Resumo
O receptor do fator de crescimento epidermal (EGFR) está relacionado com a retomada da meiose induzida por estímulo gonadotrófico. Nós utilizamos um inibidor do EGFR (AG1478) para inibir a retomada da meiose durante a pré-maturação (PMIV). No experimento I, foi avaliada a maturação oocitária, a expansão das células do cumulus, a funcionalidade das junções gap, a distribuição dos microfilamentos de actina e o conteúdo lipídico em oócitos e, a expressão gênica nas células do cumulus. No experimento II, foi avaliado o desenvolvimento embrionário, a taxa de eclosão, o número total de células, a taxa de apoptose, o conteúdo lipídico e expressão gênica nos embriões. No experimento I, os COC foram PMIV por 8h em meio com 1 M de AG1478, inibidor do EGFR, (EGFR-_PreIVM), em seguida foram MIV por 22h (EGFR-_IVM); foram feitos 4 grupos controle: oócitos imaturos imediatamente após sua remoção do folículo (Control_Immat), oócitos MIV por 8h (Control_PreIVM), por 22h (Control_IVM_22h) e por 30h (Control_IVM_30h). No experimento II, os COC foram PMIV por 8h em meio com 1 M do inibidor do EGFR, em seguida foram MIV por 22h (EGFR-); os COC do grupo controle foram MIV por 22h (Control). Em seguida, os oócitos foram FIV e cultivados por até 9 dias. No experimento I, o grupo EGFR-_PreIVM apresentou 53,1% dos oócitos em GV, com a maioria em GV1 (42,9%; P>0,05) ou em GV3 [28,6%, semelhante ao grupo Control_Immat (P>0,05) e menor que o grupo Control_PreIVM (P<0,05)]; após a MIV não foram encontradas diferenças (P>0,05) entre os grupos nas taxas de MII, mas o grupo Control_IMV_30h (9,1%) teve maiores (P<0,05) taxas de oócitos degenerados. A expansão das células do cumulus foi menor (P<0,05) no grupo EGFR-_PreIVM e as junções gap se mantiveram funcionais (P<0,05). Os microfilamentos de actina não diferiram entre os grupos (P>0,05) e estavam em sua maioria na categoria normal. O conteúdo lipídico foi menor (P<0,05) no grupo EGFR-_PreIVM comparado com Control_Immat, mas após a MIV foi maior (P<0,05) no grupo EGFR-_IVM do que no Control_IVM. Diferenças na expressão dos genes de maturação oocitária, expansão das células do cumulus, metabolismo, metabolismo lipídico, qualidade e desenvolvimento embrionário, regulação epigenética, estresse do retículo endoplasmático, defesa antioxidante e apoptose foram observadas após a PMIV e; nos genes de expansão das células do cumulus, metabolismo e qualidade embrionária após a MIV. No experimento II, as taxas de blastocistos, de eclosão, o número total de células e o conteúdo lipídico não diferiram (P>0,05) nos embriões avaliados. A apoptose foi menor (P<0,05) no grupo EGFR-. Os genes NANOG, RPLP0, H2AFZ, HMGCS1, ACSL1, GPAT3, FADS2, FASN, FDX1, BID, GPX4 e HIF1A foram mais expressos (P<0,05) no grupo EGFR-. Em conclusão o tratamento com inibidor do EGFR proporcionou bloqueio parcial da meiose com manutenção das junções gap funcionais, que foi relacionado com maior potencial de desenvolvimento dos oócitos, devido à redução da apoptose nos embriões e ao aumento na expressão de genes relacionados com desenvolvimento, sugerindo melhor qualidade embrionária.
Epidermal growth factor receptor (EGFR) is related with meiosis resumption by gonadotropic stimulus. We used an EGFR inhibitor (AG1478) to block meiosis resumption during prematuration (PIVM). In experiment I, was evaluated oocyte maturation, cumulus cells expansion, gap junctions functionality, microfilaments distribution and lipid content in oocytes and, gene expression in cumulus cells. In experiment II, was assessed embryo development, hatching rates, total cell number, apoptosis, lipid content and gene expression in embryos. For experiment I, COC were PIVM for 8h in medium supplemented with 1M of AG1478, an EGFR inhibitor, (EGFR-_PreIVM), followed by 22h IVM (EGFR-_IVM); four control groups were evaluated: immature oocytes immediately after follicle removal (Control_Immat), oocytes IVM for 8h (Control_PreIVM), oocytes IVM for 22h (Control_IVM_22h) and oocytes IVM for 30h (Control_IVM_30h). For experiment II, COC were PIVM for 8h in medium supplemented with 1M of EGFR inhibitor, followed by 22h IVM (EGFR-); COC from control group were matured for 22h (Control). After that, oocytes were IVF and zygotes were cultured up to 9 days. In experiment I, EGFR-_PreIVM group had 53.1% of the oocytes blocked in GV, the majority in GV1 (42.9%; P>0.05) or in GV3 [28.6%, similar to Control_Immat (P>0.05) and lower than Control_PreIVM (P<0.05)]. After IVM, no differences (P>0.05) were found between groups in MII rates, but Control_IMV_30h (9.1%) had higher (P<0.05) rates of degenerated oocytes. Cumulus cells expansion was lower (P<0.05) in EGFR-_PreIVM and gap junctions maintained the functionality (P<0.05). Actin microfilaments were mostly distributed in normal category after PIVM and after IVM, and no differences were found (P>0.05). Lipid content was lower (P<0.05) in EGFR-_PreIVM in comparison to Control_Immat, but after IVM was higher (P<0,05) in EGFR-_IVM than Control_IVM. After PIVM differences (P>0,05) were found in genes for oocyte maturation, cumulus cells expansion, metabolism, lipid metabolism, embryo quality, embryo development, epigenetic regulation, endoplasmic reticulum stress, antioxidant defense and apoptosis; after IVM, the differences (P<0,05) were in genes for cumulus cells expansion, metabolism and embryo quality. In experiment II, blastocyst, hatching rates, lipid content and cell number did not differ between treatments (P>0.05). Apoptosis was lower (P<0.05) in EGFR-. The genes NANOG, RPLP0, H2AFZ, HMGCS1, ACSL1, GPAT3, FADS2, FASN, FDX1, BID, GPX4 and HIF1A were upregulated (P<0.05) in EGFR-. In conclusion, treatment with EGFR inhibitor lead to partial meiotic block with functional gap junctions, related to higher oocyte developmental potential, due to the lower apoptotic index and the increased expression of genes related do development, suggesting better embryo quality.
Resumo
O objetivo desse estudo foi avaliar os efeitos da inibição da meiose com inibidores farmacológicos ou biológicos durante o transporte de oócitos bovinos por 6 horas sobre: 1) progressão da maturação nuclear; 2) maturação citoplasmática e 3) competência no desenvolvimento e qualidade dos embriões produzidos. Para tanto, o meio de transporte de oócitos foi suplementado com butirolactona-I (BL), milrinona (MR), IBMX e forskolina (CL) ou fluido folicular puro (FF) e o meio de maturação somente do grupo transportado com IBMX e forskolina foi suplementado com cilostamida. Os oócitos foram incubados em incubadora portátil (Minitub®) para simulação de transporte, durante 6h. Posteriormente, foram submetidos à maturação in vitro (MIV) até completar 24h e, em seguida, foram fecundados e os prováveis zigotos foram cultivados in vitro durante 7 dias. Foram feitos dois grupos controle no experimento I: MIV em 5% de CO2 em ar por 24h (C1); MIV por 6h na transportadora e mais 18h em 5% de CO2 em ar (C2). No experimento II foram feitos três grupos controle: MIV com 10% de SFB (Contr SFB); MIV com 0,6% de BSA (Contr BSA); MIV por 6h na transportadora e mais 18h em 5% de CO2 em ar (Contr Transp) No primeiro experimento foi avaliada a cinética da maturação nuclear após o transporte e durante a MIV, quando também foi avaliada a expansão das células do cumulus. As avaliações da maturação citoplasmática após o transporte e ao final da MIV foram feitas pelos seguintes parâmetros: avaliação do posicionamento de mitocôndrias, do potencial de membrana mitocondrial, do posicionamento dos microfilamentos de actina, da taxa de apoptose e do conteúdo intracelular de espécies reativas do oxigênio. No experimento 2, foi feita a avaliação da taxa de clivagem (72 hpi) e do desenvolvimento embrionário até a fase de blastocistos (168 hpi), sendo que a qualidade dos embriões foi avaliada pela contagem do número total de células e taxa de apoptose, assim como pela determinação da atividade das caspases. No experimento 1, a taxa de oócitos em metáfase II após 24h de MIV não foi afetada (P>0,05) pelos tratamentos (61,2%-74,7%). A expansão das células do cumulus foi maior (P<0,05) no grupo FF após as 6h e não diferiu entre os grupos ao final da MIV (4,8%-5,0%). A distribuição dos microfilamentos de actina na categoria difusa (37,4%) foi maior (P<0,05) após 6h de MIV no grupo MR quando comparado aos oócitos imaturos (6,4%) e ao grupo FF (8,1%), porém foi predominante na categoria normal e não diferiu (P>0,05) entre os grupos ao final da MIV (65,5%-84,2%). A distribuição citoplasmática de mitocôndrias foi predominantemente periférica (47,8%-73,3%) em oócitos imaturos e dispersa (77,7%-89,0%) após a MIV. O potencial de membrana mitocondrial foi semelhante (P>0,05) entre os grupos (148,3-168,1) após 6h e 24h de MIV os oócitos dos grupos C1 (231,9) e C2 (219,8) apresentaram maior (P<0,05) potencial de membrana mitocondrial quando comparados aos grupos MR (155,2) e FF (161,9), porém não diferiram de BL (189,5). A quantidade intracelular de ROS após 6h foi menor (P<0,05) no grupo BL (141,9) comparado com MR (160,8) e ambos foram semelhantes (P>0,05) aos demais tratamentos (145,8-153,7). A taxa de apoptose em oócitos imaturos (1,5%) e após o transporte (6h) no grupo C1 (1,3%) foi menor (P<0,05) quando comparados com MR (13,8%) e C2 (12,0%) e não diferiram (P>0,05) de BL (7,5%), CL (7,8%) e FF (7,1%), não houve diferença (P>0,05) na taxa de apoptose em oócitos maturos (2,3%-8,8%). No experimento 2, a taxa de clivagem foi maior (P<0,05) para o grupo Contr SFB (84,5%) quando comparada aos demais (59,6%-70,9%). O desenvolvimento embrionário do grupo Contr SFB (39,8%) foi maior (P<0,05) quando comparado a Contr Transp (22,6%) e MR (21,6%) e todos estes foram semelhantes (P>0,05) aos demais (23,6%-28,7%). O número total de células em embriões do grupo Contr SFB (85,2) foi maior (P<0,05) do que os dos grupos Contr BSA (53,6), Contr Transp (55,5), BL (58,3), CL (57,9) e MR (59,1), e todos foram semelhantes (P>0,05) ao grupo FF (67,7). A taxa de apoptose avaliada pelo ensaio TUNEL não diferiu (P>0,05) entre os tratamentos (12,3%-15,7%), assim como a atividade das caspases que não apresentou diferença (P>0,05) entre os grupos experimentais (139,0-152,4). A adição de inibidores da meiose (butirolactona-I, IBMX associado à forskolina e fluido folicular), com exceção da milrinona, ao meio de transporte de oócitos bovinos permite um transporte adequado por 6h, preservando a qualidade e integridade dos oócitos, permitindo uma produção embrionária semelhante à obtida in vitro a partir de oócitos que não foram submetidos ao transporte.
The aim of this trial was to evaluate the effects of meiotic inhibiton with biological and pharmacological inhibitors during transportation of bovine oocytes for 6 hours in: 1) nuclear maturation progress; 2) cytoplasmic maturation and 3) embryo development and quality. Thus, the transportation media were supplemented with butyrolactone-I, milrinone, IBMX and forskolin or follicular fluid. Oocytes were transported during 6 hours and then submitted to in vitro maturation (IVM) until completing 24 hours, then they were fertilized and the presumptive zygotes cultured during 7 days. There were made two control groups in the first experiment: 24h IVM in 5% CO2 in air (C1); 6h IVM in transport and 18h more in 5% CO2 in air (C2). In the second experiment there were made three control groups: IVM with 10% FCS (Contr FCS); IVM with 0,6% BSA (Contr BSA); 6h IVM in transport and 18h more in 5% CO2 in air (Contr Transp). Experiment 1 evaluated nuclear maturation kinetics and cumulus cell expansion. Cytoplasmic maturation was also evaluated after transport and after IVM through the evaluation of mitochondria position and membrane potential, actin microfilaments distribution. Apoptotic rates and intracellular measurement of reactive oxygen species were evaluated as well. Experiment 2 evaluated cleavage (72 hpi) and blastocyst (168 hpi) rates and embryo quality by total cell number, apoptosis and caspase activity. In experiment 1 no differences (P>0.05) were observed between treatments in metaphase II rates after 24h IVM (61.2%-74.7%). Cumulus cells expansion was higher (P<0.05) in FF group after 6h and there were no differences (P>0.05) between treatments after IVM (4.8-5.0). Actin microfilaments distribution was higher (P<0.05) in MR group for diffuse category (37.4%) after 6h IVM when compared to immature (6.4%) and FF groups (8.1%), but it was predominantly in normal category and did not differ (P>0,05) between groups after IVM (65.5%-84.2%). Mitochondrial cytoplasmic distribution was mosty peripheral (47.8%-73.3%) in immature oocytes and disperse (77.7%-89.0%) after IVM. There were no differences (P>0.05) in mitochondrial membrane potential after 6h (148.3-168.1) and after IVM it was higher (P<0.05) in C1 (231.9) and C2 (219.8) when compared to MR (155.2) and FF (161.9), but did not differ (P>0.05) from BL (189.5). Intracellular amounts of ROS after 6h was lower (P<0.05) in BL (141.9) than in MR (160.8) and both were similar (P>0.05) to the others. Apoptosis rate in immature oocytes (1.5%) and after 6h in C1 (1.3%) was lower (P<0.05) than MR (13.8%) and C2 (12.0%) and did not differ (P>0.05) from BL (7.5%), CL (7.8%) and FF (7.1%). In mature oocytes, there were no differences (P>0.05) in apoptosis rates. In experiment 2, cleavage rates was higher (P>0.05) for Contr FCS group (84.5%) when compared to the others (59.6%-70.9%). Embryo development was higher (P<0.05) in Contr FCS (39.8%) in comparison to Contr Transp (22.6%) and MR (21.6%), and those were similar (P>0.05) to the others (23.6%-28.7%). Total cell number in embryos from the group Contr SFB (85.2%) was higher (P<0.05) than Contr BSA (53.6%), Contr Transp (55.5%), BL (58.3%), CL (57.9%) and MR (59.1%), and they did not differ from FF (67.7%). TUNEL evaluation of apoptosis did not differ (P>0.05) between treatments (12.3%-15.7%), and the caspases activity (139.0-152.4) did not differ (P>0.05). The addition of meiotic inhibitors (butyrolactone-I, IBMX associated to forskolin and follicular fluid), with exception of milrinone, for the transport medium of bovine oocytes allows an adequate transport for 6h, preserving the quality and integrity of oocytes, promoting an embryo production similar to that obtained in vitro by oocytes that were not submitted to transport.