Melatonin in maturation media fails to improve oocyte maturation, embryo development rates and DNA damage of bovine embryos

Melatonin (MEL) acts as a powerful scavenger of free radicals and direct gonadal responses to melatonin have been reported in the literature. Few studies, however, have evaluated the effect of MEL during in vitro maturation (IVM) on bovine embryos. This study tested the addition of MEL to maturation medium (MM) with no gonadotropins on nuclear maturation and embryo development rates and the incidence of DNA damage in resulting embryos. Cumulus-oocyte complexes were aspirated from abattoir ovaries and cultured in MM (TCM-199 medium supplemented with 10% fetal calf serum - FCS) at 39ºC and 5% CO2 in air. After 24 hours of culture in MM with 0.5 µg mL-1 FSH and 5.0 µg mL-1 LH; 10-9 M MEL) or 10-9 M MEL, 0.5 µg mL-1 FSH and 5.0 µg mL-1 LH, the oocytes were stained with Hoechst 33342 to evaluate nuclear maturation rate. After in vitro fertilization and embryo culture, development rates were evaluated and the blastocysts were assessed for DNA damage by Comet assay. There was no effect of melatonin added to the MM, alone or in combination with gonadotropins, on nuclear maturation, cleavage and blastocyst rates. These rates ranged between 88% to 90%, 85% to 88% and 42% to 46%, respectively. The extent of DNA damage in embryos was also not affected by MEL supplementation during IVM. The addition of 10-9 M MEL to the MM failed to improve nuclear maturation and embryo development rates and the incidence of DNA damage in resulting embryos, but was able to properly substitute for gonadotropins during IVM.

Melatonin (MEL) atua como um potente redutor de radicais livres. Efeito direto da MEL na função gonadal também foi observado. Existem poucos estudos relacionados ao efeito da MEL durante a maturação no desenvolvimento embrionário in vitro. Avaliou-se a adição de MEL no meio de maturação (sem gonadotrofinas) nas taxas de maturação nuclear e de desenvolvimento embrionário e na incidência de fragmentação do DNA nos embriões produzidos in vitro. Complexos cumulus-ovócitos foram aspirados de ovários provenientes de matadouros e cultivados em meio de maturação (Meio TCM-199 suplementado com 10% de soro fetal bovino) a 39ºC e 5% CO2 em ar. Após 24 horas de cultivo em meio de maturação com 0,5 µg mL-1 de FSH e 5,0 µg mL-1 de LH; 10-9 M de MEL ou 10-9 M de MEL, 0,5 µg mL-1 de FSH e 5,0 µg mL-1 de LH, os ovócitos foram corados com Hoechst 33342 para avaliação da taxa de maturação nuclear. A fragmentação do DNA dos blastocistos foi avaliada pela técnica do Cometa. Não houve efeito da MEL adicionada ao meio de maturação, com ou sem gonadotrofinas, nas taxas de maturação nuclear, clivagem e blastocistos. Os percentuais variaram entre 88% a 90%, 85% a 88% e 42% a 46%, respectivamente. O grau de fragmentação do DNA também não foi afetado pela adição de MEL ao meio de maturação. A adição de 10-9 M de MEL ao meio de maturação não exerce influência nas taxas de maturação nuclear e de desenvolvimento embrionário e nem da incidência de fragmentação do DNA dos embriões produzidos in vitro, mas pode substituir as gonadotropinas durante a maturação in vitro.

Melatonin in maturation media fails to improve oocyte maturation, embryo development rates and DNA damage of bovine embryos

Melatonin (MEL) acts as a powerful scavenger of free radicals and direct gonadal responses to melatonin have been reported in the literature. Few studies, however, have evaluated the effect of MEL during in vitro maturation (IVM) on bovine embryos. This study tested the addition of MEL to maturation medium (MM) with no gonadotropins on nuclear maturation and embryo development rates and the incidence of DNA damage in resulting embryos. Cumulus-oocyte complexes were aspirated from abattoir ovaries and cultured in MM (TCM-199 medium supplemented with 10% fetal calf serum - FCS) at 39ºC and 5% CO2 in air. After 24 hours of culture in MM with 0.5 µg mL-1 FSH and 5.0 µg mL-1 LH; 10-9 M MEL) or 10-9 M MEL, 0.5 µg mL-1 FSH and 5.0 µg mL-1 LH, the oocytes were stained with Hoechst 33342 to evaluate nuclear maturation rate. After in vitro fertilization and embryo culture, development rates were evaluated and the blastocysts were assessed for DNA damage by Comet assay. There was no effect of melatonin added to the MM, alone or in combination with gonadotropins, on nuclear maturation, cleavage and blastocyst rates. These rates ranged between 88% to 90%, 85% to 88% and 42% to 46%, respectively. The extent of DNA damage in embryos was also not affected by MEL supplementation during IVM. The addition of 10-9 M MEL to the MM failed to improve nuclear maturation and embryo development rates and the incidence of DNA damage in resulting embryos, but was able to properly substitute for gonadotropins during IVM.

Melatonin (MEL) atua como um potente redutor de radicais livres. Efeito direto da MEL na função gonadal também foi observado. Existem poucos estudos relacionados ao efeito da MEL durante a maturação no desenvolvimento embrionário in vitro. Avaliou-se a adição de MEL no meio de maturação (sem gonadotrofinas) nas taxas de maturação nuclear e de desenvolvimento embrionário e na incidência de fragmentação do DNA nos embriões produzidos in vitro. Complexos cumulus-ovócitos foram aspirados de ovários provenientes de matadouros e cultivados em meio de maturação (Meio TCM-199 suplementado com 10% de soro fetal bovino) a 39ºC e 5% CO2 em ar. Após 24 horas de cultivo em meio de maturação com 0,5 µg mL-1 de FSH e 5,0 µg mL-1 de LH; 10-9 M de MEL ou 10-9 M de MEL, 0,5 µg mL-1 de FSH e 5,0 µg mL-1 de LH, os ovócitos foram corados com Hoechst 33342 para avaliação da taxa de maturação nuclear. A fragmentação do DNA dos blastocistos foi avaliada pela técnica do Cometa. Não houve efeito da MEL adicionada ao meio de maturação, com ou sem gonadotrofinas, nas taxas de maturação nuclear, clivagem e blastocistos. Os percentuais variaram entre 88% a 90%, 85% a 88% e 42% a 46%, respectivamente. O grau de fragmentação do DNA também não foi afetado pela adição de MEL ao meio de maturação. A adição de 10-9 M de MEL ao meio de maturação não exerce influência nas taxas de maturação nuclear e de desenvolvimento embrionário e nem da incidência de fragmentação do DNA dos embriões produzidos in vitro, mas pode substituir as gonadotropinas durante a maturação in vitro.

Estrus and ovulation synchronization using short-term protocols during the previous reproductive season in Suffolk ewes - DOI: 10.4025/actascianimsci.v31i4.6938 / Sincronização do estro e da ovulação utilizando protocolos de curta duração durante a pré-estação reprodutiva em ovelhas Suffolk - DOI: 10.4025/actascianimsci.v31i4.6938

This study was carried out with the objective of examining the effect of the short-term estrus synchronization protocol. Ewes were divided in four groups: Control Group (MAP sponges for 12 days, and eCG at withdrawal); Groups I, II and III used the sponge for four days, and 100 µg of PGF was applied at withdrawal; and additionally, Group I (0.1 mg of Estradiol benzoate - EB, in the sponge placement, and in the withdrawn 400 UI of eCG and 50 µg of GnRH 48h later); Group II (35 mg of injectable progesterone and 0.1 mg of EB in the sponge placement, and 400 UI of eCG at withdrawal, and 50 µg of GnRH 48h after); Group III (35 mg of injectable progesterone and 0.2 mg of EB in the sponge placement, and 400 UI of eCG at withdrawal, and 50 µg of GnRH 56h after). Exams were accomplished for ultrasound and determine the plasmatic concentrations of progesterone and observations of the beginning the estrus and the ovulation. The lack of eCG in Group I caused this protocol to be less efficacious in induction and synchronization of estrus and ovulation. The Control Group had a greater synchronization of estrus and ovulation.

Este trabalho foi realizado com o objetivo de estudar a eficácia do protocolo de curta duração de sincronização do estro. As ovelhas foram divididas em quatro grupos: Grupo Controle (esponjas de MAP por 12 dias, e eCG na retirada); Os Grupos I, II e III permaneceram com a esponja por quatro dias e na retirada foi aplicado 100 µg de PGF e adicionalmente: no Grupo I (0,1 mg de Benzoato de estradiol - BE na colocação da esponja e 48h após a retirada 50 µg de GnRH); Grupo II (35 mg de progesterona injetável e 0,1 mg de BE na colocação da esponja e na retirada 400 UI de eCG e 50 µg de GnRH 48h após); Grupo III (35 mg de progesterona injetável e 0,2 mg de BE na colocação da esponja e na retirada 400 UI de eCG e 50 µg de GnRH 56h após). Foram feitos exames de ultrassom, dosagens de progesterona, e observações do início do estro e da ovulação. A falta do eCG no Grupo I fez com que esse protocolo fosse menos eficaz na indução e sincronização do estro e ovulação. O Grupo Controle teve maior sincronia do estro e da ovulação.

Sincronização do estro e da ovulação utilizando protocolos de curta duração durante a pré-estação reprodutiva em ovelhas Suffolk / Estrus and ovulation synchronization using short-term protocolsduring the previous reproductive season in Suffolk ewes

Este trabalho foi realizado com o objetivo de estudar a eficácia do protocolo de curta duração de sincronização do estro. As ovelhas foram divididas em quatro grupos: Grupo Controle (esponjas de MAP por 12 dias, e eCG na retirada); Os Grupos I, II e III permaneceram com a esponja por quatro dias e na retirada foi aplicado 100 µg de PGF e adicionalmente: no Grupo I (0,1 mg de Benzoato de estradiol - BE na colocação da esponja e 48h após a retirada 50 µg de GnRH); Grupo II (35 mg de progesterona injetável e 0,1 mg de BE na colocação da esponja e na retirada 400 UI de eCG e 50 µg de GnRH 48h após); Grupo III (35 mg de progesterona injetável e 0,2 mg de BE na colocação da esponja e na retirada 400 UI de eCG e 50 µg de GnRH 56h após). Foram feitos exames de ultrassom, dosagens de progesterona, e observações do início do estro e da ovulação. A falta do eCG no Grupo I fez com que esse protocolo fosse menos eficaz na indução e sincronização do estro e ovulação. O Grupo Controle teve maior sincronia do estro e da ovulação.

This study was carried out with the objective of examining the effect of the short-term estrus synchronization protocol. Ewes were divided in four groups: Control Group (MAP sponges for 12 days, and eCG at withdrawal); Groups I, II and III used the sponge for four days, and 100 µg of PGF was applied at withdrawal; and additionally, Group I (0.1 mg of Estradiol benzoate - EB, in the sponge placement, and in the withdrawn 400 UI of eCG and 50 µg of GnRH 48h later); Group II (35 mg of injectable progesterone and 0.1 mg of EB in the sponge placement, and 400 UI of eCG at withdrawal, and 50 µg of GnRH 48h after); Group III (35 mg of injectable progesterone and 0.2 mg of EB in the sponge placement, and 400 UI of eCG at withdrawal, and 50 µg of GnRH 56h after). Exams were accomplished for ultrasound and determine the plasmatic concentrations of progesterone and observations of the beginning the estrus and the ovulation. The lack of eCG in Group I caused this protocol to be less efficacious in induction and synchronization of estrus and ovulation. The Control Group had a greater synchronization of estrus and ovulation.

Sincronização do estro e da ovulação utilizando protocolos de curta duração durante a pré-estação reprodutiva em ovelhas Suffolk / Estrus and ovulation synchronization using short-term protocolsduring the previous reproductive season in Suffolk ewes

Este trabalho foi realizado com o objetivo de estudar a eficácia do protocolo de curta duração de sincronização do estro. As ovelhas foram divididas em quatro grupos: Grupo Controle (esponjas de MAP por 12 dias, e eCG na retirada); Os Grupos I, II e III permaneceram com a esponja por quatro dias e na retirada foi aplicado 100 µg de PGF e adicionalmente: no Grupo I (0,1 mg de Benzoato de estradiol - BE na colocação da esponja e 48h após a retirada 50 µg de GnRH); Grupo II (35 mg de progesterona injetável e 0,1 mg de BE na colocação da esponja e na retirada 400 UI de eCG e 50 µg de GnRH 48h após); Grupo III (35 mg de progesterona injetável e 0,2 mg de BE na colocação da esponja e na retirada 400 UI de eCG e 50 µg de GnRH 56h após). Foram feitos exames de ultrassom, dosagens de progesterona, e observações do início do estro e da ovulação. A falta do eCG no Grupo I fez com que esse protocolo fosse menos eficaz na indução e sincronização do estro e ovulação. O Grupo Controle teve maior sincronia do estro e da ovulação.(AU)

This study was carried out with the objective of examining the effect of the short-term estrus synchronization protocol. Ewes were divided in four groups: Control Group (MAP sponges for 12 days, and eCG at withdrawal); Groups I, II and III used the sponge for four days, and 100 µg of PGF was applied at withdrawal; and additionally, Group I (0.1 mg of Estradiol benzoate - EB, in the sponge placement, and in the withdrawn 400 UI of eCG and 50 µg of GnRH 48h later); Group II (35 mg of injectable progesterone and 0.1 mg of EB in the sponge placement, and 400 UI of eCG at withdrawal, and 50 µg of GnRH 48h after); Group III (35 mg of injectable progesterone and 0.2 mg of EB in the sponge placement, and 400 UI of eCG at withdrawal, and 50 µg of GnRH 56h after). Exams were accomplished for ultrasound and determine the plasmatic concentrations of progesterone and observations of the beginning the estrus and the ovulation. The lack of eCG in Group I caused this protocol to be less efficacious in induction and synchronization of estrus and ovulation. The Control Group had a greater synchronization of estrus and ovulation.(AU)

Efeito da melatonina sobre a maturação dos ovócitos em sistema tradicional de produção in vitro de embriões bovinos / Effect of melatonin on oocyte maturation in traditional system of bovine embryo in vitro production

Este trabalho teve objetivou-se avaliar o efeito da melatonina adicionada ao meio de maturação (meio B199) sobre a maturação nuclear, a distribuição dos grânulos corticais e dos microtúbulos, a produção in vitro de embriões e sobre a apoptose das células do cumulus (CC) e dos embriões. Os complexos cumulus-ovócitos (COCs), aspirados de folículos ovarianos obtidos de ovários de vacas oriundas de abatedouros, foram cultivados por 24 h, conforme os tratamentos: 1) Grupo Controle: meio B199 acrescidos de 0,5 µg/mL de FSH e 5,0 µg/mL de LH; 2) Grupo MEL: meio B199 com 1 µg/mL de melatonina; 3) Grupo MEL/FSH/LH: meio B199 com 1 µg/mL de melatonina e 0,5 µg/mL de FSH e 5,0 µg/mL de LH. Após a maturação in vitro (MIV), os COCs de todos os grupos foram submetidos à fecundação in vitro (FIV) e desenvolvimento embrionário in vitro. A condição de cultivo em todas as etapas foi microgotas, sob óleo de silicone, com atmosfera de 5% de CO2 em ar, a 38,5ºC. Foram avaliadas as taxas de clivagem e de embriões produzidos no dia 7 (D-7) pós-inseminação in vitro. Após a MIV, os ovócitos de todos os grupos também foram corados com Hoechst 33342, com anticorpo monoclonal anti-tubulina conjugada com FITC ou cultivados com aglutinina Lens Culinaris conjugada a FITC para avaliação da taxa de maturação nuclear (progressão da meiose), distribuição dos microtúbulos e dos grânulos corticais, respectivamente. Para avaliação do grau de apoptose das CC e dos embriões, utilizou-se a técnica do cometa. Não houve diferença (P > 0,05) entre o grupo controle e os tratados com melatonina (MEL e MEL/FSH/LH) na taxa de ovócitos em metáfase II (66,18±4,04; 66,46±4,04 e 59,61±4,04), no percentual de blastocistos com baixo grau de apoptose (31,46±6,01; 38,36±6,01 e 32,92±6,01), na taxa de clivagem (85,70±2,47; 88,52±2,47 e 85,65±2,47) e nem na taxa de embriões no D-7 (54,47±3,67; 60,01±3,67 e 58,40±3,67). A distribuição dos microtúbulos e dos grânulos corticais também não foi alterada pelos grupos tratados com melatonina. O percentual de CC que não apresentaram dano no DNA no grupo MEL (37,64±2,41) foi superior (P<0,01) ao grupo MEL/FSH/LH (28,08±2,41) e ao grupo controle (17,83±2,41). Os resultados sugerem que a adição de melatonina durante o cultivo in vitro para maturação de ovócitos bovinos protegeu as CCs de danos no DNA promovendo a diminuição da incidência de apoptose e foi capaz de suportar o desenvolvimento embrionário produzindo taxas de embriões no D-7 similares as obtidas no sistema tradicional de produção in vitro de embriões

The aim of this study was to examine the effect of addition of melatonin in maturation medium (B199) on the nuclear maturation, the cortical granules and microtubules distribution, the in vitro production of embryos and the DNA damage (apoptosis) of cumulus cells and embryos. The bovine cumulus-oocyte complexes (COCs) aspirated from follicles from abattoir ovaries were cultured for 24 h according to treatments: 1) Control group: B199 medium with 0.5 µg/ml FSH and 5.0 µg/ml LH; 2) MEL group: B199 medium with 1 µg/ml melatonin; 3) MEL/FSH/LH group: B199 medium with 1 µg/ml melatonin, 0.5 µg/ml FSH and 5.0 µg/ml LH. After in vitro maturation (IVM) the COCs of all groups were submitted to in vitro fertilization and in vitro embryo development. All cultures were in droplets under oil, at 38.5ºC in na atmosphere of 5% CO2 in air. The cleavage rate and the percentage of embryos produced on Day 7 (D-7) after in vitro insemination were evaluated. After IVM, the oocytes of all groups were stained with Hoechst 33342, or stained with FITCconjugated anti-?-tubulin antibody or cultured with FITC-conjugated Lens Culinaris agglutinin to evaluate the nuclear maturation rate, microtubules and cortical granules distribution, respectively. The incidence of apoptosis of the CC and embryos was also measured by Comet assay. There was no difference (P > 0.05) among groups on metaphase II oocyte rates (Control = 68.18±4.04; MEL = 66.46±4.04; MEL/FSH/LH = 59.61±4.04), on the percentage of blastocysts with low incidence of apoptosis (Control = 31,46±6,01; MEL = 38,36±6,01; MEL/FSH/LH = 2,92±6,01), on cleavage rate (Control = 85.70±2.47; MEL = 88.52±2.47; MEL/FSH/LH = 85.65±2.47) and on D-7 embryo rate (Control = 54.47± 3.67; MEL = 60.01±3.67; MEL/FSH/LH = 58.40±3.67). The distribution of microtubules and cortical granules was not affected by the groups treated with melatonin. The percentage of cumulus cells with no DNA damage in MEL group (37.64±2.41) was significantly superior to MEL/FSH/LH (28.08±2.41) and control groups (17.83±2.41). The results suggest that the addition of melatonin to the IVM medium protected the cumulus cells from DNA damage by diminishing the incidence of apoptosis and also supported the embryo development by producing D-7 embryo rates similar to those obtained in traditional system of bovine embryo in vitro production

Estrus and ovulation synchronization using short-term protocols during the previous reproductive season in Suffolk ewes - DOI: 10.4025/actascianimsci.v31i4.6938 / Sincronização do estro e da ovulação utilizando protocolos de curta duração durante a pré-estação reprodutiva em ovelhas Suffolk - DOI: 10.4025/actascianimsci.v31i4.6938

This study was carried out with the objective of examining the effect of the short-term estrus synchronization protocol. Ewes were divided in four groups: Control Group (MAP sponges for 12 days, and eCG at withdrawal); Groups I, II and III used the sponge for four days, and 100 µg of PGF was applied at withdrawal; and additionally, Group I (0.1 mg of Estradiol benzoate - EB, in the sponge placement, and in the withdrawn 400 UI of eCG and 50 µg of GnRH 48h later); Group II (35 mg of injectable progesterone and 0.1 mg of EB in the sponge placement, and 400 UI of eCG at withdrawal, and 50 µg of GnRH 48h after); Group III (35 mg of injectable progesterone and 0.2 mg of EB in the sponge placement, and 400 UI of eCG at withdrawal, and 50 µg of GnRH 56h after). Exams were accomplished for ultrasound and determine the plasmatic concentrations of progesterone and observations of the beginning the estrus and the ovulation. The lack of eCG in Group I caused this protocol to be less efficacious in induction and synchronization of estrus and ovulation. The Control Group had a greater synchronization of estrus and ovulation.

Este trabalho foi realizado com o objetivo de estudar a eficácia do protocolo de curta duração de sincronização do estro. As ovelhas foram divididas em quatro grupos: Grupo Controle (esponjas de MAP por 12 dias, e eCG na retirada); Os Grupos I, II e III permaneceram com a esponja por quatro dias e na retirada foi aplicado 100 µg de PGF e adicionalmente: no Grupo I (0,1 mg de Benzoato de estradiol - BE na colocação da esponja e 48h após a retirada 50 µg de GnRH); Grupo II (35 mg de progesterona injetável e 0,1 mg de BE na colocação da esponja e na retirada 400 UI de eCG e 50 µg de GnRH 48h após); Grupo III (35 mg de progesterona injetável e 0,2 mg de BE na colocação da esponja e na retirada 400 UI de eCG e 50 µg de GnRH 56h após). Foram feitos exames de ultrassom, dosagens de progesterona, e observações do início do estro e da ovulação. A falta do eCG no Grupo I fez com que esse protocolo fosse menos eficaz na indução e sincronização do estro e ovulação. O Grupo Controle teve maior sincronia do estro e da ovulação.

Avaliação da resposta ovariana na sincronização do estro e da ovulação utilizando protocolo de curta duração em ovelhas da raça Suffolk

O experimento foi realizado em condições controladas, na pré-estação reprodutiva em fêmeas ovinas Suffolk visando estudar a eficácia do protocolo de curta duração na sincronização do estro, utilizando estrógeno para sincronização da emergência da onda folicular e consequentemente a ovulação. Os efeitos dos hormônios exógenos nos padrões de crescimento folicular ovariano através de exames ultra-sonográficos, quantificação de progesterona e observações do início do estro e ovulação. As ovelhas com estro induzido foram divididas em cinco grupos sendo o Grupo controle (MAP por 12 dias, e eCG na retirada da esponja). No Grupo experimental I foi utilizado o protocolo 0,1 mg de BE, esponjas com 60 mg de MAP por 4 dias e na retirada da esponja foi feita aplicação de PGF2a e 48 h após GnRH. No Grupo experimental II foi utilizado o protocolo de 35 mg de progesterona IM, 0,1 mg de BE, esponjas de MAP por 4 dias, e na retirada da esponja foi feita aplicação de PGF2a, eCG e 48 h após GnRH. No Grupo experimental III foi utilizado o protocolo de 35 mg de progesterona IM, 0,2 mg de BE, esponjas de MAP por 4 dias, na retirada da esponja foi feita aplicação de PGF2a, eCG e 56 h após GnRH. E no Grupo experimental IV foi utilizado o protocolo de 35 mg de progesterona injetável e 0,3 mg de BE, esponjas de MAP por 5 dias, e na retirada da esponja foi feita aplicação de PGF2a. Os ovários foram monitorados diariamente usando ultra-som a partir de dois dias antes de iniciar o protocolo até o décimo dia após a ovulação. Foram realizadas 4 colheitas de sangue por venopunção jugular, 10 dias antes da indução, no dia da inserção da esponja no 5° e no 10° dia após a ovulação, para se determinar as concentrações...

The experiment was conducted under controlled conditions, in the early reproductive season among Suffolk ewes aiming at to study the effectiveness of the protocol of short-term in synchronization of the estrous using estrogen for synchronization of the emergency of the wave folicular and consequently the ovulation. The effects of exogenous hormones in the folicular ovarian growth standards, through ultrasonographic exams, progesterone quantification and observations of the beginning the estro and ovulation. The females with induced estrus were divided in five groups being the control group MAP for 12 days, and eCG by removal of the sponge. In experimental Group I, the protocol of 0.1 mg of BE and 60 mg MAP sponges for 4 days was used and, by removal of the sponge, PGF2a was applied and 48h after GnRH. In experimental Group II, the protocol of 35 mg IM progesterone, 0.1 mg of BE, MAP sponges for 4 days was used, and by removal of the sponge PGF2a and eCG were applied, and 48 h after GnRH. In experimental Group III, the protocol of 35 mg IM progesterone, 0.2 mg of BE, MAP sponges for 4 days was used, and by removal of the sponge PGF2a and eCG were applied, and 56h after GnRH and in the experimental Group IV, the protocol of 35 mg of injectable progesterone and 0.3 mg of BE, MAP sponges for 5 days was used and, upon removal of the sponge, PGF2a was applied. Ovaries were monitored daily by using ultrasound starting 2 days before initiating the protocol up to the tenth day of ovulation. 4 Blood samples were collected through jugular vein puncture, 10 days before induction, on sponge insertion day on the 5th and 10th day after ovulation in order to determine the plasmatic concentrations of progesterone. Ultrasonography...