain, followed by cDNA synthesis, PCR, cloning and sequencing of amplified productsby Sanger and by using the 454 Junior (Next Generation Sequencing – NGS).Considering that trans-sialidase is a multi-copy gene family, this high-throughputsequencing strategy was employed in an attempt to cover the largest number of transsialidasegenes. Trans-sialidase cDNAs from CL-Brener epimastigote andtripomastigote were obtained with 5`UTRTCNA primer showing UTR sizes between 65 -187 bp. The cDNA from this protein family were also obtained with the 5’TcTS primerfrom CL-Brener epimastigotes, generating UTRs with 171 - 221 bp. Both 5’UTRpresented sequence similarities between them. In order to evaluate the correspondencebetween trans-sialidase gene transcription and translation, it was necessary toaccomplish the identification of proteins. Therefore, we developed a methodology forcell disruption, which resulted in a protein extract (referred as TcS12) from epimastigoteT. cruzi cells. The strains selected for this study were CL-Brener (TcVI), Dm28c (TcI), Y(TcII) and 4167 (TcIV). The process for lysing the cells was optimized to 107parasites/mL resuspended in 200 miL hypotonic lysis buffer (30 minutes at 4oC), followedby water bath sonication (30 minutes at 4oC). The process efficacy was confirmed byFACS, showing that near 72 percent of the cells were successfully stained with propidiumiodide solution (PI)...

Vigilância virológica dos vírus dengue: genotipagem e caracterização molecular de vírus isolado em mosquistos naturalmente infectados e humanos, 1986-2011 / Virological surveillance of dengue virus: genotyping and molecular characterization of viruses isolated from humans and naturally infected mosquistos, 1986-2011

O dengue tem se apresentado como um grave problema de saúde pública no Brasil, razão pela qual, vários estudos têm sido realizados com o intuito de esclarecer aspectos da epidemiologia dessa doença em diferentes localidades, com histórias distintas de circulação dos diferentes sorotipos dos vírus dengue (DENV). A implantação de um Programa de vigilância entomológica e virológica e, que desde 1986 visa detectar e monitorar a circulação dos sorotipos e genótipos DENV, resultou em distintas oportunidades, no isolamento de amostras de DENV de vetores e de casos humanos permitindo a caracterização molecular e a análise filogenética, fornecendo informações relevantes para a compreensão da interação vetor- vírus- humanos. O entendimento da variação genética no vírus quando este replica em mosquitos, e como essas variações atuam durante a transmissão entre humanos e mosquitos permanecem desconhecidos. Portanto, visando contribuir para um melhor conhecimento dos DENV e sua interação com o mosquito vetor, realizamos neste trabalho, a caracterização molecular e análise filogenética de DENV isolados de mosquitos naturalmente infectados e de casos humanos, provenientes de epidemias ocorridas entre 1986 e 2011 no Brasil. Foi demonstrado que os métodos moleculares foram fundamentais por facilitarem a rápida identificação dos vírus e consequentemente o monitoramento dos genótipos circulantes. A RT-PCR para a triagem de DENV em vetores se mostrou uma ferramenta útil para a vigilância virológica, com taxas de detecção que variaram de 0,78 por cento a 25 por cento no período estudado. A análise filogenética dos DENV-1 isolados de mosquitos e humanos mostrou que o genótipo V (Américas/África) continua o mesmo circulante desde a sua introdução, porém foi demonstrada a co-circulação de duas novas linhagens (II e III) no período de 2009 a 2011. O sequenciamento do genoma completo de DENV-3 isolado a partir de Ae. aegypti naturalmente infectados no Rio de Janeiro (RJ), assim como a análise da região 3´NC de vírus isolados em mosquitos e humanos, caracterizou estes vírus como pertencentes ao GIII e revelou a presença de inserções e deleções na região 3´NC do genoma. As deleções observadas na região 3´NC resultaram em estruturas secundárias porém nem todas as cepas com inserções nesta região apresentaram estrutura similar substituições exclusivas à cepa de DENV-3 isolada em mosquito foram observadas no gene NS5, incluindo a substituição que resultou na formação de um códon de terminação. O teste comercial Simplexa™ Dengue Real Time RT-PCR, disponível recentemente, foi utilizado pela primeira vez para detecção dos DENV e se mostrou um método molecular alternativo para as vigilâncias entomológica e virológica. O RT-PCR em Tempo Real possibilitou, pela primeira vez, a quantificação de DENV-1 e DENV-4 em fêmeas individuais naturalmente infectadas (1,6 x 104 cópias/mL e 1,08 x 103 cópias/mL, respectivamente). Considerando-se o elevado índice de infestação por Ae. aegypti em todo o país, o estudo da caracterização dos DENV circulantes torna-se de grande importância no conhecimento da relação vírus-vetor pela análise da variabilidade genética, dispersão e persistência de genótipos durante a transmissão destes vírus.

Phylogenetic characterization of bovine parainfluenza 3 from contaminated cell cultures and field isolates from Brazil

Genomic fragments of the HN and L genes from Brazilian bovine parainfluenza 3 virus (bPIV-3) isolated as contaminants from cell cultures and clinical specimens were amplified by reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR), sequenced using specific degenerate primers and analyzed by phylogenetic comparison with reference strains of bPI3V. The Brazilian isolates revealed a high degree of genomic when compared to SF4/32 prototype strain, within the recently proposed genotype A of bPIV-3.