Resumo
Os objetivos desse estudo foram: 1) Avaliar a preservação da morfologia e desenvolvimento folicular, densidades foliculares e estromal do tecido ovariano canino vitrificado usando o dispositivo OTC (Ovarian Tissue Cryosystem) (Fase1); 2) Avaliar o efeito das regiões subcutâneas da pina e pescoço sobre a normalidade, densidade folicular e estromal, fibrose e proliferação estromal após autoenxerto ovariano canino (Fase 2). Na Fase 1, os fragmentos foram coletados por punch e vitrificados usando o OTC. Na Fase 2, os fragmentos foram autotransplantado na pina (Pi) e pescoço (Pe) e recuperados após 7 e 15 dias. Na Fase 1, após vitrificação, a porcentagem média total de folículos foi reduzida (P < .05). No entanto, os folículos primordiais se conservaram, a densidade folicular se manteve (P > .05) e a densidade estromal foi reduzida (P < .05). Na Fase 2, houve manutenção (P > .05) da normalidade folicular na Pi-15 e Pe-7, densidade folicular e estromal reduzida (P < .05) quando comparadas ao controle. A fibrose, identificada pela fibronectina, e deposição de colágenos tipo I, determinado por picrosirius, aumentaram quando comparados ao controle (P < .05) e a taxa de proliferação (PCNA) estromal foi superior na Pi-15 (P < .05). Concluímos que o OTC foi capaz de manter taxas satisfatórias de folículos normais na vitrificação de tecido ovariano canino e o autotransplante na região da pina foi capaz de manter a normalidade folicular após 15 dias.
The objectives of this study were: 1) Assess the preservation of follicular morphology and development, follicular and stromal densities of vitrified canine ovarian tissue using the OTC (Ovarian Tissue Cryosystem) device (Phase1); 2) Evaluate the effect of subcutaneous regions of the pinna and neck on normality, follicular and stromal density, fibrosis and stromal proliferation after canine ovarian autograft (Phase 2). In Phase 1, the fragments were collected by punch and glazed using OTC. In Phase 2, the fragments were autotransplanted into the pinna (Pi) and neck (Ne) and recovered after 7 and 15 days. In Phase 1, after vitrification, the mean total percentage of follicles was reduced (P < .05). However, the primordial follicles have been preserved, follicular density was maintained (P > .05) and stromal density was reduced (P < .05). In Phase 2, there was maintenance (P > .05) of follicular normality in Pi-15 and Ne-7, reduced follicular and stromal density (P < .05) when compared to control. Fibrosis, identified by fibronectin, and type I collagen deposition, determined by picrosirius, increased when compared to the control (P < .05), and the stromal proliferation rate (PCNA) was higher in Pi-15 (P < .05). We conclude that OTC was able to maintain satisfactory rates of normal follicles in the vitrification of canine ovarian tissue and autotransplantation in the pina region was able to maintain follicular normality after 15 days.
Resumo
Recentemente, o método de biopsy pick-up (BPU) tem sido considerado uma metodologia segura e apropriada para coletar fragmentos ovarianos in vivo de grandes animais (ex., bovinos e equinos). No entanto o uso de BPU para coletar tecido ovariano in vivo em cabras ainda não foi reportado. Os objetivos deste estudo foram: (i) testar diferentes tamanhos de agulha de biópsia para coletar o tecido ovariano in situ usando o método BPU (Experimento 1), e (ii) estudar características do tecido ovariano, como densidade, morfologia, distribuição de classe folicular pré-antral e densidade celular estromal em fragmentos de ovário obtidos in vivo através de um método de BPU laparoscópico (Experimento 2). No Experimento 1, os ovários de cabra (n = 20) foram coletados em um abatedouro e submetidos a BPU in situ. Foram testadas três agulhas (16, 18 e 20G). No Experimento 2, a agulha de biópsia mais eficiente do Experimento1 foi utilizada para realizar a BPU laparoscópica em cabras (n = 8). No Experimento 1, a taxa de recuperação foi maior (P < 0,05; variação de 50 a 62%) com agulhas 16G e 18G do que a agulha 20G (17%). O peso médio de fragmentos de ovário coletados pela agulha 16G foi maior (P < 0,05) do que a 18G e a 20G. No Experimento 2, 62 tentativas de BPU in vivo foram realizadas e 52 fragmentos de ovário foram coletados (taxa de sucesso de 90%). No total, 2.054 folículos pré-antrais foram registrados em 5.882 seções histológicas analisadas. A densidade folicular pré-antral média foi de 28,4 ± 1,3 folículos por cm2. A densidade folicular diferiu (P < 0,05) entre os animais e fragmentos ovarianos no mesmo animal. A densidade média das células do estroma nos fragmentos de ovário foi de 37,1 ± 0,5 células por 2500 m2 e diferiu (P < 0,05) entre os animais. Além disso, a densidade de folículos pré-antrais e a densidade de células do estroma foram associadas (P < 0,001). A porcentagem de folículos morfologicamente normais foi de 70,1 ± 1,2 e diferiu (P < 0,05) entre os animais. A maioria (79%) dos folículos morfologicamente normais foi classificada como folículo primordial e diferiu (P < 0,05) entre os animais e entre os ovários. Em resumo, um método de BPU laparoscópico foi desenvolvido para recuperar tecido ovariano in vivo em cabras com uma taxa de sucesso satisfatória. Além disso, este estudo descreveu pela primeira vez que fragmentos de biópsia de ovários de cabra apresentam alta heterogeneidade na densidade folicular, morfologia folicular, distribuição de classes foliculares e densidade de células estromais.
The biopsy pick-up (BPU) method has been considered a safe technique for collecting ovarian fragments from live animals. However, no studies have been reported on the use of BPU to collect ovarian tissue in vivo in goats. The objectives of this study were: (i) to test different sizes of biopsy needle to collect ovarian tissue in situ using the BPU method (Experiment 1), and (ii) to study characteristics of ovarian tissue such as density, morphology, class distribution preantral follicular and stromal cell density in ovary fragments obtained in vivo using a laparoscopic BPU method (Experiment 2). In Experiment 1, goat ovaries (n = 20) were collected in a slaughterhouse and submitted to BPU in situ. Three needles (16, 18 and 20G) were tested. In Experiment 2, the most efficient biopsy needle from Experiment 1 was used to perform laparoscopic BPU in goats (n = 8). In Experiment 1, the recovery rate was higher (P < 0.05, range 50-62%) with 16G and 18G needles than the 20G needle (17%). The mean weight of ovary fragments collected by the 16G needle was greater (P < 0.05) than the 18G and the 20G needle. In Experiment 2, 62 biopsy attempts were performed and 52 ovarian fragments were collected (90% success rate). Overall, 2,054 preantral follicles were recorded in 5,882 histological sections analyzed. The mean preantral follicular density was 28.4 ± 1.3 follicles per cm2. The follicular density differed (P < 0.05) between the animals and ovarian fragments in the same animal. The mean density of the stromal cells in the ovarian fragments was 37.1 ± 0.5 cells per 2500 m2, and differed (P < 0.05) between the animals. In addition, the preantral follicle density and the stromal cell density were associated (P < 0.001). The percentage of morphologically normal follicles was 70.1 ± 1.2 and differed (P < 0.05) among the animals. The majority (79%) of the morphologically normal follicles was classified as primordial follicles and differed (P < 0.05) between the animals and between the ovaries. In summary, a laparoscopic BPU method was developed to recover ovarian tissue in vivo with a satisfactory success rate in goats. In addition, this study described for the first time that goat ovarian biopsy fragments have high heterogeneity in follicular density, morphology, class distribution, and stromal cell density.