Inclusion of molecular monitoring (BCR-ABL1) in the treatment of chronic myeloid leukemia in the Brazilian Public Health System (SUS): an urgent need for treatment management

ABSTRACT Introduction: Chronic Myeloid Leukemia (CML) is a myeloproliferative disease that affects mainly adults between 50 and 55 years. In Brazil, information from the Sistema Único de Saúde (SUS) Outpatient Information System indicates that 12,531 patients had the Autorização de Procedimento Ambulatorial (APAC) approved for the CML treatment in 2017. Disease monitoring through molecular response evaluation is critical to the care of CML patients. The quantitative PCR test (real-time polymerase chain reaction) provides adequate evaluation parameters that allow the health professional to intervene at the right moments in order to reduce the chance of progression of the disease, providing the best outcome to the patient, including the possibility of treatment discontinuation for eligible patients. Although the test is included in the Clinical Protocol and Therapeutic Guidelines (PCDT) of CML, it is not possible to monitor the molecular response within SUS since there is no reimbursement for this test. Objective: Obtain expert recommendations on the importance, financing, and reimbursement of molecular monitoring in SUS. Methods: Six CML experts with different perspectives participated in the panel. The discussion was based in the main publications about the quantitative PCR test in CML monitoring. Results: Experts' recommendations: Molecular monitoring should be part of the integral treatment of patients with CML to reduce the chances of disease progression and costs to the health system; The government should put into practice what is provided in the PCDT of Chronic Myeloid Leukemia in Brazil: performing the monitoring of the molecular response via quantitative PCR; The government should create a code with adequate nomenclature and reimbursement value in SIGTAP, so that the test is carried out and covered by the public health network, as it is contained in the PCDT of the disease and the existing APAC does not cover the operational costs for its performance; Patients with chronic phase CML should perform a quantitative PCR every 3 months and, after reaching the MMR, should perform the examination every 6 months, as recommended by international guidelines; Patients should be monitored in reference laboratories that are standardized according to the international scale; The laboratories that are within the reference public centers could absorb all the test demand in Brazil, and other centers could be qualified through an ABHH accreditation; Adequate molecular monitoring may allow some patients to stop taking drugs and selffinancing the molecular test for all SUS patients Conclusion: A solution for the molecular test (BCR-ABL1) funding is urgent to ensure the monitoring of CML patients in SUS. The savings that might be generated with patients that stop taking the medication when adequately monitored may finance the test.

Recomendaciones metodológicas para el monitoreo molecular BCR-ABL1 en pacientes con leucemia mieloide crónica por pcr cuantitativa en tiempo real / Guidelines for molecular monitoring of BCR-ABL1 in chronic myeloid leukemia patients by RT-qPCR

Actualmente las guías clínicas para el manejo de pacientes con leucemia mieloide crónica incluyen el monitoreo molecular de BCR-ABL1 por PCR cuantitativa en tiempo real; esta metodología permite definir la respuesta molecular. A pesar de la probada importancia pronóstica de la respuesta molecular, en muchos casos no se tiene en cuenta que la PCR cuantitativa puede producir datos muy variables, que pueden afectar la validez de los resultados, y hacer difícil la comparación entre diferentes laboratorios. Por lo tanto, para un manejo clínico óptimo, es absolutamente necesaria la estandarización de las metodologías de medición de BCR-ABL1. La estrategia para obtener valores de BCR-ABL1 comparables consiste en la adopción de la escala internacional. La conversión a la escala internacional se logra mediante la aplicación de un factor de conversión específico para cada laboratorio; este factor de conversión se puede obtener mediante el uso de calibradores secundarios validados, que hoy se producen en Argentina, en el marco del programa nacional de armonización. Por otra parte, con el objetivo de mitigar las diferencias entre laboratorios y facilitar criterios uniformes en la interpretación de los resultados y presentación de los informes, decidimos preparar estas guías de laboratorio. Esto permitirá además a los laboratorios poder evaluar su calidad de trabajo, tarea muy importante, en particular para aquellos centros más aislados, que no tienen fácil acceso a costosos kits comerciales o programas internacionales de intercambio de muestras.

Current clinical guidelines for managing chronic myeloid leukemia include molecular monitoring of BCR-ABL1 transcript quantitative reverse-transcription PCR. Despite the proven prognostic significance of molecular response, it is not widely appreciated that quantitative reverse-transcription PCR potentially produces highly variable data, which may affect the validity of results, making comparability between different laboratories difficult. Therefore, standardized reporting of BCR-ABL1 measurements is needed for optimal clinical management. An approach to achieve comparable BCR-ABL1 values is the use of an international reporting scale. Conversion to the international scale is achieved by the application of laboratory specific conversion factor that is obtained by using validated secondary reference calibrators. Moreover, with the aim to mitigate the interlaboratory imprecision of quantitative BCR-ABL1 measurements and to facilitate local laboratory results interpretation and reporting, we decide to prepare laboratory guidelines that will further facilitate interlaboratory comparative studies and independent quality-assessment programs, which are of paramount importance for worldwide standardization of BCR-ABL1 monitoring results, in particular for those most isolated laboratories, with not easy access to commercial kits or sample interchange programs.

Detección molecular del gen BCR-ABL por RT-PCR en niños costarricenses con leucemia

Molecular detection of the BCR-ABL gen by RT-PCR In Costa Rican children with leukemia. Many leukemias could have chromosomic translocations and according to the transcripts formed by the genes involved, the patients present an specific phenotype of the leukemia. We show the first results of the investigation of the gen BCR-ABL using RT-PCR, in order to look for the t(9;22)(q34;q11) in pediatric leukemic children. We studied in total 55 patients, 6 (10.9%) of them were positive for that translocation. Two (3.63%) of the positive children had ALL and the other 4 (7.27%) presented CML, the genotyping analysis of the transcript was studied in these children. With the introduction of this methodology as part of the routine studies, the leukemic children could get in the future an specific diagnosis, that will be important to classify them in prognostic categories and to improve the detection of minimal residual disease. Rev. Biol. Trop. 56 (4): 1613-1618. Epub 2008 December 12.

Muchas leucemias pueden presentar traslocaciones cromosómicas, las cuales, de acuerdo a los transcriptos formados por los genes involucrados, originará un fenotipo leucémica variable. En este trabajo se muestran los primeros resultados de pacientes pediátricos con leucemia, a los cuales se les hizo el estudio molecular por RT-PCR y el genotipaje para el gen BCR-ABL producto de la t(9;22)(q34;q11). De las 55 muestras estudiadas, 6 (10.9%) fueron positivas para el transcripto mencionado. De las 6 positivas, 2(3.63%) de esos pacientes tenían LLA y 4 (7.27%) eran LMC. La introducción de esta metodología en el manejo rutinario de los niños con leucemia, servirá para establecer un diagnóstico más preciso, un pronóstico más certero y un seguimiento adecuado de la enfermedad mínima residual.

Leucemia mieloide crónica: mecanismos genéticos de resistencia al mesilato de Imatinib (STI571) / Chronic myeloid leukemia genetic mechanisms of Imatinib resistance

La resistencia al tratamiento con Imatinib resulta de mecanismos dependientes del BCR/ABL tales como la sobreexpresión y la adquisición de mutaciones de punto en sitios críticos del dominio kinasa de ABL o de diferentes mecanismos independientes, como la evolución clonal. El propósito de este estudio fue identificar las mutaciones del dominio kinasa del gen ABL y la amplificación del reordenamiento genómico BCR/ABL en pacientes con LMC con falta o pérdida de respuesta hematológica y/o citogenética al tratamiento con Imatinib. Se incluyeron 71 pacientes, de los cuales 56 fueron evaluables. En trece pacientes (24 por ciento) se identificó algún mecanismo de resistencia: 10 (18 por ciento) presentaron mutaciones de punto en el dominio kinasa, 3 (5 por ciento) duplicación del cromosoma Ph' y sólo 1 (1 por ciento) mostró amplificación del BCR/ABL. La mutación T315I se observó en 1 caso. La mediana de edad fue significativamente menor [39 años (20-53)] en los pacientes en los que se encontraron mutaciones que en los casos sin ellas [51 años (24-75)] p=0.047. Se detectaron mutaciones en 1 de 29 (3 por ciento) pacientes en fase crónica, 8 de 20 (40 por ciento) pacientes en fase acelerada y en 1 de 8 (12 por ciento) pacientes en crisis blástica (p=0.001). La mediana de aparición de las mismas fue de 45 meses desde el diagnóstico de LMC (12-158) y 28.5 meses (1-56) desde el inicio de la terapia con Imatinib (p=0.591 y p=0.762 respectivamente). Las mutaciones en la región p-loop fueron las más frecuentes. El análisis univariado demostró que edad y fase de la enfermedad se asociaron significativamente con presencia de mutaciones. Las mutaciones en el dominio kinasa se reconocen como el principal mecanismo de resistencia al tratamiento con Imatinib y su detección puede determinar un cambio en la estrategia terapéutica.

Aspectos biológicos, genéticos e moleculares do gene BCR-ABL e sua relação com a Leucemogênese / Biological, genetic and molecular aspects of the BCR-ABL gene and its relationship with Leukemogenesis

O Cromossomo Philadelphia (Ph1) é conhecido como a primeira alteração cromossômica estrutural (translocação recíproca) envolvida em um tipo de câncer específico, sendo por este motivo, o mais bem caracterizado rearranjo cromossômico ligado à origem de leucemias. Sua origem está na translocação recíproca t(9;22), envolvendo o proto-oncogene ABL (9q34) e o gene BCR (22q11). A fusão destes genes forma o oncogene quimérico BCR-ABL, conhecido atualmente como marcador molecular da leucemia mielóide crônica (LMC), e apontado como fator significante na leucemogênese. A simples presença deste híbrido já é suficiente para conduzir a célula ao fenótipo neoplásico, contrariando estudos epidemiológicos referentes à gênese de cânceres. Diferentes pontos de quebra no gene BCR acabam produzindo transcritos de diferentes tamanhos, que codificam vários produtos quiméricos, como p190bcr-abl, p210bcr-abl e p230bcr-abl. A atuação destas proteínas parece estar ligada aos diferentes fenótipos leucêmicos, sendo responsáveis por modificações em vias intracelulares, como da proteína Ras, aquisição de fatores de crescimento, resistência ao processo de morte celular programada e desequilíbrio celular, promovendo a instabilidade genômica em células Ph1-positivas...

Diagnóstico do gene quimérico BCR-ABL e doença residual mínima em diferentes malignidades hematológicas

Estudos citogenéticos e moleculares em pacientes com leucemias são usados para a identificação de alterações gênicas com valor diagnóstico e prognóstico. Estes estudos, aqui apresentados, têm sido úteis para a caracterização e o monitoramento das leucemias associadas à presença de transcritos BCR-ABL, possibilitando a avaliação da doença residual mínima e a previsão da recaída.A análise molecular qualitativa e/ou quantitativa do gene quimérico BCR-ABL foi realizada em 80 pacientes através da Reação em Cadeia da Polimerase utilizando o ADN complementar ao ARN mensageiro após transcrição reversa (RT -PCR). A análise molecular por RT-PCR qualitativo foi usada para determinar diferentes pontos de quebras do gene quimérico (b3a2, b2a2, e1a2 e b2a3), permitindo a caracterização molecular de diferentes desordens hematológicas e monitoramento de diferentes procedimentos terapêuticos. Achados relacionados à expressão de BCR-ABL mostraram a utilidade de uma abordagem molecular rotineira para classificação de desordens mieloproliferativas e leucemias linfóides agudas Ph+ assim como no monitoramento dos tratamentos. A utilização do RT -PCR quantitativo, para estimar os níveis de BCR-ABLl/ABL em pacientes com LMC com diferentes tratamentos (Transplante de medula óssea (TMO), Infusão de linfócitos de doador (ILD) e Interferon (IFN) e em pacientes em remissão mostrou resultados consistentes. Este protocolo possibilitou um monitoramento preciso da doença residual mínima e de sua evolução, apresentando claras vantagens em relação às técnicas convencionais. O estudo preferencial por seqüenciamento de um paciente com LMC que apresentou um transcrito atípico ao diagnóstico possibilitou a caracterização do rearranjo b2a3 associado à um curso clínico agressivo. Finalmente, a análise citogenética e FISH realizados em 30 pacientes com suspeita de LMC ou após procedimentos terapêuticos para LMC permitiram o diagnóstico e a avaliação das terapias

Cytogenetic and molecular studies of leukaemic patients are useful for identifying gene rearrangements of diagnostic and prognostic significance associated to malignant transformation whose early detection has shown to be beneficial. The studies herein reported have been useful for characterising and monitoring leukaemias associated to presence of BCR-ABL transcripts as well as for assessing minimal residual disease and anticipating impending relapse. Qualitative and/or quantitative molecular analyses of the chimaeric BCRABL gene were carried out in 80 patients with Polymerase Chain Reaction assays amplifying complementary DNA following reverse transcription of messenger RNA (RT-PCR). Qualitative RT-PCR was used for identifying different breakpoints within the chimaeric BCR-ABL gene (b3a2, b2a2, e1a2, and b2a3), allowing for a molecular characterisation of different haematological disorders and monitoring different therapeutic procedures. Our findings indicated that detection of BCR-ABL transcripts should be routinely used for diagnosing myeloproliferative disorders and acute, Ph+ leukaemias as well as in serial studies following or during treatment. Quantitative RT-PCR assays, used for estimating BCR-ABL/ABL transcript levels in CML patients following or during treatment (Bone marrow transplantation, donor Iymphocyte infusion or interferon) and in remission, showed consistent results. These assays were useful for an accurate monitoring of minimal residual disease and its clinical progression, clearly preferable to conventional techniques. DNA sequence analysis of a CML patient who showed an atypical BCRABL transcript at diagnosis allowed for the characterisation of a b2a3 rearrangement associated to an aggressive clinical course. Finally, cytogenetic and FISH analyses of 30 patients with presumed CML or after CML therapy was useful for diagnosis and evaluation of therapeutic procedures

Detecçäo de mRNAs quiméricos BCR/ABL em pacientes portadores de leucemia mielóide crônica, leucemia linfóide aguda/mielóide aguda pela reaçäo de polimerizaçäo em cadeia (PCR) / Detection of BCR/ABL chimeric mRNAs in patients with chronic myeloid leukemia, acute lymphocytic leukemia/ acute myeloid by polimerase chain reaction (PCR)

A leucemia mielóide crônica (LMC) é uma doença caracterizada pela proliferaçao e acumulaçao de células mielóides e seus precursores, induzida pela transformaçao neoplásica de uma célula hematopoética pluripotente, a stem-cell. Esse clone possui uma anormalidade citogenética que se caracteriza pela translocaçao recíproca entre os cromossomos 9 e 22 [t(9;22) (q34;q11)], resultando na formaçao do cromossomo Philadelphia (Ph1). O resultado dessa translocaçao é a justaposiçao do gene BCR com o protooncogene ABL, originando um gene híbrido que codifica uma proteína anormal com atividade tirosina quinase exacerbada. A reaçao de polimerizaçao em cadeia (PCR) baseada na amplificaçao do cDNA híbrido BCR/ABL tem sido considerada um meio altamente sensível e específico para detecçao dessa patologia, em nível molecular. O RNA total foi extraído pelo método de isocianato de guanidina, de leucócitos de sangue periférico e (ou) medula óssea. A primeira fita (cDNA) foi sintetizada utilizando primer complementar à regiao 3' do mRNA quimérico BCR/ABL, transcriptase reversa (Super Script II - Gibco-BRL) segundo sugestao do fabricante. A reaçao de PCR foi realizada em duas etapas: a primeira utilizando primers complementares à regiao BCR e ABL, num total de 25 ciclos com temperatura de 94 graus Celsius, 49 graus Celsius e 72 graus Celsius para desnaturaçao, anelamento e extensao, respectivamente; na segunda etapa foram utilizados primers internos aos primeiros (Nested-PCR) num total de 35 ciclos com temperatura de anelamento de 60 graus Celsius (primers sintetizados pela Genomic - Engenharia Molecular, SP). O controle de todo o procedimento técnico foi realizado pela amplificaçao de uma regiao do gene ABL. A presença de bandas características da LMC foram visualizadas após eletroforese em gel de poliacrilamida 6 por cento e coloraçao por brometo de etídio. O método foi considerado extremamente sensível e rápido para a detecçao da t(9;22) quando comparada com a citogenética convencional.