Resumo
A utilização da espécie caprina em tecnologias de reprodução assistida deve ser atrelada a um manejo nutricional adequado para viabilizar a produção de oócitos e embriões de boa qualidade. Diante desse contexto, este trabalho objetivou avaliar o efeito de diferentes suplementações alimentares por curto período sobre o desenvolvimento folicular, qualidade oocitária, atividade mitocondrial e produção in vitro de embriões em cabras. Para estas avaliações, os animais foram homogeneamente selecionados e divididos em três grupos de 10 animais cada (Controle, Linhaça, Glicerina), cujas dietas foram ofertadas na forma de Ração Mista Total (RMT), composta por capim-elefante picado e concentrado, durante sete dias. Os animais foram submetidos a um protocolo de sincronização e estimulação hormonal por um período de 12 dias, iniciando com a inserção de progestágeno intravaginal, seguido da administração de cinco doses de pFSH com intervalo de 12 horas entre D9 e D11, com subsequente abate no D12, 6 h após a última injeção de pFSH. Neste período também realizou-se ultrassonografia ovariana, para avaliação da dinâmica folicular, através do equipamento de ultrassom modo B com sonda linear, cujos exames foram gravados por animal, seguido da captura e análise de imagens. Realizou-se também coletas de sangue no primeiro e último dia de tratamento, as quais foram centrifugadas e armazenadas para análises de glicose, colesterol e triglicerídeos. Logo após o abate os ovários foram coletados e transportados ao laboratório, para a coleta dos conteúdos foliculares via aspiração, o fluido folicular obtido foi centrifugado e armazenamento para posteriores análises de colesterol total, glicose, triglicérideo e atividade da glutationa peroxidase (GPx). Os CCO adquiridos foram selecionados, e separados por grau (GI a G-III), os quais parte destes foram destinados à maturação in vitro e em seguida ativados partenogeneticamente, e outra fração foi realizada a separação dos oócitos e células da granulosa, para a análise da expressão gênica de COX-1, NRF-1, PPARGC1- e GDF-9. As dietas não afetaram a maturação oocitária ou taxa de clivagem, porém o grupo controle apresentou maior proporção de embriões de boa qualidade. A taxa de glicose, assim como a expressão de NRF-1 em oócitos foram maiores no grupo glicerina, quando comparada aos animais controle. O grupo glicerina também apresentou maior proporção de folículos pequenos e redução de folículos grandes. O grupo linhaça apresentou maiores níveis de colesterol plasmático e aumento da atividade da GPx no fluido folicular, além de maior taxa de crescimento folicular. Nenhum efeito da dieta foi observado na proporção de folículos pequenos ou grandes encontrados no momento da coleta do CCO. Concluiu-se então, que a nutrição de curto prazo utilizando nutrientes específicos promove alterações na composição do fluido folicular e expressão gênica em oócitos, porém sem comprometer a qualidade oocitária e a produção de embriões em caprinos. Além disso, os suplementos promoveram mudanças significativas na dinâmica folicular, induzindo menor depleção folicular (Glicerina) e aumento na taxa de crescimento folicular (Linhaça) sem comprometer a viabilidade dos oócitos coletados.
The use of goat species in assisted reproduction technologies should be linked to proper nutritional management to enable the production of oocytes and embryos of good quality. Given this context, this study aimed to evaluate the effect of different short-term dietary supplements on follicular development, oocyte quality, mitochondrial activity and in vitro embryo production in goats. For these evaluations, the animals were homogeneously selected and divided into three groups of 10 animals each (Control, Flaxseed, Glycerin), whose diets were offered in the form of Total Mixed Feed (TMR), composed of chopped and concentrated elephant grass during seven days. The animals underwent a 12-day hormonal stimulation and synchronization protocol, beginning with intravaginal progestogen insertion, followed by administration of five doses of pFSH 12 hours apart between D9 and D11, with subsequent slaughter at D12 , 6 h after the last pFSH injection. During this period, ovarian ultrasonography was also performed to assess follicular dynamics using the linear-mode B-mode ultrasound equipment, which was recorded by animal, followed by image capture and analysis. Blood samples were also collected on the first and last days of treatment, which were centrifuged and stored for glucose, cholesterol and triglyceride analyzes. Immediately after slaughter the ovaries were collected and transported to the laboratory for collection of follicular contents via aspiration, the follicular fluid obtained was centrifuged and stored for further analysis of total cholesterol, glucose, triglyceride and glutathione peroxidase (GPx) activity. The acquired CCO were selected and separated by grade (GI to G-III), part of which was destined for in vitro maturation and then parthenogenetically activated, and another fraction was performed to separate the oocytes and granulosa cells for gene expression analysis of COX-1, NRF-1, PPARGC1- and GDF-9. Diets did not affect oocyte maturation or cleavage rate, but the control group had a higher proportion of good quality embryos. Glucose rate as well as NRF-1 expression in oocytes were higher in the glycerin group when compared to control animals. The glycerin group also had a higher proportion of small follicles and reduction of large follicles. The flaxseed group had higher plasma cholesterol levels and increased GPx activity in the follicular fluid, as well as a higher follicular growth rate. No effect of diet was observed on the proportion of small or large follicles found at the time of CCO collection. It was concluded that short term nutrition using specific nutrients promotes changes in follicular fluid composition and gene expression in oocytes, but without compromising oocyte quality and embryo production in goats. In addition, supplements promoted significant changes in follicular dynamics, inducing lower follicular depletion (Glycerin) and increased follicular growth rate (Flaxseed) without compromising the viability of the collected oocytes.
Resumo
O presente estudo foi realizado para investigar o efeito lipotóxico da dieta com níveis crescentes de lipídios na expressão de gênica em células da granulosa e oócitos caprinos. Foram utilizadas trinta cabras, agrupadas em três diferentes dietas (n = 10) recebendo durante 28 dias forragem e concentrado contendo, respectivamente, 2,7% (grupo LL), 3,9% (grupo LI) e 5,1% de lipídios (grupo LH). Três dias antes da colheita de oócitos, a onda folicular foi sincronizada utilizando 1 mL PGF2 intramuscular, seguido de utilização de um dispositivo intravaginal de progesterona. Oócitos viáveis e as células da granulosa foram submetidos à qRT-PCR para determinar a expressão dos genes PLIN2, ATF4, CHOP10, BAX, BCL2, e HSP70. Durante todo o período experimental, amostras de sangue foram coletadas para análise de colesterol, triglicérideos e lipídios totais. No grupo LH obteve-se um aumento mais acentuado do total de lípidos (+ 60,1%) (P <0,05), colesterol (+ 18,8%) e triglicérideos (+ 8,5%). Este aumento foi três vezesmaior que nos grupos LI e LL. Todos os genes foram expressos em oócitos e células da granulosa. Quanto ao efeito da dieta na expressão de PLIN2, esta foi superior no grupo LI para oócito (P <0,05) e células da granulosa. Embora nenhuma diferença (P> 0,05) tenha sido encontrada entre as dietas, o índice apoptótico (BAX \ BCL2), no tratamento LH foi maior e atingiu valores duas vezes superiores nos grupos LI (5,8 vs. 2,3) e LL (5,8 vs. 3,4) respectivamente. Concluímos que o intervalo de lipídios usados nas dietas não foi suficiente para induzir alterações significativas nos genes sinalizadores de estresse da estrutura oocitária e das respectivas células da granulosa.
The present study was conducted to investigate the lipotoxicity effect of diet with increase fat levels on gene expression in goats oocyte and granulosa cells. Thirty doeswere grouped in three diets (n=10) that for 28 days received forage and concentrate toprovide respectively 2.7% (LL group), 3.9% (LI group) and 5.1% lipids(LH group). Three days before the oocyte harvest, follicular wave was synchronized 1mL PGF2 intramuscularly followed by insertion of an intravaginal progesterone drug release. Viable oocytes and granulosa cells were submitted to qRT-PCR for determinethe expression of PLIN2, ATF4, CHOP10, BAX, BCL2, HSP70 genes. Throughout the experimental period, blood samples were taken for cholesterol, triglycerides and totallipids analysis. In LH group was recorded a more pronounced increase of total lipids (+60.1%) (P < 0.05), Cholesterol (+ 18.8%) and triglycerides (+ 8.5%). These augmentwere thrice higher that LL e LI groups. All genes were expressed in oocyte andgranulosa cells. Effect of diet was observed only in PLIN2 gene, when expression was superior in LI group for oocyte (P < 0.05) and granulosa cells. Although no difference (P > 0.05) were recorded in comparison between diets, the apoptotic index(BAX\BCL2), in LH treatment was higher and achieve values twice superior to LI (5.8 vs. 2.3) e LL (5.8 vs. 3.4) groups respectively. We conclude that the lipid interval used in the diets was not enough to induce significant changes of genes stress oocytestructure and its granulosa cells.