Platelet rich plasma associated with heterologous fresh and thawed chondrocytes on osteochondral lesions of rabbits / Associação de plasma rico em plaquetas e condrócitos heterólogos frescos e descongelados em lesão osteocondral de coelhos

Chondrocytes obtained from stifle joint of New Zealand White rabbits were cultivated. Half of cells were maintained in culture for later implantation and the others frozen during six months to evaluate viability. A circular osteochondral defect was created in the right stifle of other twenty seven rabbits. The control group (CG) received no treatment. The thawed (TH) and fresh (FH) heterologous groups received, respectively, an implant of cultivated thawed or fresh heterologous chondrocytes associated with platelet rich plasma (PRP). The CG group showed greatest pain and lameness compared to the other groups seven days after the implantation. Microscopically, at 45 and 90 days, the TH and FH groups showed filling with cartilaginous tissue containing chondrocytes surrounded by a dense matrix of glycosaminoglycans. In the CG group, healing occurred with vascularized fibrous connective tissue without integration to the subchondral bone. Cryopreserved heterologous chondrocytes were viable for implantation and healing of osteochondral lesions; the association with PRP allows the fixation of cells in the lesion and offers growth factors which accelerates repair with tissue similar to articular hyaline cartilage.(AU)

Cultivaram-se condrócitos obtidos da articulação do joelho de coelhos. Metade das células foi mantida em cultura para posterior implantação, e a outra metade foi congelada durante seis meses com a finalidade de avaliar a viabilidade. Criou-se um defeito circular osteocondral no joelho direito de outros vinte e sete coelhos. O grupo controle (GC) não recebeu tratamento. Os grupos descongelado (TH) e fresco (FH) receberam, respectivamente, implantes heterólogos de condrócitos cultivados descongelados e frescos, associados com PRP. O grupo GC apresentou maior dor e claudicação em comparação com os outros grupos aos sete dias após o implante. Microscopicamente, aos 45 e 90 dias, os grupos TH e FH mostraram preenchimento da falha com tecido cartilaginoso contendo condrócitos circundados por uma matriz densa de glicosaminoglicanos. Nesse período, no grupo CG, a cura ocorreu com tecido conjuntivo fibroso vascularizado e sem integração com o osso subcondral. Condrócitos heterólogos criopreservados foram viáveis para implantação e tratamento de lesões osteocondrais; a associação com o PRP permitiu a fixação de células na lesão e ofereceu fatores de crescimento que aceleraram a reparação com o tecido semelhante à cartilagem hialina articular.(AU)

Isolamento, expansão e caracterização de células-tronco do tecido adiposo de equinos / Isolation, expansion, and characterization of equine adipose-derived stem cells

Devido aos excelentes resultados obtidos em pesquisas com células-tronco e suas aplicabilidades promissoras, a terapia com estas células encontra-se em momento de máxima ascensão, estimulando assim, inúmeras pesquisas. A fim de padronizar o cultivo e avaliar a viabilidade de células-tronco mesenquimais do tecido adiposo de equinos visando a terapia celular nesta espécie, conduziu-se um estudo de isolamento, cultivo e caracterização de tais células. Para tal, foi realizada coleta de tecido adiposo de cinco equinos sem raça definida, com aproximadamente cinco anos. Em seguida, o tecido foi refrigerado e transportado ao laboratório, onde foi realizado o protocolo de cultivo celular durante aproximadamente 14 dias. Após o término deste procedimento, uma alíquota de células foi encaminhada para a realização do teste de quantificação e viabilidade celular com Azul de Tripan 1%, sendo outra porção destinada à confirmação da linhagem de célula tronco mesenquimal por meio de imunofenotipagem com os anticorpos monoclonais anti-CD11b, anti-CD45, anti-CD90 e anti-CD105, e de diferenciação celular em linhagem condrogênica, adipogênica e osteogênica. Houve diferenciação celular e marcação positiva dos antígenos de superfície CD44 e MHCI e negativa dos CD45 e CD11b, confirmando-se a origem mesenquimal e não hematopoiética. A viabilidade celular média obtida das células-tronco mesenquimais foi de 92,83% considerada satisfatória. Portanto, a utilização deste protocolo para obtenção de células-tronco mesenquimais do tecido adiposo se mostrou uma opção confiável e viável para utilização na terapia celular em equinos.

Due to the excellent results of stem cell research and its promising applicability, the therapy with these cells is undergoing a period of maximum visibility and numerous studies. In order to standardize the culture and to evaluate the viability of mesenchymal stem cells from adipose tissue of horses, aiming at cell therapy in this species, a study of isolation, expansion and characterization was conducted. For this, adipose tissue was collected from five crossbred horses aged approximately five years old. Subsequently, the tissue was immediately refrigerated and transported to the laboratory where the isolation and culture protocol, lasting approximately 14 days, was performed. After the end of this procedure, a cell pellet was obtained and resuspended in PBS. A portion of material obtained by centrifugation was collected and the cells were stained with 1% Trypan Blue for quantification and assessment of cell viability. Another sample was collected to confirm the lineage of stem cells by flow cytometry using monoclonal against the surface markers CD11b, CD45, CD90 and CD105; and by cellular differentiation assays to chondrogenic, adipogenic and osteogenic lineages. The isolated cells differentiated in the three lineages and showed positive staining for CD90 and CD105 and negative staining for CD11b and CD45, confirming the isolation of stem cells of mesenchymal origin. The average cell viability obtained was 92.83% and thus satisfactory. Therefore, the use of this protocol to obtain mesenchymal stem cells from adipose tissue was deemed to be a promising option for cell therapy in horses.

ISOLATION, EXPANSION AND CHARACTERIZATION OF EQUINE ADIPOSE TISSUE DERIVED STEM CELLS / Isolamento, expansão e caracterização de células-tronco do tecido adiposo de equinos

Devido aos excelentes resultados obtidos em pesquisas com células-tronco e suas aplicabilidades promissoras, a terapia com estas células encontra-se em momento de máxima ascensão, estimulando assim, inúmeras pesquisas. A fim de padronizar o cultivo e avaliar a viabilidade de células-tronco mesenquimais do tecido adiposo de equinos visando a terapia celular nesta espécie, conduziu-se um estudo de isolamento, cultivo e caracterização de tais células. Para tal, foi realizada coleta de tecido adiposo de cinco equinos sem raça definida, com aproximadamente cinco anos. Em seguida, o tecido foi refrigerado e transportado ao laboratório, onde foi realizado o protocolo de cultivo celular durante aproximadamente 14 dias. Após o término deste procedimento,  uma alíquota de células foi encaminhada para a realização do teste de quantificação e viabilidade celular com Azul de Tripan 1%,  sendo outra porção  destinada à confirmação da linhagem de célula tronco mesenquimal  por meio de imunofenotipagem com os anticorpos monoclonais anti-CD11b, anti-CD45, anti-CD90 e anti-CD105,

Isolamento, expansão e caracterização de células-tronco do tecido adiposo de equinos / Isolation, expansion, and characterization of equine adipose-derived stem cells

Devido aos excelentes resultados obtidos em pesquisas com células-tronco e suas aplicabilidades promissoras, a terapia com estas células encontra-se em momento de máxima ascensão, estimulando assim, inúmeras pesquisas. A fim de padronizar o cultivo e avaliar a viabilidade de células-tronco mesenquimais do tecido adiposo de equinos visando a terapia celular nesta espécie, conduziu-se um estudo de isolamento, cultivo e caracterização de tais células. Para tal, foi realizada coleta de tecido adiposo de cinco equinos sem raça definida, com aproximadamente cinco anos. Em seguida, o tecido foi refrigerado e transportado ao laboratório, onde foi realizado o protocolo de cultivo celular durante aproximadamente 14 dias. Após o término deste procedimento, uma alíquota de células foi encaminhada para a realização do teste de quantificação e viabilidade celular com Azul de Tripan 1%, sendo outra porção destinada à confirmação da linhagem de célula tronco mesenquimal por meio de imunofenotipagem com os anticorpos monoclonais anti-CD11b, anti-CD45, anti-CD90 e anti-CD105, e de diferenciação celular em linhagem condrogênica, adipogênica e osteogênica. Houve diferenciação celular e marcação positiva dos antígenos de superfície CD44 e MHCI e negativa dos CD45 e CD11b, confirmando-se a origem mesenquimal e não hematopoiética. A viabilidade celular média obtida das células-tronco mesenquimais foi de 92,83% considerada satisfatória. Portanto, a utilização deste protocolo para obtenção de células-tronco mesenquimais do tecido adiposo se mostrou uma opção confiável e viável para utilização na terapia celular em equinos.(AU)

Due to the excellent results of stem cell research and its promising applicability, the therapy with these cells is undergoing a period of maximum visibility and numerous studies. In order to standardize the culture and to evaluate the viability of mesenchymal stem cells from adipose tissue of horses, aiming at cell therapy in this species, a study of isolation, expansion and characterization was conducted. For this, adipose tissue was collected from five crossbred horses aged approximately five years old. Subsequently, the tissue was immediately refrigerated and transported to the laboratory where the isolation and culture protocol, lasting approximately 14 days, was performed. After the end of this procedure, a cell pellet was obtained and resuspended in PBS. A portion of material obtained by centrifugation was collected and the cells were stained with 1% Trypan Blue for quantification and assessment of cell viability. Another sample was collected to confirm the lineage of stem cells by flow cytometry using monoclonal against the surface markers CD11b, CD45, CD90 and CD105; and by cellular differentiation assays to chondrogenic, adipogenic and osteogenic lineages. The isolated cells differentiated in the three lineages and showed positive staining for CD90 and CD105 and negative staining for CD11b and CD45, confirming the isolation of stem cells of mesenchymal origin. The average cell viability obtained was 92.83% and thus satisfactory. Therefore, the use of this protocol to obtain mesenchymal stem cells from adipose tissue was deemed to be a promising option for cell therapy in horses.(AU)

Effect of freezing on rabbit cultured chondrocytes / Efeitos do congelamento sobre condrócitos cultivados de coelhos

This work evaluated the effect of freezing on chondrocytes maintained in culture, aiming the establishment of a cell bank for future application as heterologous implant. Chondrocytes extracted from joint cartilage of nine healthy New Zealand White rabbits were cultivated and frozen with the cryoprotector 5 percent dimethylsulfoxide for six months. Phenotypic and scanning electron microscopy analyses were carried out to identify morphological and functional differences between fresh and thawed cells. After enzymatic digestion, a total of 4.8x10(5)cells per rabbit were obtained. Fresh chondrocytes showed a high mitotic rate and abundant matrix was present up to 60 days of culture. Loss of phenotypic stability was notable in the thawed chondrocytes, with a low labeling of proteoglycans and weak immunostaining of type II collagen. The present study showed important loss of chondrocyte viability under the freezing conditions. For future in vivo studies of heterologous implant, these results suggests that a high number of cells should be implanted in the host site in order to achieve an adequate number of viable cells. Furthermore, the chondrocytes should be implanted after two weeks of culture, when the highest viability rate is found.(AU)

Avaliaram-se os efeitos do congelamento sobre condrócitos mantidos em cultura, com o objetivo de se estabelecer um banco celular para futura aplicação como implante heterólogo. Condrócitos extraídos da cartilagem articular de nove coelhos saudáveis, da raça Nova Zelândia Branca, foram cultivados e submetidos ao congelamento, com o citoprotetor sulfóxido de dimetila a 5 por cento, por um período de seis meses. Análises fenotípicas e de microscopia eletrônica de varredura foram realizadas com o objetivo de identificar diferenças morfológicas e funcionais entre as células frescas e as descongeladas. Após a digestão enzimática, foram obtidas 4,8x10(5) células por coelho. Os condrócitos frescos apresentaram elevada taxa mitótica e abundante presença de matriz até os 60 dias de cultura. Nas culturas dos condrócitos descongelados, a perda de estabilidade fenotípica foi marcante, o que foi demonstrado pela baixa intensidade da coloração dos proteoglicanos e pela fraca imunomarcação do colágeno tipo II. Sob as condições de congelamento utilizadas, houve importante perda de viabilidade condrocítica. Para futuros estudos in vivo de implante heterólogo, estes resultados sugerem que o elevado número de células deve ser implantado no sítio hospedeiro, com o objetivo de se obter maior quantidade de células viáveis, e que os condrócitos deverão ser implantados com duas semanas de cultivo, período em que apresentam melhor taxa de viabilidade.(AU)

Osteointegração da hidroxiapatita sintética no processo alveolar da mandíbula de cães: aspectos clínicos e radiográficos / Osteointegration of synthetic hydroxyapatite in alveolar process of the jaw of dogs: clinical and radiographic aspects

Avaliou-se o efeito da hidroxiapatita sintética na regeneração do osso alveolar e o efeito no tecido vivo de cães. Em dois grupos de 14 cães adultos hígidos, pesando entre 10 e 15kg, foram criados defeitos de 6 x 5mm na superfície vestibular do processo alveolar mandibular direito até atingir a raiz do quarto pré-molar. Em um grupo (tratado), o defeito foi preenchido com hidroxiapatita sintética; o grupo sem tratamento foi usado como controle. Efetuaram-se avaliações clínicas diárias durante uma semana, avaliações radiográficas após a cirurgia e aos oito, 21, 42, 60, 90 e 120 dias do pós-operatório. Vinte e quatro cães apresentaram inflamação, sendo a recuperação no grupo tratado mais lenta. Todos os animais tiveram sangramento com a hidroxiapatita. No grupo-controle houve aumento crescente da radiopacidade dos defeitos, no entanto, aos 120 dias do pós-operatório, os defeitos ainda eram visíveis. No grupo tratado, inicialmente a radiopacidade foi maior que a do osso normal, com diminuição gradual até se tornar semelhante à do osso vizinho, 60 dias após a cirurgia. A hidroxiapatita T290800-1 acelerou o preenchimento do defeito provocado no processo alveolar e acarretou inflamação e hemorragia gengival, o que, no entanto, não contra-indicou o seu uso.(AU)

The effect of the synthetic hydroxyapatite on the regeneration of the alveolar bone of dogs and on the alive tissue were evaluated. In two groups of 14 adult healthy dogs, weighing from 10 to 15kg, some defects around 6 x 5mm were provoked on the vestibular surface of the right jaw alveolar process until reaching the root of the forth premolar. In one group, the defect was infilled with synthetic hydroxyapatite. The no treated group dogs were used as control. Clinical evaluations were daily performed over one week, as well as radiographic evaluations after surgery, and on 8, 21, 42, 60, 90 and 120 days after surgery. Twenty-four dogs showed inflammation and the recovery in the treated group was slower than in the control group. Bleeding at the presence of hydroxyapatite was observed in all the animals. The radiographic examination presented an increasing radiopacity in the control group; however, this defect was still visible on day 120 after operation. Initially, in the treated group, radiopacity was higher than that of the normal bone and a gradual decrease occurred until becoming similar to the adjacent bone on day 60 days after surgery. The hydroxyapatite T290800-1 accelerated the infilling of the defect provoked in the alveolar process and caused gingival inflammation and hemorrhage; however, this does not contraindicate its use.(AU)

Osteointegração da hidroxiapatita sintética no processo alveolar da mandíbula de cães: aspectos histológicos / Osteointegration of synthetic hydroxyapatite in alveolar process of mandible in dogs: histological aspects

Avaliou-se a hidroxiapatita sintética como substituto ósseo na regeneração do processo alveolar, utilizando-se 28 cães adultos hígidos, pesando entre 10 e 15kg, divididos em dois grupos. Foram criados defeitos de aproximadamente 6 x 5mm na superfície vestibular do processo alveolar até atingir a raiz do quarto pré-molar mandibular direito. Em um grupo, o defeito foi totalmente preenchido com hidroxiapatita sintética; o outro, sem tratamento, foi usado como controle. Aos 8, 15, 21, 42, 60, 90 e 120 dias, foram coletados fragmentos ósseos para a análise histológica sob microscopia óptica. Observou-se crescimento ósseo e vascular no interior dos poros de hidroxiapatita, intensa proliferação de osteoblastos e neovascularização na presença do implante. A biocompatibilidade da hidroxiapatita permitiu a sua integração com o processo alveolar por meio da formação direta de um osso lamelar. Ocorreu neoformação óssea à medida que a hidroxiapatita foi degradada.(AU)

The synthetic hydroxyapatite was evaluated as bone substitute in the regeneration of the alveolar process. Twenty-eight healthy adult dogs weighing from 10 to 15kg were divided into two groups. Defects around 6 x 5mm were provoked on the vestibular surface of the alveolar process until reaching the root of the fourth right mandibular premolar tooth. In one group the defect was totally infilled with synthetic hydroxyapatite, whereas the other untreated one was used as control. On days 8, 15, 21, 42, 60, 90 and 120, bone fragments were collected for the histological analysis under optical microscopy. The following results were observed: both bone and vascular growth inside the hydroxyapatite pores, intense osteoblast proliferations and neovascularization at the presence of the implant. The biocompatibility of the hydroxyapatite allowed its integration with the alveolar process by direct formation of a lamellar bone. The bone neoformation occurred as the hydroxyapatite was degraded.(AU)

Osteointegração da hidroxiapatita sintética no processo alveolar da mandíbula de cães. Aspectos clínicos e radiográficos

O artigo não apresenta resumo.

ISOLATION, EXPANSION AND CHARACTERIZATION OF EQUINE ADIPOSE TISSUE DERIVED STEM CELLS / Isolamento, expansão e caracterização de células-tronco do tecido adiposo de equinos.

Devido aos excelentes resultados obtidos em pesquisas com células-tronco e suas aplicabilidades promissoras, a terapia com estas células encontra-se em momento de máxima ascensão, estimulando assim, inúmeras pesquisas. A fim de padronizar o cultivo e avaliar a viabilidade de células-tronco mesenquimais do tecido adiposo de equinos visando a terapia celular nesta espécie, conduziu-se um estudo de isolamento, cultivo e caracterização de tais células. Para tal, foi realizada coleta de tecido adiposo de cinco equinos sem raça definida, com aproximadamente cinco anos. Em seguida, o tecido foi refrigerado e transportado ao laboratório, onde foi realizado o protocolo de cultivo celular durante aproximadamente 14 dias. Após o término deste procedimento,  uma alíquota de células foi encaminhada para a realização do teste de quantificação e viabilidade celular com Azul de Tripan 1%,  sendo outra porção  destinada à confirmação da linhagem de célula tronco mesenquimal  por meio de imunofenotipagem com os anticorpos monoclonais anti-CD11b, anti-CD45, anti-CD90 e anti-CD105,

Osteointegração da hidroxiapatita sintética no processo alveolar da mandíbula de cães. Aspectos clínicos e radiográficos

O artigo não apresenta resumo.