Estudo de mutações nas proteínas virais E, NS3 e NS4B no genoma do vírus vacinal da Febre Amarela 17D / Study of mutations in the viral proteins E, NS3 and NS4B in the genome of the yellow fever vaccine virus 17D

RESUMO

Resumo A Febre Amarela (FA) é uma doença infecciosa não contagiosa, causada por um arbovírus e objeto de preocupação sanitária mundial. A principal medida de controle é a vacinação com o vírus atenuado da FA, cepa 17D, que é capaz de induzir resposta imune protetora a longo prazo com administração em dose única. Vírus atenuados são potentes vetores de expressão, pois disseminam o antígeno no hospedeiro e induzem resposta imune protetora, contribuindo para o desenvolvimento de vacinas recombinantes. Diversas estratégias foram desenvolvidas para expressão de genes heterólogos pelo vírus vacinal FA 17D. Entretanto, a inserção induz proliferação viral e imunogenicidade reduzidas. Neste trabalho foi utilizado o vírus vacinal FA 17D recombinante expressando a proteína repórter enhanced green fluorescent protein (EGFP) para avaliar o impacto de mutações específicas que possam modular a replicação viral. Mutações nas proteínas E, NS3 e NS4B foram descritas por aumentarem a proliferação viral em cultura de células e em camundongos, no genoma do vírus da dengue, sorotipos 1 e 2. As mutações em E400 (F→L), E403 (T→I), NS3439 (V→S) e NS4B54 (L→F) foram inseridas no genoma do vírus FA/EGFP, com a finalidade de caracterizar o seu efeito na proliferação viral e na indução de resposta imune humoral. O cDNA do genoma viral FA/EGFP foi utilizado para gerar vírus recombinantes carreando uma, duas ou três mutações. O estudo de proliferação viral foi realizado por cinética de infecção de células das linhagens Vero, Huh7 e C6/36. Os resultados mostram que os vírus da FA recombinantes se proliferam menos que o vírus vacinal FA 17DD. Além disso, a infectividade dos vírus mutantes em células de mamífero é diferente da infectividade em células de mosquitoOs vírus que carreiam as mutações em E400/NS3439 e E400/NS3439/NS4B54 tem a proliferação viral significativamente prejudicada em células de mamífero. Os vírus que carreiam a mutação em E400 apresentaram aumento de proliferação viral em comparação com o vírus FA/EGFP original, em células de mosquito. As diferenças entre os tipos celulares podem ter sido causadas pelas características fisiológicas das células durante a infecção viral e pelas diferenças de propriedades das proteínas virais ocasionadas pela inserção das mutações. Não foi possível recuperar partículas virais infecciosas carreando a mutação em E403. A modelagem molecular das proteínas virais mostrou diferenças discretas de carga, volume de superfície proteica e propriedade físico-química induzidas pelas mutações. Nenhuma das mutações influenciou nas interações intramoleculares. A imunogenicidade foi avaliada por imunização de camundongos das linhagens C57BL/6 e BALB/c com os vírus carreando mutações únicas e os soros foram analisados por PRNT e ELISA para obter os títulos de anticorpos neutralizantes para FA e anticorpos para GFP, respectivamente. Os soros dos camundongos imunizados com os vírus recombinantes apresentam menores títulos de anticorpos neutralizantes em comparação ao grupo imunizado com o vírus vacinal, porém não houveram alterações na indução de anticorpos para GFP. De maneira geral, as mutações em E400 e E403 produziram maiores efeitos sobre a proliferação viral e as mutações NS3439 e NS4B54, na imunogenicidade. (AU)