ESTUDO IN VITRO DA RESPOSTA DE MACRÓFAGOS NA INFECÇÃO COM MICROSPORUM CANIS

Os dermatófitos são fungos importantes para a saúde pública, são transmitidos entre animais e seres humanos causando zoonoses. Microsporum canis é o principal agente das dermatofitoses em cães e gatos. A imunidade inata desempenha importante papel frente à infecção contra dermatófitos; entretanto, existem poucos estudos sobre a relação entre resposta imune inata e M. canis. Assim, o objetivo deste trabalho foi avaliar a capacidade fagocítica, microbicida e imunomoduladora de macrófagos desafiados com microconídios de M. canis. Macrófagos murinos, tratados ou não com LPS (1µg/ml), foram infectados com M. canis na proporção de 0,25:1 (microconídios/macrófagos) e cultivados por 30 min, 1 h, 3 h e 6 h. Após cada intervalo, as lamínulas foram coletadas e coradas por Giemsa, contando-se duzentas células e calculando-se a porcentagem de macrófagos que internalizaram pelo menos um microconídio. O sobrenadante foi coletado para medir os níveis de citocinas e óxido nítrico, e checou-se a viabilidade celular e o perfil dos macrófagos durante a infecção. A porcentagem de fagocitose aumentou no transcorrer do tempo, atingindo o máximo às 6 h. A porcentagem de macrófagos não estimulados com LPS que fagocitaram microconídios foi de 28,0%, 33,5%, 62,5% e 71,5%, respectivamente em 30 min, 1 h, 3 h e 6 h. Nos macrófagos estimulados com LPS esta porcentagem foi de 34,5%, 47,5%, 67,0% e 74,0%, respectivamente nos intervalos de 30 min, 1 h, 3 h e 6 h. A produção de óxido nítrico foi similar em ambos, macrófagos estimulados ou não com LPS. Níveis de TNF aumentaram no transcorrer do tempo em macrófagos desafiados com M. canis estimulados ou não com LPS, quando comparados com macrófagos não infectados (p<0,05). Níveis superiores de IL-6 foram produzidos por macrófagos estimulados com LPS e infectados com M. canis no intervalo de 1 h (p<0,05). A viabilidade celular diminuiu com o tempo, com o pico de morte dos macrófagos às 6 h. O teste de microbicidade mostrou que, mesmo após a fagocitose, os microconídios de M. canis permaneciam viáveis dentro dos macrófagos. Os macrófagos mostraram um perfil M2, o qual produz uma tendência de resposta anti-inflamatória que favorece o crescimento fúngico. Macrófagos apresentaram alta atividade fagocítica frente o M. canis, a qual aumentou quando previamente estimulados com LPS. Estímulo com LPS também aumentou a produção de citocinas, sugerindo uma modulação na resposta à infecção. O aumento na produção das citocinas pró-inflamatórias TNF- e IL-6 que são importantes no recrutamento de novas células fagocíticas e na resolução da infecção, foi observado nos macrófagos desafiados com M. canis. Os resultados sugerem que, apesar dos macrófagos apresentarem atividade fagocítica e produção de citocinas quando desafiados com M. canis, sua viabilidade e a atividade microbicida são prejudicadas, não sendo capazes de controlar a infecção.

Dermatophytes are important fungi for public health, as they are transmitted between animals and humans causing zoonoses. Microsporum canis is the main agent of dermatophytosis in dogs and cats. Innate immunity plays an important role in the establishment of dermatophytic infection; however, there are few studies on the relationship between innate immune response and M. canis. Thus, the aim of this work was to evaluate the phagocytic, microbicidal and immunomodulatory capacity of macrophages challenged with M. canis microconidia. Murine macrophages, treated or not with LPS (1µg /ml), were infected with M. canis in a ratio of 0.25:1 (microconidia/macrophages) and incubated for 30 min, 1 h, 3 h, and 6 h. After each interval, the coverslips were collected and stained by Giemsa, counting two hundred cells and calculating the percentage of macrophages that internalized at least one microconidium. The supernatant was collected to measure cytokine and nitric oxide levels, and cell viability and macrophage profile during infection were checked. The percentage of phagocytosis increased over time, peaking at 6 h. The percentage of non-stimulated LPS macrophages that phagocytosed microconidia was 28.0%, 33.5%, 62.5%, and 71.5%, respectively at 30 min, 1 h, 3 h, and 6 h. In LPS-stimulated macrophages, these percentages were 34.5%, 47.5%, 67.0%, and 74.0%, respectively at 30 min, 1 h, 3 h, and 6 h intervals. Nitric oxide production was similar in both macrophages stimulated or not with LPS. TNF- levels increased over time in macrophages challenged with M. canis stimulated or not with LPS when compared to uninfected macrophages (p <0.05). Higher levels of IL-6 were produced by LPS-stimulated and M. canis-infected macrophages within 1 h (p <0.05). Cell viability decreased over time with macrophages death peak at 6 h. Microbicity test showed that even after phagocytosis, M. canis microconidia remained viable within the macrophages. Macrophages showed an M2 profile, which produces a tendency of anti-inflammatory response that favors fungal growth. Macrophages showed high phagocytic activity against M. canis, which increased when previously stimulated with LPS. LPS stimulation also increased cytokine production, suggesting a modulation in the response to infection. Increased production of pro-inflammatory cytokines TNF- and IL-6, which are important in recruiting new phagocytic cells and resolving the infection, was observed in macrophages challenged with M. canis. The results suggest that, although macrophages present phagocytic activity and cytokine production when challenged with M. canis, their viability and microbicidal activity are impaired and unable to control infection.

Pesquisa de dermatófitos em pets e no ambiente domiciliar

Dermatófitos são fungos importantes para a saúde pública, sendo transmitidos entre animais e humanos, causando zoonoses. Esses fungos têm sido relatados em cães, gatos, cobaias e coelhos, dentre outros pets, sendo isolados de animais com ou sem lesões, representando fontes de infecção para outros animais e homens. O objetivo deste trabalho foi diagnosticar dermatofitose em pets com lesões condizentes com esta infecção e pesquisar a presença de dermatófitos no seu ambiente domiciliar. Ainda, comparar duas técnicas de diagnóstico, exame direto e cultura, e duas técnicas de colheita de amostras clínicas, raspado de pele/tração de pelos e fricção com carpete. Foram colhidas amostras de pelame de 70 pets de ambos os gêneros, idades variadas e apresentando lesões compatíveis com dermatofitose no exame físico-clínico. Destas, 47 (67,1 %) oriundas de cães, 19 (27,1 %) de gatos, três (4,3 %) de cobaias e uma (1,4 %) de coelho. Foram visitadas 26 residências dos animais que tiveram a doença confirmada por cultura micológica. Colheram-se 212 amostras no ambiente domiciliar, 24 amostras de animais contactantes que habitavam a mesma residência e 188 de locais selecionados com a orientação dos proprietários, sendo: 78 (41,5%) amostras de locais de uso predominante do proprietário (sofás, cadeiras, camas, lençóis), 66 (35,1%) de uso predominante dos animais (casinhas, caminhas, brinquedos, comedouros) e 44 (23,4%) de pisos no geral (carpete, madeira, frio). Foram utilizadas 67 amostras para se comparar as duas técnicas de colheita e 66 para as duas técnicas de diagnóstico. Amostras clínicas provenientes dos animais e do ambiente foram semeadas em placas contendo ágar Mycobiotic (Difco), incubadas a 25° C por até quatro semanas. As colônias isoladas foram submetidas à técnica de microcultivo em lâmina e identificadas por meio de suas características macro e microscópicas. Na realização do exame direto, utilizou-se hidróxido de potássio (KOH) a 20% para clarificação dos pelos e escamas de pele e as leituras microscópicas realizadas com aumentos de 100X e 400X. Para a comparação entre as técnicas de diagnóstico e as de colheita, aplicou-se o teste de McNemar (p0,05). Dermatófitos foram verificados em 37,1% (26/70) das amostras de pelame provenientes dos animais suspeitos. Microsporum canis foi a espécie mais frequente, sendo isolada de 20 animais, 12 cães e oito gatos (76,9% - 20/26); Trichophyton quinckeanum de três cobaias (11,5% - 3/26); Microsporum gypseum de dois cães (7,7% - 2/26) e Trichophyton mentagrophytes de um gato (3,8% - 1/26). Foram encontrados dermatófitos em 69,2% (18/26) das casas pesquisadas. Dentre as amostras colhidas do ambiente domiciliar, 34,6% (65/188) foram positivas, isolando-se dermatófitos em 29,5% (23/78) daquelas provenientes de locais/objetos de uso predominante do proprietário, 42,4% (28/66) de uso predominante do animal, 31,8% (14/44) de pisos e de 50% (12/24) dos animais contactantes. Nas residências foram isoladas as mesmas espécies de fungos dermatófitos previamente detectadas nos animais doentes. Na comparação entre as técnicas de colheita não houve diferença estatística (p=1), podendo-se indicar qualquer uma delas. Na comparação entre as técnicas de diagnóstico, houve diferença estatística (p=0,03), sendo a cultura (22/66 - 33,3%) superior ao exame direto (9/66 - 13,6%). Contactantes que não apresentavam lesões, mas dos quais foram isolados dermatófitos, são considerados portadores assintomáticos e também representam fontes de infecção, auxiliando na disseminação dos dermatófitos no ambiente domiciliar. O contato entre homens e pets é cada vez mais estreito, compartilhando os mesmos espaços em uma residência e tornando a dermatofitose importante assunto nas clínicas médica e veterinária, e em Saúde Pública.

Dermatophytes are important fungi for public health, being transmitted between animals and humans, causing zoonosis. These fungi have been reported in dogs, cats, guinea pigs, and rabbits, among other pets, being isolated from animals with or without lesions, representing infection sources for other animals and human beings. The aim of this research was to diagnose dermatophytosis in pets with lesions clinically consistent with this infection; investigate the presence of dermatophytes in their household environment; compare two diagnosis techniques: direct examination and culture; and two techniques to collect clinical samples, skin scraping/hair traction, and rubbing the haircoat with a carpet. Samples from haircoat were collected from 70 pets of both genders and varying ages. Of these samples, 47 (67.1%) were from dogs, 19 (27.1%) from cats, three (4.3%) from guinea pigs and one (1.4%) from a rabbit. There were visited 26 homes of animals that had the disease confirmed by mycological culture. There were collected 212 samples in the household environments, 24 samples from other animals that were in contact with the infected animals and 188 from selecting objects/sites with the help of owners. Many of these sites were of human-animal common use, but they were categorized as follows: 78 (41.5%) samples from sites that were of predominant use by the owners (sofas, chairs, beds, sheets); 66 (35.1%) samples from sites of predominant use by the animals (animals houses, cribs, toys, feeders); and 44 (23.4%) samples from general flooring (carpet, wood). To compare the collecting techniques, we collected 67 samples originating in pets, using both methods mentioned above. To compare the diagnostic techniques, direct examination and culture, 66 samples have been used. Samples from the animals and the environment were seeded on Mycosel agar (BBL-BD) and incubated at 25° C for up to four weeks. Colonies were submitted to microculture technique and identified by their macro-and-microscopic characteristics. For direct examination, skin scales/hair have been clarified with 20% potassium hydroxide (KOH), and optical microscope readings were taken at 100X and 400X. Statistical analysis to compare the employed techniques was performed using the McNemar test (p0.05). Dermatophytes were found in 37.1% (26/70) of the samples originated in sick animals. Microsporum canis was the most prevalent dermatophyte isolated in 20 animals (20/26-76.9%), 12 dogs and eight cats; Trichophyton quinckeanum was isolated in three guinea pigs (3/26-11.5%), Microsporum gypseum in two dogs (2/26- 7.7%) and Trichophyton mentagrophytes in a cat (1/26 - 3.8%). Dermatophytes were found in 69.2% (18/26) of the surveyed homes. Among the samples taken from household environments, 34.6% (65/188) were positive, with dermatophytes isolated in 29.5% (23/78) of the sites/objects of predominant use by owners, 42.4% (28/66) from sites/objects of prevalent animal use, 31.8% (14/44) from floors, and 50.0% (12/24) from animals that had some contact with infected animals. The same species of dermatophytes previously detected in animals with lesions were isolated in homes. Isolation of dermatophytes was obtained in 23/67 (34.3%) and 22/67 (32.8%) samples, collected respectively by hair traction and carpet friction, with no statistical differences between the two methods (p=1). Between the diagnostic techniques, 9/66 (13.6%) samples were positive on direct examination and 22/66 (33.3%) in culture, though the last method was statistically superior (p=0.03). Animals that showed no lesions, but from which dermatophytes had been isolated, were considered asymptomatic carriers, and they also represent sources of infection, helping to spread the fungus in the household environment. Nowadays the contact between humans and pets is becoming more intimate, with greater sharing of the same space in a home, making dermatophytosis important in medical/veterinary clinics and in public health as a whole.